TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP RTPCR TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA TẠI BỆNH VIỆN 175

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO  TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\       KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP   TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP RT-PCR TRONG CHẨN ĐỐN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA TẠI BỆNH VIỆN 175                Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: DOANH THỊ NGA Niên khóa: 2007 – 2011 Tháng 07/2011         BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC [\     KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA TẠI BỆNH VIỆN 175 Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS.BS VŨ BẢO CHÂU DOANH THỊ NGA CN CHU THỊ THU HÀ   Tháng 07/2011     LỜI CẢM ƠN ™ Với tất lòng kính trọng u thương, xin tri ân công ơn sinh thành, dưỡng dục ba mẹ - Người cho ngày hôm ™ Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, tồn thể Q thầy tận tâm tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức suốt trình học tập trường thực khóa luận ™ Tơi xin cảm ơn TS.BS Vũ Bảo Châu CN Chu Thị Thu Hà hết lòng hướng dẫn, động viên tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp ™ Xin cảm ơn anh chị, cô cán khoa Vi sinh vật – bệnh viện 175 bạn thực tập tạo điều kiện, giúp đỡ thời gian thực tập bệnh viện ™ Xin cảm ơn người bạn quan tâm, giúp đỡ, động viên, chia sẻ buồn vui tơi suốt q trình học tập thực khóa luận TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực Doanh Thị Nga i    TÓM TẮT Sốt xuất huyết bệnh truyền nhiễm cấp tính, vi rút Dengue gây ra, trung gian truyền bệnh chủ yếu muỗi Aedes aegypti Dengue vi rút RNA sợi đơn gồm bốn týp huyết khác (DEN-1 đến DEN-4) Các týp vi rút Dengue có mối liên quan chặt chẽ thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae Trên giới, sốt xuất huyết gặp nhiều vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, chủ yếu khu vực thành thị ngoại ô SXHD, biến chứng nguy hiểm tiềm tàng, lần ghi nhận năm 1950 Philippines Thái Lan Hiện nay, SXHD lan đến hầu châu Á trở thành lý nhập viện hàng đầu tử vong trẻ em khu vực Tỷ lệ mắc bệnh sốt xuất huyết tăng đáng kể toàn giới thập kỷ gần Khoảng 2,5 tỉ người (2/5 dân số giới) có nguy bị sốt xuất huyết Tuy nhiên, vấn đề chẩn đoán sốt xuất huyết thời kỳ đầu bệnh khó, lâm sàng chưa rõ ràng, đòi hỏi cận lâm sàng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán nhanh, nhạy đặc hiệu SXHD, định týp vi rút Dengue Vì đề tài nghiên cứu “Tìm hiểu phương pháp RT-PCR chẩn đốn sốt xuất huyết vi rút Dengue gây bệnh viện 175” tiến hành để tìm hiểu tình hình bệnh sốt xuất huyết bệnh nhân Bệnh viện 175 Phương pháp nghiên cứu: Đây nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định vi rút Dengue huyết bệnh nhân, phát sớm xác định týp vi rút Dengue Kết nghiên cứu: Kỹ thuật RT-PCR xác định 35% trường hợp dương tính với vi rút Dengue RT-PCR định rõ týp vi rút DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 bệnh viện 175 RT-PCR có giá trị phát nhanh xác vi rút Dengue chẩn đốn sốt xuất huyết ii    SUMMARY The title of thesis: “Reaching RT-PCR method in the diagnose of Dengue hemorrhagic fever causing from Dengue virus at Hospital 