ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175

BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO TRƢỜNG ÐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175 Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HUỲNH THÁI QUI Niên khóa : 2008 - 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ÐÀO TẠO TRƢỜNG ÐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRONG ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH KIỂU GIEN VI RÚT VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175 Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS VŨ BẢO CHÂU HUỲNH THÁI QUI CN CHU THỊ THU HÀ Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin gửi lời cám ơn đến cha mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập Em chân thành gửi lời cám ơn đến:  TS.BS Vũ Bảo Châu CN Chu Thị Thu Hà tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt q trình thực khóa luận  Ban chủ nhiệm môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh tất thầy truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trƣờng  Ths Tơn Bảo Linh tận tình giúp đỡ động viên em suốt q trình thực khóa luận  Tập thể lớp DH08SH bạn bè cổ vũ, động viên suốt q trình học tập Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Huỳnh Thái Qui i TÓM TẮT Bệnh viêm gan siêu vi vi rút viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) bệnh nguy hiểm tác nhân gây viêm gan chuyển sang dạng mạn tính có tần suất cao đến 70 - 80% Khoảng 20 - 30% trƣờng hợp viêm gan C mạn tính tiến triển thành xơ gan ung thƣ gan Ở nhiều nƣớc, HCV tác nhân gây ung thƣ gan Việc xác định kiểu di truyền giúp cho nghiên cứu dịch tễ học nhiễm HCV định lƣợng phác đồ điều trị, đồng thời sở cho nghiên cứu hồn thiện sinh phẩm chẩn đốn sản xuất vaccin phòng ngừa tƣơng lai Đây nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real-time PCR để định lƣợng định kiểu gien HCV huyết bệnh nhân Phát hiện, định lƣợng định kiểu gien HCV để tiên lƣợng phác đồ điều trị thích hợp Thống kê số liệu số ca nhiễm xác định kiểu gien ca đƣợc định lƣợng HCV Bệnh viện 175 Kết nghiên cứu cho thấy kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe với probe phát tác nhân gây bệnh đƣợc đánh dấu màu FAM probe phát chứng nội đƣợc đánh dấu màu HEX phát trƣờng hợp dƣơng tính với RNA-HCV Kỹ thuật ứng dụng cho định kiểu gien HCV cho kết có ca nhiễm kiểu gien có ca nhiễm kiểu gien Kỹ thuật real-time PCR kỹ thuật nhạy đặc hiệu để chẩn đoán phát hiện, định lƣợng định kiểu gien HCV ii SUMMARY The title of thesis “Using real-time PCR for detect quantitative and genotype hepatitis C virus (HCV) at Hospital 175” Viral hepatitis caused by hepatitis C virus (Hepatitis C vius - HCV) is a very dangerous disease and hepatitis is the cause of come to chronic highly (70 - 80%) 20 - 30% of cases of chronic hepatitis C may progress to cirrhosis or liver cancer In many countries, HCV is the main cause of liver cancer Determination the right genotype of genetic will allow epidemiologists and quantitative HCV treatment regimens, and is the basis for the research and complete diagnostic biologicals and vaccines to prevent the production of future With in the research techniques real-time PCR was applied for quantitative and qualitative HCV genotype in the serum of the patients at Hospital 175 Base on those results, HCV type to predict things away appropriate treatment Statistical data in HCV infection at Hospital 175 was collected Using real-time RT-PCR could detect of cases positive for HCV There were three patients infected with genotype 1, one patient infected with genotype Real-time PCR is a sensitive and specific technique for the diagnosis, detection, quantitation and determination the HCV Key words: hepatitis C virus, liver cancer, quantitation, determination, genotype hepatitis C virus iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ảnh ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh viêm gan vi rút viêm gan C (Hepatitis C Virus, HCV) 2.