CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1-DEN pot

CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN NS1-DEN TÓM TẮT Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue SD/SXHD là một trong những bệnh nhiễm quan tr

CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA PHÁT HIỆN

KHÁNG NGUYÊN NS1-DEN

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) là một trong những bệnh nhiễm quan trọng nhất tại các nước thuộc vùng nhiệt đới, trong đó có Việt nam Bộ test kít phát hiện kháng nguyên NS1-DEN trong huyết thanh bệnh nhân mới đây đã xuất hiện giúp chẩn đoán bệnh trong giai đoạn cấp

Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện và xác định tỉ lệ kháng nguyên DEN ở bệnh nhân người lớn được chẩn đoán SD/SXHD trên lâm sàng

NS1-Phương pháp: Mô tả hồi cứu - thiết kế cắt ngang trên 66 mẫu huyết thanh của bệnh nhân người lớn được chẩn đoán SD/SXHD trên lâm sàng tại

BV Thống nhất TP HCM trong tháng 12/2006

Kết quả: Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN dương tính chung của lô nghiên cứu là 45,45% Tỉ lệ này ở nhóm bệnh nhân trẻ tuổi (16-40) cao hơn nhóm bệnh nhân lớn tuổi hơn (50,9% so với 18,18%, p<0,05)

Kết luận: Có thể dùng xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1-DEN

để chẩn đoán sớm SD/SXHD và có thể kết hợp với phản ứng MAC-ELISA

để xác định hoặc loại trừ chẩn đoán SD/SXHD ở các bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng không điển hình

SUMMARY

Background: Dengue Fever and Dengue Haemorrhagic Fever (DF/DHF) is one of the most important emerging infectious diseases in tropical developing countries, including Vietnam More recently, detection

in patients sera of circulating NS1-DEN antigen has been described as an alternative method for early diagnosis

Purpose: to detect and determine percentage of the NS1-DEN antigen

on adult patients are diagnosed DF/DHF by clinical

Method: A retrospective descriptive and cross-sectional study of 66 serum samples from patients at Thong nhat hospital in December 2006 ELISA was tested to detect the NS1-DEN antigen

Results: The positive NS1-DEN antigen is 45.45%, in general This percentage is higher in group under 40 year olds patients – 50.9%

Conclusion: Detection of NS1-DEN antigen can be used in early DF/DHF diagnosis and can be combined with MAC-ELISA to determine or eliminate DF/DHF diagnosis in case having atypic clinical symptoms

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khi nhân loại bước vào thế kỷ 21, bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) do virus Dengue gây nên vẫn là một trong những bệnh nhiễm quan trọng nhất tại các nước thuộc vùng nhiệt đới, trong đó có Việt nam Bệnh thường gặp ở trẻ em nhưng trong thời gian gần đây ngày càng nghi nhận được nhiều ca bệnh ở người lớn Có thể gặp ở đối tượng này những biểu hiện phức tạp, kết hợp với các bệnh lý khác gây khó khăn cho chẩn đoán và điều trị Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể IgM kháng virus dengue xuất hiện vào những năm đầu thập niên 90 của thế kỷ trước và tiếp theo là các bộ kít được thương mại hóa đã nâng cao hiệu quả chẩn đoán bệnh nhiễm virus dengue cấp tính Kháng thể IgM kháng virus dengue thường chỉ được phát hiện vào ngày thứ 4 – 7 sau khởi phát (sốt), hạn chế khả năng ứng dụng bộ kít trên lâm sàng vì bệnh nhân thường nhập viện vào

ngày thứ 2 - 4 sau sốt Để chẩn đoán chính xác bệnh mới nhiễm virus dengue cần kết hợp cả hai phương pháp phát hiện virus và phát hiện kháng thể IgM kháng virus dengue Việc phát hiện virus qua nuôi cấy tế bào, phát hiện nucleic acid bằng các kỹ thuật sinh học phân tử hoặc phát hiện kháng nguyên NS1 trong huyết thanh bệnh nhân chỉ được tiến hành trong những labo nghiên cứu(3,5,9,12) trong khi test kit phát hiện kháng thể IgM kháng virus dengue đã được lưu hành

Mới đây hãng Bio-Rad cung cấp bộ test kít phát hiện kháng nguyên NS1 của virus dengue (kháng nguyên NS1-DEN) trong huyết thanh bệnh nhân Bộ test kit này đã xuất hiện ở Việt nam, thông tin về việc sử dụng chưa được ghi nhận cho tới thời điểm chúng tôi tiến hành nghiên cứu (tháng 12/2006) Đề tài “Chẩn đoán sốt xuất huyết dengue bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên NS1-DEN” được tiến hành với mục đích:

