ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ LIỆU Niên khóa: 2007 - 2011 Tháng 7/2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN SỐT XUẤT HUYẾT DO VI RÚT DENGUE GÂY RA Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS BS VŨ BẢO CHÂU NGUYỄN THỊ LIỆU Tháng 7/2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến quý thầy cô, anh chị môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh ln dạy, truyền đạt cho em kiến thức bổ ích, tạo điều kiện tốt cho em suốt năm học trường Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy Vũ Bảo Châu chị Nguyễn Thị Thanh Huệ tận tình hướng dẫn, bảo cho em kiến thức bổ ích, giúp em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô, chú, chị làm việc khoa Vi sinh vật - Bệnh viện 175 hỗ trợ em suốt trình em làm khóa luận Con xin bày tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, người ln tận tình ni dưỡng quan tâm ủng hộ để đạt tốt đẹp ngày hơm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến tập thể DH07SH, người bạn đồng hành, giúp đỡ, động viên tơi suốt năm qua i TĨM TẮT Bệnh sốt Dengue bệnh sốt xuất huyết Dengue xuất khắp nơi giới, đặc biệt phổ biến nước nhiệt đới có Việt Nam Trong vùng dịch lưu hành, lứa tuổi bị nhiễm vi rút Dengue Hiện nay, nhiều phương pháp ứng dụng để chẩn đoán phát nhiễm vi rút Dengue bệnh nhân huyết học, nuôi cấy vi rút, sinh học phân tử…Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue coi phương pháp đơn giản, hiệu quả, có độ đặc hiệu cao cho kết nhanh Tôi tiến hành khảo sát 869 mẫu huyết thu thập bệnh nhân đến khám điều trị Bệnh viện 175 Trong số có 370/869 mẫu dương tính, chiếm 42,58%, bao gồm: 54/370 trường hợp IgM dương tính (14,59%); 212/370 trường hợp dương tính kháng thể IgM IgG (57,3%) 104/370 trường hợp dương tính với IgG (28,11%) Tỷ lệ mắc bệnh trẻ em 48% người lớn 42,42%, (p > 0,05) Tỷ lệ bệnh cao vào số tháng : tháng (46%); tháng 10 (42,52%); tháng 11 (50,84%); tháng 12(53,5%) Tỷ lệ mắc bệnh nữ (42,64%) nam (42,11%) khơng có khác biệt, với p > 0,05 Test SD BIOLINE Dengue IgM/IgG dựa sở sắc ký miễn dịch áp dụng rộng rãi để phát sớm trường hợp nhiễm vi rút Dengue phân biệt sơ nhiễm hay tái nhiễm ii SUMMARY Thesis title “Study the serological method in diagnosis of Dengue hemorrhagic fever” Dengue fever and Dengue hemorrhagic fever occur every where in the world, especially in tropical countries, including Viet Nam In endemic areas, all of ages can be infected with Dengue virus Curently, there are several methods be used to diagnosis of Dengue hemorrhagic fever such as: serology, viral culture, molecular biology,…However, using the immunochromatography techniques in diagnosis of Dengue hemorrhagic fever is considered one of the methods of simple, efficient and high specificity, and giving rapid results Acute-phase blood samples were collected from 869 patients attending outpatient and inpatient departments with clinical suspicion of dengue infection in Hospital 175 A total of 370 (42,58%) patients were found to be antibody positive, of which 54 (14,59%) had IgM antibody alone, whereas 212 (57,3%) cases had both IgM and IgG antibodies, indicating secondary infection The remaining 104 (28,11%) cases had IgG antibody The rate of infection was 48% in children and 42,42% in aduls, p > 