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan C 2.1.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan C 2.1.3 Dịch tễ học phân tử vi rút viêm gan C 2.2 Vi rút viêm gan C (HCV) 2.2.1 Cấu trúc HCV 2.2.2 Bộ gien HCV 2.2.3 Kiểu gien khái niệm “quasi - species” HCV 2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng HCV 10 2.3.1 Phƣơng pháp bDNA (branched DNA) 10 2.3.2 PCR định lƣợng cạnh tranh (quantitative competitive PCR) 11 2.4 Phƣơng pháp real-time RT-PCR 11 2.4.1 Phản ứng RT (reverse transcription) 11 2.4.2 Phƣơng pháp real-time PCR 12 2.4.3 Một số khái niệm dùng định lƣợng real-time PCR 17 2.5 Định kiểu gien HCV 18 2.5.1 Phƣơng pháp giải trình tự 18 iv 2.5.2 Định kiểu gien phƣơng pháp real-time PCR 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu 20 3.2.1 Đối tƣợng số lƣợng mẫu 20 3.2.2 Mồi mẫu dò 20 3.2.3 Vật liệu hóa chất dùng để tách chiết RNA 20 3.2.4 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng RT 21 3.3.5 Vật liệu hóa chất dùng cho xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng 21 3.2.6 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng real-time PCR 21 3.2.7 Vật liệu hóa chất dùng cho phản ứng xác định kiểu gien HCV 21 3.2.8 Thiết bị dụng cụ 21 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu kỹ thuật nghiên cứu 21 3.3.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.2 Kỹ thuật nghiên cứu 22 3.3.3 Lấy máu ly trích huyết 22 3.3.4 Phƣơng pháp tách chiết RNA 22 3.3.5 Phƣơng pháp real-time RT-PCR 23 3.3.5.1 Phƣơng pháp RT 23 3.3.5.2 Phƣơng pháp real-time PCR định lƣợng HCV 24 3.3.5.3 Phƣơng pháp real-time PCR định kiểu gien HCV 26 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết chạy real-time RT-PCR 28 4.1.1 Phân tích kết mẫu dƣơng tính 28 4.1.1.1 Mẫu dƣơng tính cao 28 4.1.1.3 Mẫu dƣơng tính yếu 31 4.1.2 Phân tích kết mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng 32 4.1.3 Phân tích kết mẫu âm tính 33 4.2 Phân tích kết mẫu chạy kiểu gien HCV 33 4.2.1 Kiểu gien 34 4.2.2 Kiểu gien 34 4.3 Tình hình nhiễm HCV Bệnh viện 175 35 v 4.4 Kết xác định kiểu gien HCV 36 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Đề nghị 38 Tài liệu tham khảo 39 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : Adenine AMV : Avian Myeloblastosis Virus bDNA : Branched Deoxyribonucleic Acid C : Cytocine Ct : Chu kỳ ngƣỡng, Threshold Cycle DEPC : Diethylpyrocarbonate DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay G : Guanine HAV : Vi rút viêm gan A, Hepatitis A Virus HBV : Vi rút viêm gan B, Hepatitis B Virus HCV : Vi rút viêm gan C, Hepatitis C virus HVR : Vùng siêu biến, Hypervariable Region M-MLV : Moloney Murine Leukemia Virus NCR : Vùng khơng mã hóa, Non Coding Region NS : Khơng cấu trúc, Non Structure PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid RT : Reverse Transcriptase RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism Taq : Thermus Aquaticus T : Thymine UTR : Untranslated Region U : Uracil WHO : Tổ chức y tế giới, World Health Organization vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tình hình nhiễm viêm gan C giới (WHO, 1999) Bảng 3.1 Thành phần kít trích biệt RNA tồn phần từ bệnh phẩm 20 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt chạy cDNA