- Phát hiện kháng nguyên NS1-DEN bằng phương pháp ELISA ở những bệnh nhân có chẩn đoán SD/SXHD trên lâm sàng

- Xác định tỉ lệ có kháng nguyên NS1 của virus dengue ở các đối tượng trên

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mô tả hồi cứu – thiết kế cắt ngang

Đối tượng nghiên cứu

66 mẫu huyết thanh của bệnh nhân người lớn được chẩn đoán SD/SXHD trên lâm sàng (dựa theo tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng của WHO), đã được chỉ định làm xét nghiệm MAC-ELISA chẩn đoán SD/SXHD trước đó

Địa điểm & thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện vào tháng 12/2006 tại Khoa Vi sinh – Bệnh viện Thống nhất TP HCM

Phương pháp nghiên cứu

- Kỹ thuật xét nghiệm: phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên NS1-DEN có trong huyết thanh bệnh nhân SD/SXHD Sử dụng bộ kit

“PLATELLA DENGUETM NS1 AG 72830” và máy đọc ELISA của hãng Bio-Rad

Nguyên lý kỹ thuật: đây là phản ứng ELISA kẹp chả trực tiếp Kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên NS1-DEN được gắn vào plate (phiến nhựa) Cho bệnh phẩm (huyết thanh hoặc huyết tương bệnh nhân) cùng với cộng hợp vào giếng Nếu trong bệnh phẩm có kháng nguyên NS1-DEN thì

sẽ có phức hợp miễn dịch kháng thể - kháng nguyên – kháng thể Phát hiện

phức hợp này bằng cơ chất tạo màu và đo ở bước sóng kép 450/620nm Tính kết quả dựa vào giá trị OD đo được Độ nhạy của phương pháp được ghi nhận từ 87,1% - 100% tùy thuộc typ virus dengue bị nhiễm, độ đặc hiệu là 99,4 - 100%(1,7,8,10,11)

- Thu thập dữ liệu nghiên cứu từ kết quả thực nghiệm và theo mẫu phiếu xét nghiệm cận lâm sàng của từng bệnh nhân

- Xử lý dữ liệu bằng các phương pháp Thống kê Y học

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Về đặc tính mẫu (bảng 1)

Trong thời gian nghiên cứu, có 66 bệnh nhân được xét nghiệm huyết thanh tìm kháng nguyên NS1-DEN, gồm 31 bệnh nhân nam (46,97%) và 35 bệnh nhân nữ (53,03%) Độ tuổi của các bệnh nhân trong lô nghiên cứu phân

bố từ 16 đến 90 tuổi, được chia thành 2 nhóm: nhóm bệnh nhân dưới 40 tuổi

và nhóm bệnh nhân có lứa tuổi từ 40 trở lên Nhóm tuổi dưới 40 chiếm tỉ lệ

ưu thế (83,33%) so với nhóm tuổi từ 40 trở lên (16,67%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Bảng 1 Đặc tính mẫu nghiên cứu (n = 66)

Đặc tính mẫu

Tần số

Tỉ lệ % Giới

tỉ lệ %

66

30

45,45

Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN theo thời gian khởi phát (bảng 3)

Bảng 3 Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN theo thời gian khởi phát (n=66)

N2 – N4

10

5

50,00 N5 – N8

27

12

44,44 N11

Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN theo lứa tuổi (bảng 4)

Bảng 4 Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN theo lứa tuổi (n=66) Lứa tuổi

Tổng số ca

10

100,0 N5 – N8

6

22,22

27

100,0 N11

0

0

66

100,0

BÀN LUẬN

Về giới và tuổi trong lô nghiên cứu (Bảng 1)

Số bệnh nhân nữ có tỉ lệ cao so với nam (53,03% so với 46,97%), sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tỉ lệ này không khác với số liệu của các nghiên cứu khác trong và ngoài nước(4,5,6,12,13,14,15)