175” Dengue fever is an acute infectious disease, caused by Dengue virus, secondary infections primarily Aedes aegypti, Dengue is a small single-stranded RNA virus comprising four distinct serotypes (DEN-1 to DEN-4) These closely related serotypes of the Dengue virus belong to the genus Flavivirus, family Flaviviridae In the world, Dengue is occur more frequently in tropical and sub-tropical regions, predominantly in urban and semi-urban areas Dengue haemorrhagic fever, a potentially lethal complication, was first recognized in the 1950s during dengue epidemics in the Philippines and Thailand Today DHF affects most Asian countries and has become a leading cause of hospitalization and death among children in the region The incidence of Dengue has grown dramatically around the world in recent decades Some 2.5 billion people (two fifths of the world's population) - are now at risk from Dengue However, The diagnosis of Dengue fever during early days is dificulty, clinical symtoms are not clear, it is required doing some specicial tests to confirm virus Dengue, as RT-PCR test are necessary So reseach “Reaching RT-PCR method in the diagnose of Dengue hemorrhagic fever causing from Dengue virus at Hospital 175” was conducted to understand the situation of Dengue in patients at Hospital 175 Method: This study is applied RT-PCR technic to identify virus Dengue in serum of the cases Dengue hemorrhagic feverof patient, to identify Dengue virus and determine Dengue type Rresult: RT-PCR technic is identified 35% of cases positive Dengue virus RTPCR can identify Dengue type I, type II, type III and type IV at Hospital 175 RT-PCR is a value quickly and accurately detect Dengue virus in the diagnosis of hemorrhagic fever Dengue iii    MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu bệnh sốt xuất huyết 2.1.1 Biểu lâm sàng 2.1.1.1 Sốt Dengue (Dengue cổ điển) 2.1.1.2 Sốt xuất huyết huyết Dengue .4 2.1.3 Đường truyền lây 2.1.4 Miễn dịch 2.1.5 Điều trị phòng ngừa bệnh sốt xuất huyết 2.2 Tình hình bệnh sốt xuất giới 2.3 Tình hình bệnh sốt xuất huyết Việt Nam .11 2.4 Vi rút Dengue 12 2.4.1 Tính chất vi rút Dengue 12 2.4.2 Cơ chế xâm nhiễm nhân lên vi rút Dengue .14 2.4.3 Sức chống chịu chế sinh bệnh học miễn dịch vi rút Dengue .15 2.5 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết 16 2.5.1 Nuôi cấy vi rút 16 2.5.2 Huyết học 17 2.5.2.1 Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) 17 iv    2.5.2.2 Phản ứng hấp phụ miễn dịch gắn men (Enzyme-linked Immuno Sorbent Asay - MAC ELISA) 17 2.5.3 Phương pháp real time PCR 18 2.6 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 18 2.6.1.2 Thành phần phản ứng PCR 18 2.6.1.3 Các giai đoạn phản ứng PCR 19 2.6.2 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu phương pháp 22 3.2.1 Đối tượng số lượng mẫu 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu hóa chất sử dụng .22 3.4.1 Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng RT-PCR 22 3.4.2 Kít hóa chất ly trích gen - RNA .23 3.4.2.1 Hóa chất để trích biệt RNA từ bệnh phẩm 23 3.4.2.2 Hóa chất để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nghiên 23 3.4.2.3 Hóa chất để chạy PCR .23 3.4.2.4 Hóa chất để điện di 24 3.5 Phương pháp tiến hành 24 3.5.1 Thu thập bảo quản mẫu 24 3.5.2 Thực ly