cài đặt cho máy real-time PCR 24 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt định lƣợng HCV 26 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt định kiểu gien cài đặt cho máy real-time PCR 27 Bảng 4.1 Phân bố kiểu gien HCV 36 viii Bảng 3.3 Chu trình nhiệt định định lƣợng HCV cài đặt cho máy real-time PCR Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ 950C phút 950C 15 giây 650C phút chu kỳ 40 chu kỳ (Đọc kết bƣớc này) 720C 20 giây 3.3.5.3 Phƣơng pháp real-time PCR định kiểu gien HCV Nguyên lý: mồi mẫu dò đƣợc thiết kế dựa vào vùng 5’NC, vùng phân biệt đƣợc kiểu gien dựa vào khác trình tự nucleotide Cách thực hiện: thực bƣớc với tube PCR mix đƣợc giữ khay lạnh đá tan Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần dùng, cất PCR mix lại thực bƣớc Trƣớc sau đặt phản ứng PCR phải ly tâm nhẹ tube để tất dung dịch nằm dƣới đáy tube Viết ký hiệu đánh số mẫu lên thành tube thiết bị đọc real-time từ nắp tube Thực phản ứng: Cho 2,5 µl dịch cDNA từ phản ứng RT vào tube iVA HCV Genotype 1-6 rPCR Mix iVAHCV Genotype 2-3 rPCR Mix (mỗi mẫu, kể chứng +/- phải cho vào hai tube) Phải kiểm tra chắn phần dịch đầu típ phải đƣợc cho hết vào tube Thực mẫu nào, mở nắp tube tƣơng ứng thực xong đóng thật kỹ nắp tube để tránh nguy ngoại nhiễm Xong, ly tâm nhẹ đặt tube vào máy real-time PCR Bật máy real-time PCR, đèn đầu đọc realtime 15 phút trƣớc chạy chƣơng trình Bật máy tính chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chƣơng trình real-time PCR lên Phải kiểm tra chắn máy real-time PCR máy tính kết nối với Chọn chức chờ “Heat lid” đạt 1050C chƣơng trình luân nhiệt bắt đầu Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” phần mềm với vị trí mẫu đƣợc đặt máy real-time PCR Với mẫu: chọn mẫu “Unknown” Đặt tên số tƣơng ứng với ký hiệu mẫu Mỗi mẫu có tube tƣơng ứng, đặt tên “Ký hiệu mẫu-1.6” ứng với tube kiểu gien - 6, “Ký hiệu mẫu-2.3” ứng với kiểu gien - 26 Với chứng dƣơng chứng âm: để kiểm tra, nên chọn loại mẫu “Unknown” Đặt tên số ký hiệu tƣơng ứng với mẫu Không nên chọn “PTC – Possitive control” “NTC – Negative control” Đặt tên “Chứng dƣơng”, “Chứng âm” tƣơng ứng Chọn màu “FAM” “HEX” cho tất mẫu, chứng dƣơng chứng âm Bảng 3.4 Chu trình nhiệt định kiểu gien cài đặt cho máy real-time PCR Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ 950C phút 950C 15 giây 650C phút chu kỳ 40 chu kỳ Quy trình thực chạy real-time HCV sử dụng kít LightPoweriVAHCV Genotype RT-rPCR kít đƣợc giải thích nhƣ sau: 950C phút giúp cho enzyme Taq polymerase bắt đầu thoát khỏi lớp áo protein (Hotstart, Phạm Hùng Vân, 2008), gia đoạn Taq polymerase bắt đầu hoạt động, kết thúc giai đoạn hotstart, chu kỳ luân nhiệt bắt đầu Chu trình nhiệt cho 40 chu kỳ: bắt đầu 950C 15 giây, biến tính DNA, cắt đứt liên kết hydro, DNA biến thành mạch đơn, enzyme bắt đầu hoạt động Ở nhiệt độ 650C phút giúp cho Taq polymerase hoạt động hiệu probe bắt cặp vào trình tự đích, primer bắt đầu bắt cặp vào trình tự đích sau probe bắt cặp Đây khoảng nhiệt độ thời gian kéo dài chuỗi DNA đích primer bắt cặp đặc hiệu Khi trình kéo dài bắt đầu đầu Q (quencher probe) bị cắt đứt phát tín hiệu huỳnh quang, mắt đọc huỳnh quang máy real-time bắt mã hóa huỳnh quang nhận đƣợc 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết chạy real-time RT-PCR Sau kết thúc trình real-time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết Tùy loại máy, phân tích dạng “Linear” dạng “Log” hai Trong tube iVA HCV qPCR mix, probe phát tác nhân RNA-HCV đƣợc đánh dấu màu FAM, probe phát chứng nội đƣợc đánh dấu màu HEX Các kết dƣơng tính đƣợc nhân với 150 thu đƣợc kết hàm lƣợng vi