0.05 Prevalence of Dengue fever in some months of the year: June (46%); October (42,52%); November (50,84%); December (53,5%) The rate of infection in female was 42,64% and male 42,11%, p > 0.05 Test SD BIOLINE Dengue IgM/IgG could be widely applied to detect of Dengue virus infection and could differentiate between primary or secondary infection iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung sốt xuất huyết 2.1.1 Dịch tễ học SXH 2.1.2 Nguồn bệnh đường lây truyền 2.1.3 Tác nhân gây bệnh 2.2 Sinh bệnh học SXH 2.2.1 Thúc đẩy nhiễm trùng phụ thuộc kháng thể 2.2.2 Độc lực vi rút Dengue 2.2.3 Cơ chế sinh bệnh học miễn dịch 2.3 Triệu chứng chẩn đoán 2.3.1 Triệu chứng 2.3.1.1 Sốt Dengue 2.3.1.2 Sốt xuất huyết Dengue 2.3.2 Chẩn đoán 2.3.2.1 Phân lập vi rút 2.3.2.2 Huyết học 10 2.4 Điều trị phòng bệnh 12 2.4.1 Điều trị 12 2.4.2 Phòng bệnh 12 2.5 Một số cơng trình nghiên cứu SXH nước 14 2.5.1 Cơng trình nghiên cứu nước 14 2.5.2 Công trình nghiên cứu ngồi nước 15 iv Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực 16 3.2 Đối tượng khảo sát số lượng mẫu 16 3.3 Nội dung nghiên cứu 16 3.4 Vật liệu dụng cụ 16 3.5 Phương pháp nghiên cứu 16 3.6 Kỹ thuật nghiên cứu (theo kỹ thuật thường quy Bộ y tế) 17 3.6.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm 17 3.6.2 Các bước thực 17 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Kết chung 22 4.2 Kết dương tính theo lớp kháng thể 24 4.3 Kết chẩn đoán SXH theo ngày sốt 24 4.3.1 Kết dương tính SXH chung theo ngày sốt 24 4.3.2 Kết dương tính lớp kháng thể theo ngày sốt 25 4.4 Kết khảo sát SXH theo lứa tuổi 26 4.5 Kết chẩn đốn Dengue theo giới tính 27 4.6 Kết khảo sát Dengue theo tháng 27 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 KẾT LUẬN 30 5.2 ĐỀ NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Nhận định kết xét nghiệm .21 Bảng 4.1 Tỷ lệ dương tính chung xét nghiệm .22 Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính theo lớp kháng thể 24 Bảng 4.3 Tỷ lệ SXH dương tính theo ngày sốt 25 Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính phân bố theo lứa tuổi 26 Bảng 4.5 Kết dương tính phân loại theo giới tính 27 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.2 Muỗi Aedes aegypti Aedes albopitus Hình 2.3 Chu trình tái nhiễm tạo miễn dịch gây sốc Hình 2.4 Chu trình phát triển Aedes aegypti Hình 3.1 Các bước thực 17 Hình 3.2 Quy trình thực xét nghiệm .20 Hình 4.1 Kết thu test SD Bioline Dengue IgM/IgG 23 Hình 4.2 Phân bố dương tính lớp kháng thể theo ngày sốt 25 Hình 4.3 Tỷ lệ dương tính với vi rút Dengue theo tháng 28 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFRIMS ELISA Armed Forces Research Institute of Medical Sciences ARN Acid ribonucleic CPE Cell pathology efficient CS Cộng CTV Cộng tác viên EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay GAC-ELISA IgG antibody capture enzyme linked immunosorbent assay HI Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu IFN- γ Interferon gamma IL-10 Interleukin 10 KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTV Kỹ thuật viên MAC-ELISA IgM antibody capture enzyme linked immunosorbent assay MBD Mosquitoes borne diseases NXB Nhà xuất PCR Polymerase chain reaction RANTES Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted RT-PCR Reverse