trích gen – RNA 24 3.5.3 Thực phản ứng RT-PCR với mẫu ly trích 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết thảo luận 27 4.1.1 Kết nghiên cứu RT-PCR 27 4.1.3 Kết RT-PCR định týp vi rút Dengue 29 4.1.2 Khảo sát tình hình mắc bệnh SXHD theo nhóm tuổi giới tính 30 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị .31 TÀI LIỆU THAM KHẢO .32 v    DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMV : Avian myeloblastosis virus Bp : Base pairs cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid DEPC : Diethylpyrocarbonate DEN : Dengue DF : Dengue fever DHF : Dengue hemorrhagic fever dNTP : Deoxynucleotide triphosphate dUTP : Deoxyuracil triphosphate EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay IL : Interleukin α-IFN : Interferon alpha γ-IFN : Interferon gamma Ig : Immunoglobulin kDa : Kilodalton LLC-MK : Lipid metabolism of Monkey kidney mNS : Membrane non-structure NS : Non-structure PCR : Polymerase Chain Reaction RANTES : Regrulated upon activation normal T cell expressed and secreted RNAse : Ribonuclease RT-PCR : Reverse trancription – Polymerase Chain Reaction SXHD : Sốt xuất huyết Dengue sNS1 : Secreted non-structure Tag : Thermus aquaticus TBE : Tris – Borate – EDTA UNG : Uracil – DNA glycosilase UV WHO : Ultra violet : World Health Organization vi    DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang  Bảng 3.1 Thành phần kít trích biệt RNA tồn phần từ bệnh phẩm .23  Bảng 3.2 Thành phần kít cDNAsynthesis 23  Bảng 3.3 Thành phần kít dùng để điện di 24  Bảng 4.1 Đánh giá khả phát bệnh SXHD RT-PCR Mac-ELISA .28  Bảng 4.2 Kết RT-PCR định týp vi rút Dengue 29    vii    DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1 Các biểu lâm sàng vi rút Dengue gây Hình 2.1 Dịch sốt Dengue toàn giới năm 2006 Hình 2.2 Cơ chế lây truyền sốt Dengue Hình 2.3 Đáp ứng miễn dịch bệnh nhân mắc Dengue Biểu đồ 2.1 Số lượng ca mắc SD/SXHD hàng năm .9 Hình 2.4 Cấu trúc vi rút Dengue 13 Hình 2.5 Quá trình xâm nhiễm Flavivirus .14 Hình 2.6 Các giai đoạn phản ứng PCR 19 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu xét nghiệm PCR Dengue dương tính 27 Hình 4.1 Kết điện di PCR Dengue 29 viii    2.6.1.3 Các giai đoạn phản ứng PCR Hình 2.6 Các giai đoạn phản ứng PCR (Nguồn:http://i479.photobucket.com/rr159/freeman456/nguyentacPCR.gif) 2.6.2 RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) Là phương pháp PCR mà nucleic acid cần phải phát RNA để thực PCR trước hết RNA đích phải phiên mã ngược (RT, Reverse transcription) thành cDNA, sau dùng PCR để khuếch đại trình tự đích cDNA cặp mồi đặc hiệu cho trình tự Vì phải thực hai giai đoạn RT đến PCR, nên kỹ thuật gọi kỹ thuật RT-PCR Giai đoạn phiên mã ngược (RT) giai đoạn quan trọng định thành công RT-PCR Enzyme sử dụng giai đoạn reverse trancriptase tách chiết từ Moloney murine leukemia vi rút (M-MLv) gây bệnh ung thư bạch cầu chuột, hay từ avian myeloblastosis vi rút (AMV) gây bệnh ung thư tủy gia cầm Enzyme reverse transcriptase loại DNA polymerase không chịu nhiệt, sử dụng mạch RNA đơn làm sợi khuôn để tổng hợp nên sợi DNA bổ sung (cDNA, complementary DNA), giai đoạn RT gọi giai đoạn tổng hợp cDNA Để enzyme reverse transcriptase tổng hợp cDNA từ sợi khuôn mạch đơn RNA, cần phải có mồi đặc hiệu bám sợi khuôn RNA cần dNTP để enzyme