Cũng theo các nghiên cứu này, người lớn không phải là đối tượng chính mắc bệnh SD/SXHD vì chỉ chiếm tỉ lệ khoảng 10% số bệnh nhân nhập viện do SD/SXHD Trong những năm gần đây, SD/SXHD người lớn đã gia tăng đáng kể tại miền Nam Việt nam, từ 14% tổng số bệnh nhân SXH nhập viện năm 1991 đến 36% năm 2001(5,6,12) Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ghi nhận những ca nghi SD/SXHD ở người lớn, có lứa tuổi phân bố từ 16 đến 90 Tuy là nhóm bệnh nhân người lớn nhưng chủ yếu vẫn là nhóm tuổi trẻ - dưới 40 tuổi (83,33%) Nhóm tuổi còn lại – từ 40 tuổi trở lên – chỉ chiếm tỉ lệ rất thấp (16,67%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05)

Phát hiện kháng nguyên NS1-DEN trong huyết thanh bệnh nhân

Trong 66 mẫu huyết thanh thuộc lô nghiên cứu có 30 mẫu cho kết quả dương tính với kháng nguyên NS1-DEN, chiếm tỉ lệ 45,45% (bảng 2), giúp chẩn đoán xác định bệnh SD/SXHD Tỉ lệ này thấp hơn tỉ lệ kháng thể IgM hiện diện trong huyết thanh bệnh nhân trong một nghiên cứu mới đây của chúng tôi trên cùng một lô bệnh nhân(4) (45,45% so với 62,38%) Nếu phân tích theo thời gian khởi phát (bảng 3), chúng tôi ghi nhận được tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN dương tính ở các nhóm bệnh nhân sốt từ ngày thứ 2 đến thứ 4 (N2-N4), N5-N8 hoặc không ghi nhận được thời gian lần lượt là 50,00%; 44,44% và 46,42% Nhóm bệnh nhân N2-N4 có khuynh hướng cho

tỉ lệ phát hiện kháng nguyên NS1-DEN cao hơn các nhóm khác nhưng sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05)

Như chúng ta đã biết, thách thức lớn nhất để xử trí bệnh nhiễm cấp là phát hiện nhanh và đặc hiệu virus dengue trong giai đoạn cấp để điều trị bệnh nhân kịp thời Phương pháp phân lập và định danh virus hoặc phát hiện nucleic acid của virus cho phép chẩn đoán sớm trong giai đoạn sốt, nhưng cả hai phương pháp này đều cần những labo chuyên ngành (specialized laboratories) và không cho kết quả ngay lập tức Phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus dengue đã được dùng cho chẩn đoán thường qui Vấn đề là ở chỗ kháng thể chỉ xuất hiện sau khi có triệu chứng, thường từ ngày thứ tư

của virus dengue trong máu mới xuất hiện gần đây được coi như phương pháp chẩn đoán sớm bệnh SD/SXHD Kháng nguyên NS1-DEN hiện diện trong tuần hoàn từ ngày thứ nhất đến ngày thứ chín sau sốt(1,3,7,8,10,11,12)

Về tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN theo lứa tuổi (bảng 4)

Phân tích tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN xuất hiện theo lứa tuổi bệnh nhân chúng ta nhận thấy: ở nhóm tuổi trẻ, dưới 40 tuổi, có 28 trong số 55 ca được chỉ định làm xét nghiệm cho kết quả dương tính với kháng nguyên NS1-DEN, chiếm tỉ lệ 50,9%, cao hơn hẳn tỉ lệ này ở nhóm tuổi từ 40 trở lên (18,18%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kết quả ghi nhận được chứng tỏ: ở nhóm tuổi càng trẻ, chẩn đoán lâm sàng “sốt xuất huyết” càng phù hợp với kết quả phát hiện kháng nguyên NS1-DEN do tỉ lệ dương tính càng cao

So sánh với kết quả MAC-ELISA

Đã được tiến hành trước đó (bảng 5) chúng tôi ghi nhận được:

- Có 23 ca (34,85%) cho kết quả dương tính với cả hai phương pháp, nghĩa là phát hiện được cả kháng nguyên NS1-DEN và kháng thể IgM của virus dengue Đây là những ca được chẩn đoán chính xác là SD/SXHD vì kháng nguyên NS1-DEN xuất hiện từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 9 sau sốt,

kháng thể IgM của virus dengue bắt đầu xuất hiện vào ngày thứ 4 với tỉ lệ 30-40%, ngày thứ 5 (75%) và có thể phát hiện được ở 100% bệnh nhân bị SD/SXHD vào ngày thứ 10 sau sốt(3,4,5,9,12)