transcriptase-polymerase chain reaction SKMD Sắc ký miễn dịch SXH/SXHD Sốt xuất huyết/sốt xuất huyết Dengue TNF-α Tumor necrosis factor alpha WHO Tổ chức y tế giới vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) gọi chung sốt xuất huyết bệnh truyền nhiễm muỗi truyền thường gặp tất lứa tuổi tỷ lệ mắc bệnh tử vong cao trẻ em Bệnh diễn biến phức tạp thường có biến chứng nặng nề, khả gây tử vong cao khơng chẩn đốn điều trị kịp thời Việc chẩn đoán vi rút Dengue thực nhiều phương pháp: phân lập vi rút, RT-PCR, ELISA, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn men (MAC-ELISA, GAC-ELISA) Tuy nhiên, số xét nghiệm đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, số không phát sớm bệnh thể đáp ứng miễn dịch chậm (Aaskov M J G, 2003) Do tính chất nguy hiểm bệnh nên cần phải có phương pháp chẩn đốn nhanh, phát sớm xác nhu cầu cần thiết cho thầy thuốc lẫn bệnh nhân việc điều trị nhằm giảm biến chứng nặng nề SXH gây Phương pháp huyết học nguyên tắc sắc ký miễn dịch cho phép phát sớm kháng thể lớp IgM IgG huyết bệnh nhân góp phần hỗ trợ cho việc quản lý điều trị bệnh nhân Do vậy, tiến hành thực đề tài: “ Tìm hiểu phương pháp huyết học chẩn đoán sốt xuất huyết vi rút Dengue gây ra” 1.2 Yêu cầu - Tìm hiểu kỹ thuật chẩn đoán huyết học sở sắc ký miễn dịch chẩn đoán sốt xuất huyết - Xác định tỷ lệ IgM/IgG dương tính 1.3 Nội dung thực - Thu thập xử lý mẫu - Sử dụng kit chẩn đoán nhanh sở sắc ký miễn dịch SD BIOLINE Dengue IgM/IgG, phát định tính phân biệt nhanh IgM/IgG máu huyết bệnh nhân - Thu thập xử lý số liệu Dụng cụ xét nghiệm SD BIOLINE Dengue IgM/IgG có vạch phủ trước: “G” (vạch thử IgG Dengue), “M” (vạch thử IgM Dengue) “C” (vạch chứng) bề mặt màng Cả vạch chứng vạch thử cửa sổ đọc kết khơng nhìn thấy trước nhỏ mẫu Vạch chứng để kiểm tra quy trình xét nghiệm Vạch chứng ln ln xuất chứng tỏ quy trình xét nghiệm thực thuốc thử vạch chứng phản ứng tốt Vạch đỏ tía “M” “G” nhìn thấy cửa sổ đọc kết có đủ kháng thể IgM và/hoặc IgG kháng vi rút Dengue mẫu thử Nếu kháng thể IgM và/hoặc IgG kháng vi rút Dengue khơng có mẫu thử khơng xuất vạch màu “M” “G” Khi mẫu xét nghiệm nhỏ vào giếng mẫu, kháng thể IgM IgG kháng Dengue mẫu thử phản ứng với cộng hợp vàng - protein vỏ vi rút Dengue tái tổ hợp hình thành phức hợp kháng nguyên - kháng thể Phức hợp di chuyển dọc theo chiều dài test thử theo chế mao dẫn gắn với kháng thể IgM IgG người tương ứng vạch thử test thử tạo vạch màu • Quy trình thực - Để tất thành phần kít mẫu xét nghiệm nhiệt độ phòng trước làm xét nghiệm - Lấy dụng cụ khỏi túi đựng đặt lên mặt khô, phẳng - Sử dụng pipette mao quản loại µl sử dụng micropipet - Nhỏ µl mẫu huyết huyết tương vào giếng mẫu hình vng kí hiệu “S” - Nhỏ - giọt (khoảng 90 - 120 µl) dung mơi vào giếng tròn - Đọc kết vòng 15 - 20 phút theo hướng dẫn nhà sản xuất - Lưu ý: không đọc kết sau 20 phút Đọc muộn cho kết sai 19 Hình 3.2 Quy trình thực xét nghiệm Hình 3.3 Kết dương tính/âm tính với vi rút Dengue • Nhận định kết Dựa vào giá trị IgM IgG phân biệt giai đoạn nhiễm bệnh sơ nhiễm hay tái nhiễm 20 Bảng 3.1 Nhận định kết xét nghiệm Kết xét nghiệm kháng thể IgM, IgG Chẩn đoán Diễn giải IgM (+), IgG (-) IgM (+), IgG (+) Sơ nhiễm Dengue Dương tính IgM (+), IgG (+) IgG (+), IgM (-) Tái nhiễm Dengue Dương tính IgM (-), IgG (-) Khơng nhiễm Dengue Âm tính Kết khơng có giá trị vạch chứng khơng xuất vạch Lượng mẫu xét nghiệm không đủ kỹ thuật thực sai nguyên nhân làm vạch chứng không xuất Phải làm lại xét nghiệm xét nghiệm • Một số lưu ý bảo quản tính ổn định kit - Để có kết tốt nhất, cần phải tuân thủ theo hướng dẫn - Tất mẫu xét nghiệm phải xử lý mẫu nhiễm vi rút tiềm ẩn - Dụng cụ xét nghiệm phải bảo quản nhiệt độ - 30oC - Dụng cụ xét nghiệm nhạy cảm với nhiệt độ độ ẩm - Không mở lấy dụng cụ xét nghiệm khỏi túi nhơm hàn kín khơng dùng Thực xét nghiệm sau lấy dụng cụ ngồi túi nhơm - Khơng sử dụng hết hạn dùng - Không sử dụng dụng cụ xét nghiệm túi nhôm đựng bị hỏng hở - Các thành phần (dụng cụ xét nghiệm dung môi) kit phải đạt chất lượng Không trộn lẫn thành phần lô khác - Dung môi thử nghiệm chứa natri azit chất bảo quản nồng độ thấp Natri azit độc phải xử lý cẩn thận, tránh tiếp xúc lên da đường tiêu hóa • Lưu ý sử dụng kit - Chỉ dùng chẩn đốn in vitro Khơng sử dụng lại test thử - Mang găng tay bảo vệ xử lý mẫu, sau rửa tay - Tránh làm bắn tung tóe tạo luồng khí - Dùng chất tẩy trùng thích hợp để làm vết vấy bẩn - Khử trùng loại bỏ tất mẫu xét nghiệm, xét nghiệm phản ứng nguyên liệu nhiễm trùng tiềm ẩn vào thúng chứa rác thải sinh học 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết chung Qua khảo sát 869 mẫu huyết thu thập từ bệnh nhân đến khám điều trị bệnh viện 175, chẩn đoán lâm sàng nghi ngờ nhiễm vi rút Dengue, kết thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Tỷ lệ dương tính chung xét nghiệm Tổng số mẫu Dương tính Âm tính N 869 370 499 Tỷ lệ (%) 100 42,58 57,42 Trong đó: Kết âm tính: Chỉ nhìn thấy vạch chứng “C” thử Không phát kháng thể IgG IgM Xét nghiệm lại vòng - ngày nghi ngờ bị nhiễm sốt xuất huyết (hình 4.1a) IgM dương tính: Xuất vạch chứng “C” vạch IgM (M) thử, tức dương tính kháng thể IgM kháng lại vi rút Dengue Điều chứng tỏ nhiễm vi rút giai đoạn đầu sơ nhiễm (hình 4.1b) IgG dương tính: Xuất vạch chứng “C” vạch IgG (G) thử, tức dương tính với kháng thể IgG Điều chứng tỏ bệnh nhân bị nhiễm vi rút trước tái nhiễm (hình 4.1c) IgM IgG dương tính: Xuất vạch chứng “C”, vạch IgM (M) vạch IgG (G) thử, tức dương tính với hai kháng thể IgM IgG Điều chứng tỏ nhiễm vi rút Dengue sơ nhiễm muộn tái nhiễm sớm (hình 4.1d) 22 a) b) c) d) Hình 4.1 Kết thu test SD Bioline Dengue IgM/IgG a) Kết âm tính; b) IgM dương tính; c) Kết IgG dương tính; d)IgM + IgG dương tính Số liệu thu bảng 4.1 cho thấy có 370/869 trường hợp dương tính chiếm 42,58% Điều tương đương với báo cáo số tác giả: Nguyễn Thị Nhung cs (2008) báo cáo tỷ lệ dương tính 47%; nghiên cứu năm 2006 TP HCM Cao Minh Nga cộng sự, nghiên cứu 60 mẫu huyết người lớn (19 - 90 tuổi) có 45,45 % trường hợp dương tính; Lê Thị Hải Yến cs nghiên cứu năm 2005 - 2009 địa điểm bệnh viện quân y thu số trường hợp dương tính với vi rút Dengue 50,21% Aneela Altaf Kidwai cs (2008 - 2009) báo cáo có 41,9% dương tính nghiên cứu 23 4.2 Kết dương tính theo lớp kháng thể Xét nghiệm SD BIOLINE Dengue IgM/IgG trợ giúp hữu ích chẩn đốn nhanh SXH vi rút Dengue gây Trong nghiên cứu Groen J cs (2000) so sánh phương pháp miễn dịch phát kháng thể IgM IgG, kỹ thuật SKMD có ưu điểm: thử nghiệm đơn giản, dễ thực hiện, phát vòng 15 - 20 phút (trong kỹ thuật MAC-ELISA phải ngày kết quả) Các