reverse transcriptase trượt lên mạch khn RNA kéo dài mạch cDNA Mồi sử dụng giai đoạn RT mồi đặc hiệu cho trình tự RNA phiên mã ngược thành cDNA, mồi mồi xi hay mồi ngược 19   giai đoạn PCR tùy chiều 5’ đến 3’ RNA đích bắt cặp mồi Nhà nghiên cứu sử dụng loại mồi có nucleotide có thứ tự ngẫu nhiên gọi mồi ngẫu nhiên (random hexamer) để phiên mã ngược tồn RNA có mẫu thành cDNA Tuy nhiên mồi ngẫu nhiên có hiệu để phiên mã ngược đoạn cDNA dài 600 bases, muốn có đoạn cDNA dài 600 bases phải dùng mồi đặc hiệu hiệu Ngoài mồi đặc hiệu mồi ngẫu nhiên, muốn có cDNA mRNA biểu từ gen, nhà nghiên cứu dùng mồi Oligo(dT)15 (gọi mồi poly T) mRNA ln có poly(A)+ Mồi Oligo(dT)15 thường dùng để làm thư viện cDNA biểu gen dùng để phát vi khuẩn sống bệnh phẩm Đối tượng RT RNA đích Bản chất RNA dễ bị phân hủy môi trường bị enzyme RNAse tiết từ vi sinh vật môi trường, chai lọ, thiết bị, dụng cụ dung dịch Enzyme RNAse lại bền, khó hủy nhiệt độ Do thao tác pha chế thuốc thử để pha phản ứng RT phải tuyệt đối tôn trọng nguyên tắc vô trùng thực với dụng cụ, thiết bị, thuốc thử… tinh Để pha dung dịch RT Có hai phương pháp thực RT-PCR Đó phương pháp RT-PCR hai bước, phương pháp RT-PCR bước Trong phương pháp RT-PCR hai bước, người làm thí nghiệm thực giai đoạn RT để tổng hợp cDNA ống nghiệm, sau lấy sản phẩm cDNA cho vào ống nghiệm PCR chứa PCR mix với mồi đặc hiệu để chạy giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phương pháp có nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại phải mở nắp tube PCR sản phẩm cDNA giai đoạn RT vào Tuy nhiên ngày nguy hồn tồn bị loại bỏ nhờ việc cho dUTP UNG vào PCR mix giai đoạn PCR Trong phương pháp RT-PCR bước, người làm thí nghiệm thực hai giai đoạn RT giai đoạn PCR ống phản ứng, nghĩa sau cho tách chiết RNA từ mẫu thử vào ống phản ứng, giai đoạn RT thực trước sau giai đoạn PCR liền theo sau Để thực RT-PCR bước, ống phản ứng phải có đủ thành phần hóa chất thuốc thử để chạy RT PCR, tức phải có enzyme reverse transcriptase sử dụng cho RT enzyme Taq polymerase sử dụng cho PCR Ngồi có loại DNA polymerase tách chiết 20   từ vi khuẩn chịu nhiệt Themus thermophilus, đặt tên TthPol, có hai khả năng: thực phiên mã ngược có diện Mn++ khả nhân DNA có diện Mg++, dùng enzyme làm RT-PCR bước Trong phương pháp RT-PCR bước, toàn sản phẩm cDNA tham gia vào PCR khơng thiết phải có mồi riêng cho RT mồi PCR sử dụng làm mồi cho RT RT-PCR bước nhiều người thích RT-PCR hai bước tiện lợi tránh nguy ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại phải mở tube PCR sản phẩm cDNA vào Tuy nhiên RT-PCR bước, sử dụng phương pháp chống ngoại nhiễm cách cho dUTP enzyme UNG vào dung dịch phản ứng UNG (Uracil - DNA glycosilase) cắt bỏ tồn cDNA tổng hợp giai đoạn RT Nguyên tắc chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại: PCR mix có thêm thành phần dUTP enzyme UNG nhờ sản phẩm khuếch đại đánh dấu khác biệt với DNA đích, nhiều vị trí T trình tự chuỗi sản phẩm khuếch đại bị thay U enzyme polymerase nhầm lẫn T U thực khuếch đại Nhờ mà sản phẩm khuếch đại ngoại nhiễm vào PCR mix tham gia vào phản ứng khuếch đại bị enzyme UNG phá hủy UNG nhận diện cắt bỏ U nhờ trước chạy PCR ủ PCR mix 400C 10 phút nhiệt độ tối hảo enzyme UNG Sau thời gian ủ 400C/10 phút PCR mix vào chu kì nhiệt PCR, sản phẩm ngoại