- Với 7 ca (10,61%) phát hiện được kháng nguyên NS1-DEN nhưng không có kháng thể IgM của virus dengue, chúng ta vẫn khẳng định đây là những bệnh nhân mắc SD/SXHD Ơ nhóm này, kháng thể IgM chưa kịp xuất hiện trong khi kháng nguyên đang hiện diện trong huyết thanh bệnh nhân

- Với 16 ca (24,24%) không phát hiện được cả kháng nguyên DEN và kháng thể IgM của virus dengue, chúng ta cũng có thể xác định được rằng các bệnh nhân này không mắc bệnh SD/SXHD Kết quả xét nghiệm âm tính cả kháng nguyên và kháng thể IgM của virus dengue cho phép chúng ta loại trừ chẩn đoán SD/SXHD ở bệnh nhân người lớn có những biểu hiện phức tạp và chỉ mắc các bệnh lý khác như nhiễm khuẩn huyết, sốt thương hàn, sốt do nhiễm siêu vi khác,

NS1 Có 20 ca (30,3%) không phát hiện được kháng nguyên NS1NS1 DEN nhưng lại phát hiện được kháng thể IgM của virus dengue

Có thể lý giải như sau:

Bệnh nhân thực sự không mắc bệnh SD/SXHD nên không phát hiện được kháng nguyên NS1-DEN Kháng thể IgM của virus dengue hiện diện

có thể là do bệnh nhân bị SD/SXHD trước đó ít lâu vì kháng thể IgM của virus dengue có thể tồn tại trong máu 90 ngày sau sốt

Bệnh nhân mắc bệnh SD/SXHD nên phát hiện được kháng thể igm của virus dengue Không phát hiện được kháng nguyên NS1-DEN do kháng nguyên đã biến mất dần dù vẫn còn có thể phát hiện được vào ngày thứ 9 sau sốt Một nghiên cứu trên 177 bệnh nhân(8) cho thấy: khả năng phát hiện kháng nguyên NS1-DEN khi bệnh nhân bắt đầu sốt (N0) là 100%, sau sốt 1 – 4 ngày (N1 – N4): tỉ lệ này dao động trong khoảng 88 – 96%, nhưng đến ngày thứ năm (N5) tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN giảm hẳn: chỉ còn 53%, ngày thứ sáu (N6) là 36% và đến ngày thứ mười (N10) sau sốt sẽ không còn phát hiện được kháng nguyên NS1-DEN (0%) Như vậy, có sự biến đổi kháng nguyên NS1-DEN theo thời gian: tỉ lệ phát hiện cao vào những ngày đầu sau sốt, giảm dần và biến mất hẳn sau ngày thứ 9 (N9), tương tự như kết quả của phương pháp phát hiện virus (nuôi cấy) và phát hiện bộ gen virus dengue (RT-PCT) Con số 37% cho kết quả kháng nguyên NS1-DEN âm tính nhưng lại phát hiện được kháng thể igm của virus dengue trong nhóm huyết thanh được khảo sát vào ngày N5-N8 sau sốt so với 10% của nhóm

huyết thanh lấy vào ngày N3-N4 góp phần minh chứng nhận định trên Cần khảo sát trên số lượng mẫu lớn hơn để chứng minh điều này

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu này, chúng tôi rút ra được những kết luận sau:

1 Không có sự khác biệt về tỉ lệ nam / nữ trong lô nghiên cứu (45,54% / 54,45%; p>0,05) Số bệnh nhân tập trung chủ yếu ở nhóm tuổi trẻ (16-40 tuổi): 83,33%

2 Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN chung là 45,45% Sự khác biệt chưa

có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm được phân chia theo thời gian khởi phát (p>0,05)

3 Tỉ lệ kháng nguyên NS1-DEN cao hơn hẳn ở nhóm bệnh nhân trẻ tuổi (16-40) so với nhóm tuổi lớn hơn (50,9% so với 18,18%, p<0,05)

Đề xuất

Có thể dùng xét nghiệm phát hiện kháng nguyên NS1-DEN để chẩn đoán sớm các ca SD/SXHD trên lâm sàng hoặc kết hợp với xét nghiệm MAC-ELISA để chẩn đoán xác định hoặc loại trừ SD/SXHD ở các bệnh nhân lớn tuổi và có triệu chứng lâm sàng không điển hình Cần tiến hành trên lượng mẫu lớn hơn ở những nghiên cứu tiếp theo để đánh giá chính xác

độ nhạy của phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên NS1-DEN theo diễn tiến thời gian