thử nghiệm nhanh thực nhận hàng loạt mẫu (khi có đại dịch bùng phát) mà đảm bảo việc đưa kết Bên cạnh đó, thử nghiệm phát phân biệt lúc kháng thể IgM IgG phân biệt trường hợp sơ nhiễm hay tái nhiễm Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính theo lớp kháng thể KQ dương tính với lớp Tổng số mẫu kháng thể dương tính IgM IgG IgM IgG N = 370 54 104 212 Tỷ lệ (%) 14,59 28,11 57,3 < 0,05 p Kết bảng 4.2 cho thấy 370 mẫu dương tính khảo sát, có 54 trường hợp IgM dương tính chiếm tỷ lệ 14,59% tương ứng với giai đoạn đầu sơ nhiễm Dengue; 212 trường hợp có IgG IgM dương tính chiếm 57,3%, bệnh nhân bị nhiễm vi rút giai đoạn sau sơ nhiễm giai đoạn tái nhiễm sớm; 104 trường hợp chiếm 28,11% nghi ngờ tái nhiễm vi rút Dengue thể đáp ứng miễn dịch chậm trước nhiễm loại Flavivirus khác nên có IgG dương tính Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với p < 0,05 4.3 Kết chẩn đốn SXH theo ngày sốt 4.3.1 Kết dương tính SXH chung theo ngày sốt Đa số BN đến khám điều trị có biểu sốt cao có dấu hiệu xuất huyết da từ ngày đến ngày bệnh Kết chẩn đoán Dengue theo ngày sốt thể bảng 4.3 24 Bảng 4.3 Tỷ lệ SXH dương tính theo ngày sốt Ngày sốt ∑(N) Dương tính % N2 16 37,5 N3-N5 845 360 42,72 N5-N8 50 p p > 0,05 Kết thu thập khảo sát cho thấy số mẫu máu thu thập từ ngày thứ lại cho tỷ lệ dương tính cao 4/8 trường hợp chiếm 50% Ngày đến ngày có 360/845 trường hợp dương tính chiếm 42,72% ngày tỷ lệ dương tính 37,5% Tuy nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Việc phát IgM hay IgG dương tính phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu máu (với IgM), giai đoạn nhiễm trùng kháng thể tồn bệnh nhân bị nhiễm trước 4.3.2 Kết dương tính lớp kháng thể theo ngày sốt Trong chẩn đoán SXH, việc xác định kháng thể IgM IgG xuất theo ngày sốt điều có ý nghĩa việc xác định giai đoạn nhiễm bệnh từ xử lý tốt trường hợp tái nhiễm để tránh biến chứng dễ xảy thường diễn biến nghiêm trọng SXHD 75 80 70 60 50 % 40 30 20 10 57,22 50 50 28,06 25 N3-N5 14,72 0 IgM N2 IgM+IgG >N5 IgG Lớp kháng thể Hình 4.2 Phân bố dương tính lớp kháng thể theo ngày sốt Số liệu hình 4.2 cho thấy kháng thể IgM xuất ngày đến ngày cao (25%), ngày đến ngày 14,72% khơng có trường hợp dương tính ngày Kết chúng tơi thu phù hợp với Lam SK cs, 1996; 25 Innis BL, 1989: đáp ứng miễn dịch tạo KT IgM từ ngày thứ đến ngày thứ kể từ có triệu chứng tồn vòng 30 - 60 ngày, KT IgG bắt đầu xuất (thường sau ngày 14 tồn suốt đời) Do vậy, KT IgM phát từ ngày trở Sự chênh lệch tỷ lệ dương tính KT IgM theo ngày sốt có ý nghĩa mặt thống kê với p < 0,05 Sự xuất đồng thời KT IgM IgG giúp bác sĩ lâm sàng xác định giai đoạn nhiễm bệnh dựa vào ngày sốt Trong khảo sát nhận thấy tỷ lệ dương tính kháng thể cao giai đoạn N5-N8, điều xác định bệnh nhân nhiễm vi rút giai đoạn sau sơ nhiễm Trong ngày 57,22% ngày 50% trường hợp dương tính với KT IgM IgG Điều giải thích trường hợp phát giai đoạn tái nhiễm, kháng thể IgG tăng nhanh ngày đầu sau có triệu chứng sốt đa số trường hợp kèm theo tăng IgM (Gubler DJ, 1996; Innis BL, 1989) Tuy nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê với p > 0,05 Trong tái nhiễm, kháng thể IgG phát thời gian Trong nghiên cứu này, tiến hành xét nghiệm vào ngày sốt thứ thấy tỷ lệ dương tính cao (50%), ngày - 28,06% khơng có trường