nhiễm không tham gia vào trình khuếch đại, đồng thời UNG bị bất hoạt giai đoạn nhiệt độ biến tính PCR Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích lại bị đánh dấu nhiều vị trí T bị thay U PCR mix ln có dUTP (Phạm Hùng Vân, 2009)                 21   Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Dự kiến thời gian nghiên cứu từ ngày 15/01/2011 đến ngày 1/07/2011 - Địa điểm nghiên cứu tại: khoa vi sinh - bệnh viện 175 3.2 Vật liệu phương pháp 3.2.1 Đối tượng số lượng mẫu - Đối tượng: bệnh nhân nội trú ngoại trú bệnh viện 175 chẩn đoán lâm sàng với dấu hiệu sốt xuất huyết Dengue - Mẫu: 80 mẫu huyết 3.3 Phương pháp nghiên cứu    - Thiết kế nghiên cứu : mô tả, cắt ngang - Thu thập số liệu : hồi cứu, tiến cứu - Sử dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định týp, phát sớm vi rút Dengue mẫu bệnh phẩm khảo sát tình hình bệnh sốt xuất huyết qua nghiên cứu liên quan bệnh phân bố theo giới tính, nhóm tuổi bệnh viện 175 3.4 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu hóa chất sử dụng 3.4.1 Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng RT-PCR - Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II, máy ly tâm - Tủ -70oC, -20oC , tủ lạnh - Máy vi sóng , máy chụp gel - Máy PCR - Máy Vortex - Bộ nguồn bồn điện di - Micropipet, đầu típ có filter lọc eppendorf - Máy đọc gel - Máy ủ sấy - Máy lắc 22   3.4.2 Kít hóa chất ly trích gen - RNA 3.4.2.1 Hóa chất để trích biệt RNA từ bệnh phẩm Bộ kit RNAPREP công ty Nam Khoa sản xuất cung cấp, gồm thành phần: Bảng 3.1 Thành phần kít trích biệt RNA tồn phần từ bệnh phẩm Tên thuốc thử Thành phần Điều kiện bảo quản R1 Guanidine, urea, phenol, chất tẩy 2-8 0C/tối R2 Chloroform 2-8 0C/tối R3 Isopropanol 2-8 0C/tối R4 Ethanol 75% v/v 2-8 0C/tối R5 Nước tinh xử lý DEPC 2-8 0C/tối 3.4.2.2 Hóa chất để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nghiên cDNAsynthesis kit công ty Nam Khoa nghiên cứu phát triển, thành phần gồm: Bảng 3.2 Thành phần kít cDNAsynthesis Tên thuốc thử Thành phần Điều kiện bảo quản Reverse transcriptase, RT+RTmix RNAsin, oligo (dT), random -18 đến -30 0C hexamer, enhancer 3.4.2.3 Hóa chất để chạy PCR RT-PCR master mix 2X công ty Nam Khoa chế tạo cung cấp gồm thành phần sau: - MgCl2 - Reverse Transcription Buffer - dNTP - Recombinant RNAsin Ribonuclease Inhibitor (RNAsin) - AMV Reverse Transcriptase - Mồi đặc hiệu - Thể tích nước khử ion   23   3.4.2.4 Hóa chất để điện di Sử dụng hóa chất dùng điện di thạch agarose công ty Nam Khoa sản xuất gồm thành phần sau: Bảng 3.3 Thành phần kít dùng để điện di Tên thuốc thử Thành phần Điều kiện bảo quản TBE 10X Tris HCl, boric acid, EDTA Na2 2-80/tối Agarose Agarose (MB grade) 2-80/tối Loading buffer Bromo phenol blue, glycerol, Tris HCl, EDTA Na2 2-80/tối Ethidium bromide Ehidium bromide 2-80/tối DNA ladder Thang DNA từ 100 đến 1000bps 40C 3.5 Phương pháp tiến hành 3.5.1 Thu thập bảo quản mẫu - Lấy khoảng 3ml huyết bảo quản tủ lạnh phòng xét nghiệm, cần đem sử dụng 3.5.2 Thực ly trích gen – RNA - Bước 1: hút 150µl huyết 450µl dung dịch R1RNAPREP cho vào eppendoff , ủ 300C 10 phút - Bước 2: thêm 120µl R2RNAPREP, lắc nhanh phút, để 300C 10 phút, ly tâm 13000v/15 phút - Bước 3: cẩn thận hút khoảng 300µl dịch sang eppendoff khác, cho vào 300µl R3RNAPREP, ủ 300C 10 phút, ly tâm 13000v/15 phút - Bước 4: bỏ phần dịch (tránh làm cặn RNA), rửa lại với 1000µl R4RNAPREP, ly tâm 8000v/5 phút - Bước 5: bỏ phần dịch nổi, mở nắp eppendoff sấy khô 550C 10-15 phút - Bước 6: cho vào 40µl dung dịch R5RNAPREP, ủ 550C 10 phút, thu sản phẩm RNA - Bước 7: hút 15µl RNA cho vào mix cDNA - Bước 8: tiến hành phản ứng PCR Dengue 24   + Hút 5µl cDNA vào mix PCR DHF (Dengue hemorrhagic fever), bỏ vào máy chạy DHF - Bước 9: chạy điện di gel agarose - Bước 10: đọc phân tích kết 3.5.3 Thực phản ứng RT-PCR với mẫu ly trích ¾ Điện di đọc kết ™ Nguyên tắc Trong thạch agarose pha nhúng chìm đệm TBE 0,5X, sản phẩm PCR DNA sợi đơi nhờ mang nhiều điện tích âm bị di chuyển phía cực dương di chuyển xa hay gần khởi điểm tùy thuộc vào kích thước sản phẩm PCR dài hay ngắn Sau điện di, DNA kích thước giống hệt tập trung lại thành vạch, gọi vạch DNA, nhìn thấy nhờ DNA sợi đôi bị nhuộm ethidium bromide thành vạch phát huỳnh quang ánh sáng cực tím hộp đèn UV Dựa vào vạch kích thước thang DNA mà kích thước sản phầm PCR tính hay ước lượng ™ Phương pháp tiến hành Pha dung dịch TBE 0,5X cách cho 50 ml TBE 10X vào chai chứa sẵn 950 ml nước cất, lắc Pha thạch agarose % cách trộn gr agarose cung cấp 200 ml TBE 0,5X (có thể pha thạch 1,5 % hay % tùy kích thước DNA) Đun tan thạch lò viba hay đun cách thủy ho đến tan hoàn tồn khơng lợn cợn, lúc đun lắc dung dịch agarose để đảm bảo tan hết Đừng để dung dịch agarose sơi trào ngồi Để thạch nguội nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, cho vào thạch µl ethidium bromide 10 mg/ml (hóa chất độc nên cẩn thận thao tác, mang găng tay, tránh hít vào mũi, tránh dính vào da), trộn hòa tan ethidium bromide vào thạch, tránh làm thạch có bọt khí trộn Chuẩn bị khn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, đổ thạch vào khuôn cho đạt bề dày mong muốn (khoảng - mm) Để thạch nguội đặc nhiệt độ phòng Khi thạch đặc, gỡ lược Đặt thạch vào máng điện di, đổ dung dịch TBE 0,5X cho ngập mặt thạch Chuẩn bị mẫu thử cách cho 12 µl đệm tải (Loading buffer) vào mẫu thử (50 µl), vortex nhẹ để trộn Dùng micropippet cho mẫu vào giếng theo thứ tự, chừa giếng thang DNA Chạy điện di 20 - 30 phút dòng điện 100 V 25   Sau chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách xa giếng khoảng - 2,5 cm) lấy khuôn khỏi máng đẩy gel lên hộp UV Xem vạch DNA tia sáng đèn UV So với thang DNA để biết kích thước sản phẩm PCR 26   Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN   4.1 Kết thảo luận 4.1.1 Kết nghiên cứu RT-PCR Theo thống kê bệnh viện 175 từ ngày 1/1/2010 đến ngày 1/7/2011 có 80 bệnh nhân tiến hành chẩn đốn phát vi rút Dengue kĩ thuật RT-PCR Kết phân tích mối liên quan bệnh theo phân bố giới tính, nhóm tuổi, xác định týp Dengue thống kê bảng biểu đồ đây: Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ mẫu xét nghiệm PCR Dengue dương tính Nhận xét kết quả: - Theo kết ngiên cứu thu được: + Trong 80 bệnh nhân thực xét nghiệm RT-PCR có 28 trường hợp dương tính chiếm tỷ lệ 35% 52 trường hợp âm tính chiếm tỷ lệ 65% Thảo luận: - Kết nghiên cứu thu có tỷ lệ dương tính thấp (35%) so với nghiên cứu số tác giả như: Phạm Hùng Lực - 2006 (80%), Đỗ Quang Hà (77%), Nguyễn Trung Lập (63%) Sở dĩ kết nghiên cứu có tỷ lệ dương tính thấp do: Đối tượng bệnh nhân thực nghiên cứu lấy mẫu