hợp xét nghiệm sau ngày Điều giải thích bệnh nhân giai đoạn phục hồi tái nhiễm Dengue trước nhiễm loại Flavivirus khác Trong trường hợp KT IgG âm tính xét nghiệm giai đoạn sốt ngày sau bệnh nhân bị sốt Dengue Sự chênh lệch tỷ lệ dương tính KT IgG qua ngày sốt có ý nghĩa mặt thống kê với p < 0,01 4.4 Kết khảo sát SXH theo lứa tuổi Sự phân bố theo lứa tuổi chênh lệch nhẹ, lứa tuổi nhỏ 15 tuổi (48%), lớn 15 tuổi (42,42%) (bảng 4.4) Bảng 4.4 Tỷ lệ dương tính phân bố theo lứa tuổi Tuổi N Tỷ lệ (%) ≤15 12/25 48 >15 358/844 42,42 p > 0,05 Bệnh SXH xuất lứa tuổi, khảo sát ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh cao thuộc nhóm tuổi < 15 số lượng mẫu thu 12/25 26 trường hợp (48%) Nhóm tuổi >15 tuổi có 358/844 trường hợp dương tính chiếm 42,42% Sự khác biệt tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi khơng có ý nghĩa mặt thống kê (p > 0,05) Kết nghiên cứu tác giả khác nước cho hầu hết trẻ em lứa tuổi dễ mắc bệnh Lâm Thị Mỹ (2002), nhóm tuổi nhỏ tuổi (40,8%) Trong Phan Văn Bé Bảy cs (2009) báo cáo lứa tuổi mắc bệnh nhiều nhóm nhỏ 15 tuổi (96,13%), kết cao mẫu thu thập họ sàng lọc trước kỹ thuật MAC-ELISA Tuổi bệnh nhân coi yếu tố nguy SXHD cao lứa tuổi - tuổi, số bệnh nhân trẻ em nhỏ tuổi người lớn tuổi Sự liên quan đến tuổi chưa biết rõ (Đỗ Quang Hà, 2003) 4.5 Kết chẩn đoán Dengue theo giới tính Kết chẩn đốn Dengue theo giới tính thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết dương tính phân loại theo giới tính Giới N Tỷ lệ Nữ 165/387 42,64% Nam 205/482 42,11% p > 0,05 Kết thu được: tỷ lệ dương tính với vi rút Dengue nữ 42,64% cao nam (42,11%), không khác biệt giá trị thống kê (p > 0,05) Kết có khác so với phần lớn tác giả Trần Thị Thúy cs; Nguyễn Trọng Lân cs báo cáo tỷ lệ nam mắc bệnh nhiều nữ, báo cáo Lâm Thị Mỹ cộng (2002) cho thấy nam mắc bệnh chiếm 51,8% nữ 48,1% Tuy nhiên, chênh lệch khơng đáng kể, tùy thuộc vào tiêu chí chọn mẫu bệnh phẩm, thời điểm nghiên cứu phân bố dân cư Nam, nữ, dinh dưỡng, chủng tộc tình trạng miễn dịch vài tác giả coi yếu tố nguy chưa tìm hiểu nhiều Ở Thái Lan, tỷ lệ nam/nữ chung cho SXHD 1/1,4 Ở Indonesia tỷ lệ nam/nữ 1/1,2 chung cho trường hợp SXHD (Đỗ Quang Hà, 2003) 4.6 Kết khảo sát Dengue theo tháng Qua hình 4.3 tơi nhận thấy tỷ lệ dương tính tập trung cao vào tháng cuối năm Trong cao tháng 12 chiếm 53,50%, tháng 11 (50,84%), tháng 10 (42,52%) Tỷ lệ dương tính giảm dần từ tháng (41,62%) đến tháng (22%) tăng đột ngột 27 giai đoạn từ tháng đến tháng (46%) Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê với p < 0,05 51,69 53,5 60 46 50 42,52 41,62 39,53 31,34 40 24,4 22 % 30 20 10 10 11 12 Tháng Hình 4.3 Tỷ lệ dương tính với vi rút Dengue theo tháng SXH bệnh dịch lưu hành mức độ nặng, xuất khắp nơi vào tháng năm Với đặc tính phân bố yếu tố khí hậu thời tiết năm TP HCM thường xuyên đạt mức cao ổn định, nhiệt độ trung bình từ 25 - 27°C, độ ẩm trung bình 79,5%, lượng mưa nhiều phân bố không vào tháng cuối năm với tập quán sinh hoạt người dân điều kiện thuận lợi cho muỗi Aedes sinh sản truyền vi rút dẫn đến xuất SXH phát thành dịch tháng mưa nhiều Người ta nhận thấy Thái Lan, Indonesia Việt Nam, lăng quăng Aedes aegypti sống chủ yếu chum vại chứa nước nhà bị ảnh hưởng lớn mưa Nhiệt độ độ ẩm cao mùa mưa làm cho muỗi trưởng thành phát triển