xét nghiệm bệnh viện 175 tỷ lệ bệnh nhân thống kê chủ yếu người lớn từ 15 tuổi trở lên, ngược lại đối tượng nghiên cứu tác giả Phạm Hùng Lực lại tập trung vào số bệnh nhân 15 tuổi 27   Theo báo cáo tác giả khác Tổ chức Y tế giới thơng báo trẻ em có tỷ lệ mắc Dengue cao người lớn Theo ghi nhận cơng trình nghiên cứu Đơng Nam Á, trẻ từ - tuổi có nguy mắc SXHD cao Theo Đỗ Quang Hà, khảo sát tình hình nhiễm Dengue tỉnh phía Nam từ 1990 - 1999, lứa tuổi từ - 14 tuổi có tỷ lệ mắc cao Bảng 4.1 Đánh giá khả phát bệnh SXHD RT-PCR Mac-ELISA Số ngày sốt Số HT thử nghiệm Mac-ELISA (+) (%) RT-PCR (+) (%) 1 (100) 2 (50) (50) (25) (75) (50) (83,3) (78) (78) (75) (25) (50) Tổng số 34 20 19 Nhận xét kết quả: - Kết đánh giá khả phát bệnh SXHD RT-PCR Mac-ELISA thống kê bảng 4.1 cho thấy: + RT-PCR cho kết dương tính vào ngày sốt bệnh Mac-ELISA cho kết âm tính + Kết cho thấy độ nhạy cao RT-PCR việc phát bệnh SXHD vòng 3, đến ngày sau sốt Điều nêu bật lên ưu điểm RT-PCR việc chẩn đoán sớm bệnh SXHD so với phương pháp Mac-ELISA 28   Thảo luận: + Khả phát sớm vi rút Dengue RT-PCR có giá trị điều trị, nghiên cứu lâm sàng làm giảm tối đa biến chứng cho người bệnh + Đề tài nghiên cứu tiến hành trực tiếp mẫu huyết từ bệnh nhân nên làm tăng mức ý nghĩa phương pháp RT-PCR thực tế 4.1.3 Kết RT-PCR định týp vi rút Dengue Kết điện di phản ứng RT-PCR: Hình 4.1 Kết điện di PCR Dengue M: Thang chuẩn DNA, giếng – 4: DEN-1 (482 bp), DEN-2 (119 bp), DEN-3 (290bp), DEN-4 (392 bp), giếng 5: Âm tính Nồng độ gel agarose: 2%, Buffer: TBE 0,5X,   Điện di: 95 - 105V/30 phút, Thang DNA: 100 - 1000bps   Bảng 4.2 Kết RT-PCR định týp vi rút Dengue Týp vi rút Dengue N Tỷ lệ % DEN-1 14,3 DEN-2 17 60,7 DEN-3 17,9 DEN-4 7,1 Nhận xét kết quả: - Việc xác định týp vi rút Dengue dựa kết điện di trình nghiên cứu (hình 4.1) kết định týp thống kê bảng 4.2 sau: 29   + Theo hình 4.1 từ giếng đến băng điện di có kích thước kích thước DEN-1, DEN-2, DEN-3 DEN-4 482 bp, 119 bp, 290 bp 392 bp Giếng khơng có băng xuất cho kết âm tính Như dựa vào kết phân tích băng điện di xác định týp vi rút Dengue + Theo kết thống kê bảng 4.2, kết định týp vi rút Dengue thu týp DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4, DEN-2 chiếm tỷ lệ cao 60,7% Thảo luận: - Theo kết nghiên cứu tác giả Phạm Hùng Lực (2006), kết định týp vi rút Dengue thu týp DEN-1, DEN-2 DEN-3, DEN-2 chiếm tỷ lệ cao 70,8% Như týp Dengue chiếm tỷ lệ cao (DEN-2) kết nghiên cứu thu tương đối phù hợp so với kết nghiên cứu tác giả Phạm Hùng Lực 4.1.2 Khảo sát tình hình mắc bệnh SXHD theo nhóm tuổi giới tính Bảng 4.4 Tỷ lệ mắc SXHD theo nhóm tuổi giới tính Nhóm tuổi Nam (%) Nữ (%) n (%) 15-30 (28,6) (14,3) 12 (42,9) 31-50 (14,3) (21,4) 10 (35,7) >50 (7,1) (14,3) (21,4) Tổng số 14 14 28 Nhận xét kết quả: - Theo kết nghiên cứu: + Trong 28 trường hợp dương tính, nam chiếm tỷ lệ 50% nữ chiếm tỷ lệ 50% Kết thống kê cho thấy số lượng nam giới nữ giới nhiễm Dengue nhóm tuổi chiếm tỷ lệ + Nhóm tuổi từ 15 - 30 chiếm tỷ lệ cao (42,9%) Thảo luận: - Theo kết nghiên cứu, chúng tơi chưa tìm thấy khác biệt tỷ lệ nhiễm Dengue theo giới tính Có thể, số lượng mẫu nghiên cứu chưa nhiều để đưa nhận xét xác khách quan 30   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Kỹ thuật RT-PCR chẩn đốn xác định sớm nhiễm vi rút Dengue