tạo điều kiện thuận lợi truyền vi rút cho người khác Chu kỳ phát triển vi rút muỗi có liên quan trực tiếp tới nhiệt độ (Đỗ Quang Hà, 2003) Cũng giống tất xét nghiệm huyết học khác, điều quan trọng việc sử dụng test SD BIOLINE Dengue IgM/IgG trợ giúp chẩn đoán, kết cuối phải dựa vào kết xét nghiệm nhanh kết hợp với triệu chứng 28 lâm sàng bệnh nhân Các bác sĩ đưa định quản lý bệnh nhân không nên dựa vào chẩn đoán huyết hay thử nghiệm khác Mặc dù vậy, khảo sát tơi tồn hạn chế mẫu máu thu thập có lặp lại, điều phụ thuộc vào định bác sĩ lâm sàng, đối tượng khảo sát chủ yếu người lớn địa điểm nghiên cứu bệnh viện quân y xét nghiệm phân biệt sơ nhiễm hay tái nhiễm mà không xác định týp vi rút gây bệnh 29 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Qua khảo sát 347/819 trường hợp xác định nhiễm vi rút Dengue xét nghiệm SKMD SD BIOLINE Dengue IgM/IgG kết luận: - Có thể sử dụng test nhanh SD BIOLINE Dengue IgM/IgG để phát sớm giai đoạn cấp trường hợp nhiễm vi rút Dengue - Có thể phân biệt sơ nhiễm hay tái nhiễm xác định týp vi rút gây bênh - Khả mắc bệnh nam nữ - Vi rút Dengue gây bệnh cho lứa tuổi, đặc biệt trẻ em, bùng phát vào tháng mưa 5.2 ĐỀ NGHỊ - Vì số lượng mẫu khảo sát chưa nhiều, chưa đại diện toàn dân số nên cần nghiên cứu xa hơn, kết hợp với nghiên cứu sử dụng phương pháp phân lập vi rút, RT-PCR để giải thích tương quan gen SXHD - Thực biện pháp ngăn chặn lan truyền vi rút gây bệnh, nâng cao nhận thức cộng đồng để loại bỏ véc tơ truyền bệnh 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Đại 1999 Dengue xuất huyết, NXB Y học Hà Nội Đỗ Quang Hà 2003 Virus Dengue dịch SXH, NXB khoa học kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dương, Lê Huyền Ái Thúy, Trần Minh Trí 1997 Thử nghiệm chẩn đốn sốt xuất huyết Dengue kỹ thuật RT-PCR Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 1, Số 3:145-149 Lâm Thị Mỹ, Nguyễn Trọng Lân, Nguyễn Kim Hồng, Nguyễn Thanh Hương, Lê Tấn Bảo 2003 Chẩn đoán điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch Y Học Tp Hồ Chí Minh, Tập 7, Phụ số 1, 33 - 37 Lê Bích Liên, Nguyễn Trọng Lân 2003 Chẩn đoán sớm sốt xuất huyết Dengue (SXHD) xét nghiệm sắc ký miễn dịch nhanh Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 7, Phụ số 1, 169 - 175 Nguyễn Đỗ Nguyên 1997 Sốt xuất huyết Dengue/hội chứng sốc Dengue: số vấn đề sức khỏe công cộng quan trọng Việt Nam Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 1, Phụ số 1, 15 - 24 Nguyễn Thanh Bảo ctv 2004 Virut học, NXB Y học Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Văn Tân Minh 2008 Đối chiếu kết huyết chẩn đoán NS1 Ag với chẩn đoán lâm sàng sốt xuất huyết Dengue Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 12, Phụ số 4, 36 - 40 Phan Văn Bé Bảy, Hoàn Tiến Mỹ 2009 Xét nghiệm ELISA phát kháng nguyên NS1 chẩn đoán sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 13, Phụ số 1, 249 - 255 10 TCYTTG 2009: Dengue: hướng dẫn chẩn đốn, điều trị, phòng ngừa kiểm soát, Chương 11 Trần Thị Thúy tập thể khoa nhiễm, Vũ Thị Quế Hương, Kenji Hirayama 2007 Mối liên quan gen biểu lâm sàng, cận lâm sàng bệnh nhi sốt xuất huyết Dengue bệnh viện nhi đồng II Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 11, phụ số 4, 11 - 16 Tài liệu nước 12 Aaskov M J G (2003) Dengue J Infect Dis, 4: 66 - 71 13 Aneela Altaf Kidwai, Qaiser Jamal, Saher, Mehrunnisa, Faiz-ur-Rehman Farooqi, Saleem-Ullah 2008 - 2009 Serodiagnosis of dengue infection using rapid immunochromatography test in patients with probable dengue infection Original Articl 14 Chakravarti A, Kumaria R, Berry N and Sharma VK 2002 serodiagnosis of Dengue infection by rapid Immunochromatoggaphy test in a hospital setting in Delhi, India, 1999-2001 Dengue bulletin, Vol 26 15 Groen J, Koraka P, Velzing J, Copra C and Osterhaus AD 2000 Evaluation of six immunoassays for detection of dengue virus-specific immunoglobulin M and G antibodies Clin Diagn Lab Immunol, 7, 867 - 871 16 Gubler D J 1996 Serological diagonosis of dengue/dengue haemorrhagic fever Dengue Bull, 20, 20 - 23 17 Gubler D J.1989 Aedes aegypti and Aedes acgypti-borne discases control in the 1990s : top down or bottom up Am J Trop Med Hyg 40(6) : 571 - 578 (9 - 11) 31 18 Guzman MG, Kouri G 2004 Dengue diagnosis, advances and challenges.International Journal of Infectious Diseases 8: 69 - 80 19 Halstead, S.B 1980 Dengue haemorrhagic fever A public health problem and field for research Bull, W H O 20 Innis B L, Nisalak A, Nammanitya S, Kusalerdchariya S, Chongswasdi V, Suntayakorn S, Puttisri P, Hoke C H 1989 An Enzyme-linked immunosorbent assay to characterise dengue infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate Am J Trop Med Hyg, 40:418 - 427 21 Lam S K 1993 Rapid dengue diagnosis and interpretation Malays J Pathol, 15:9 - 12 22 Mackenzie JM, Jones MK, Yuong PR 1996 Immunolocalization of the Dengue virus nonstructural glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA replication Virology, 220: 232 - 240 23 Sathish N,Vijayakumar T S, Abraham P and Sridharan G 2003 Dengue Fever: Its Laboratory Diagnosis, with Special Emphasis on IgM Detection Dengue Bulletin, Vol 27 24 Vaughn DW, Nisilak A, Kalayanarooj S, Solomon T, Dung NM, Cuzzubbo A and Devine PL 1998 Evaluation of a rapid immunochromatographic test for diagonosis of Dengue virus infection Journal of Clinical Microbiology, 36: 234 - 238 25 WHO Dengue hemoragic fever: diagnosis, treatment and control, World health Organization, Geneva, 2009 Tài liệu internet http://hocvienquany.vn/tapchiyduoc/DATA/2011_2_3_Le%20Hai%20Yen.pdf 32 PHỤ LỤC Bảng Tỷ lệ dương tính lớp kháng thể theo ngày sốt IgM Ngày IgM+IgG IgG ∑(n) sốt N % n % n % N2 0 50 50 N3-N5 53 14,72 206 57,22 101 28,06 360 N5-N8 25 75 0 p < 0,05 > 0,05 < 0,01 Bảng Tỷ lệ dương tính với vi rút Dengue theo tháng THÁNG ∑(n) 10 Tổng dương tính n % 127 54 42,52 11 118 61 51,69 12 157 84 53,5 173 72 41,62 86 34 39,53 67 21 31,34 41 10 24,4 50 11 22 50 23 46 p < 0,05 ... nhiều thi t bị đắt tiền, số không phát sớm bệnh thể đáp ứng miễn dịch chậm (Aaskov M J G, 2003) Do tính chất nguy hiểm bệnh nên cần phải có phương pháp chẩn đốn nhanh, phát sớm xác nhu cầu cần thi t... giả ngoại nhiễm nucleic - Có thể định danh týp - Đắt tiền - Cần thi t KTV chuyên nghiệp huyết acid - Phát sớm giúp điều trang thi t bị đắt tiền - Không thể phân biệt sốt Dengue tiên trị sớm nhiễm... cầu kháng thể kháng tiểu cầu Sinh bệnh học giảm tiểu cầu SXHD/sốc SXHD chưa biết rõ Có nhiều giả thi t đưa để giải thích cho giảm tiểu cầu: - Vi rút Dengue ức chế tủy xương sản xuất tiểu cầu bị