ngày bệnh - Sự phân bố týp vi rút Dengue nghiên cứu thu cho kết sau: týp vi rút DEN-2 týp chủ yếu (60,7%), týp vi rút DEN-1 chiếm 14,3%, týp vi rút DEN-3 chiếm 17,9%, týp vi rút DEN-4 chiếm 7,1% - Kỹ thuật RT-PCR cho kết chẩn đoán nhanh, đồng thời có giá trị chẩn đốn cao, phù hợp với chẩn đoán lâm sàng Việc xác định týp vi rút cho phép mở rộng nghiên cứu gen phả hệ vi rút Dengue tương lai 5.2 Đề nghị - Các nhận xét bước đầu dựa 80 trường hợp nghiên cứu, có điều kiện xin tiếp tục nghiên cứu với số mẫu lớn để đưa nhận xét mang tính khách quan thuyết phục 31   TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008 Sinh học phân tử, tái lần thứ Nhà xuất giáo dục Bùi Đại, 1999 Dengue xuất huyết Nhà xuất Y học, Hà Nội Đỗ Quang Hà, 2003 Virus Dengue dịch sốt xuất huyết Nhà xuất khoa học kĩ thuật, Tp Hồ Chí Minh Vũ Thị Quế Hương, Đỗ Quang Hà, Nguyễn trọng Lân, Nguyễn Thanh Hùng, Võ Đình Thâm, Claudine Roche, Eliane Chungue Vincent Deubel, 1995 – 1996 Chẩn đoán sớm tìm hiểu giai đoạn nhiễm virus huyết bệnh Dengue xuất huyết kĩ thuật RT-PCR Hội vệ sinh dịch tễ Phạm Hùng Lực, 2008 Ứng dụng RT-PCR để chẩn đoán sớm virus Dengue bệnh nhi sốt xuất huyết Cần Thơ, tập 12, phụ số Nhà xuất Y Học Tp Hồ chí minh, Trang 263 – 267 Trần Thị Quế, 2006 – 2010 Chẩn Đoán Virus Sởi (Measles virus – MV) phương pháp real – time PCR, Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thanh Thảo, 2006 Vi-rút học Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR – Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH Chusak Prasittisuk, Andjaparidze, A.G, and Vijay Kumar, 1998 Current Status of Dengue/Dengue Haemorrhagic Fever in WHO South-East Asia Region, Dengue bulletin, 22: – 20 10 Gubler, D.J, 1998 Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever Clinical Microbiology reviews, 11(3): 480–496 11 Gubler, D.J, 1996 Serological diagnosis of Dengue Fever/Dengue Haemorrhagic Fever, Dengue bulletin, WHO, pp: 20-23 12 Haldstead, S.B, 1992 Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever, Textbook of Pediatric Infectious Disease, 3rd ed, pp: 1475-1482 13 World Health Organization, 1986 Dengue haemorrhagic fever – diagnotic, treatment and control Genva – WHO, pp: – 58 TÀI LIỆU WEB 14 dichbenh.com 15 http://www.dsimb.inserm.fr/IDDT2009_in_silico_issue/Watowich.jpg 16 http://i479.photobucket.com/rr159/freeman456/nguyentacPCR.gif 17 http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/sotxuathuyet.htm 18 http://www.nature.com 19 http://www.nature.com/nrmicro/journal/v5/n7/nrmicro1690-f2.jpg 32   20 http://www.viprbrc.org/brc/images/flavi_virion.png 21 World Health Organization 22 http://www.ykhoanet.com/NCKH/bn04.HTM 33   ... DENGUE GÂY RA TẠI BỆNH VIỆN 175 Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS.BS VŨ BẢO CHÂU DOANH THỊ NGA CN CHU THỊ THU HÀ   Tháng 07/2011     LỜI CẢM ƠN ™ Với tất lòng kính trọng u thương, xin... vui tơi suốt q trình học tập thực khóa luận TP Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực Doanh Thị Nga i    TÓM TẮT Sốt xuất huyết bệnh truyền nhiễm cấp tính, vi rút Dengue gây ra, trung gian... lượng mẫu 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.4 Thi t bị, dụng cụ, vật liệu hóa chất sử dụng .22 3.4.1 Thi t bị dụng cụ dùng cho phản ứng RT-PCR 22 3.4.2 Kít hóa chất