rút/ml (copies/ml) 4.1.1 Phân tích kết mẫu dƣơng tính 4.1.1.1 Mẫu dƣơng tính cao Hình 4.1 Kết chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính phân tích dạng log Baseline: đường baseline; 102,104,106; mẫu chuẩn dương nồng độ tương ứng 102, 104, 106; S: mẫu xét nghiệm; D: mẫu chứng âm; trục Ox: biểu diễn số chu kỳ; trục Oy: biểu diễn tín hiệu huỳnh quang Dựa vào đồ thị biểu diễn dạng linear (hình 4.2) để phân tích kết Định lƣợng nồng độ RNA-HCV phải dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nồng độ 102, 104, 106 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính xây dựng dựa vào nồng độ đƣợc trình bày hình 4.3 Ngƣỡng định lƣợng x 102 copies/ml Chọn kênh huỳnh quang “FAM” cho giếng chuẩn dƣơng, mẫu chứng âm Các thông số standard cho kết quả: hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 1,00, hiệu suất nhân 100,8%, Slope -3,302 đạt yêu cầu tiến hành lấy kết Chứng âm cho kết âm, chứng tỏ trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Mẫu xét nghiệm cho kết 28 dƣơng tính chu kỳ nhiệt là: Ct = 18,25 Điều chứng tỏ nồng độ RNA-HCV đích cao Mẫu xét nghiệm Mẫu chuẩn dƣơng 106 104 102 Chứng nội Chứng âm Hình 4.2 Kết chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính cao dạng linear Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan số chu kỳ tín hiệu huỳnh quang 102, 104, 106: nồng độ tương ứng 102, 104, 106; S: mẫu xét nghiệm cần định lượng; Ox: nồng độ, Oy: số chu kỳ 29 Kết dƣơng tính đƣợc nhân với 150, từ tính đƣợc hàm lƣợng khuếch đại số copies/ml máu 5,33 x 107 copies/ml Kết sau nhân với 150 lớn nhiều so với x 102 nên mẫu dƣơng tính cao 106 Mẫu chuẩn dƣơng Mẫu xét nghiệm 104 102 Chứng nội Chứng âm Hình 4.4 Kết chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính trung bình Dựa vào đồ thị biểu diễn dạng linear để phân tích kết Định lƣợng nồng độ RNA-HCV phải dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nồng độ 102, 104, 106 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính xây dựng dựa vào nồng độ Tại chu kỳ khác thiết bị ghi nhận huỳnh quang tƣơng ứng chu kỳ đó, đƣờng thẳng qua điểm giao chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phƣơng trình hồi quy tuyến tính cần dựng Ngƣỡng định lƣợng x 102 copies/ml Chọn kênh huỳnh quang “FAM” cho giếng chuẩn dƣơng, mẫu chứng âm.Ngƣỡng định lƣợng x 102 copies/ml Các thông số standard: hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 0,996, hiệu suất nhân 98,0%, hệ số dốc – Slope -3,324 đạt yêu cầu tiến hành lấy kết Chứng âm cho kết âm, chứng tỏ q trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Mẫu xét nghiệm cho kết dƣơng tính chu kỳ nhiệt là: Ct = 32,5 Kết dƣơng tính đƣợc nhân với 150, từ tính đƣợc hàm lƣợng khuếch đại số copies/ml máu là: 3,25 x105 copies/ml Kết sau nhân với với 150 lớn x 102 nên mẫu dƣơng tính trung bình 30 4.1.1.3 Mẫu dƣơng tính yếu 106 Mẫu chuẩn dƣơng 104 Mẫu xét nghiệm 102 Chứng âm Chứng nội Hình 4.5 Kết chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính yếu Ngƣỡng định lƣợng x 102 copies/ml Định lƣợng nồng độ tác nhân phải dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nồng độ 102, 104, 106 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính đƣợc xây dựng dựa vào nồng độ Tại chu kỳ khác thiết bị ghi nhận huỳnh quang tƣơng ứng chu kỳ đó, đƣờng thẳng qua điểm giao chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phƣơng trình hồi quy tuyến tính cần dựng Chọn kênh huỳnh quang “FAM” cho giếng chuẩn dƣơng, mẫu chứng âm Các thông số standard cho kết hệ số tƣơng quan R2 0,999, hiệu suất nhân 98,0%, hệ số dốc – Slope -3,324 đạt yêu cầu tiến hành lấy kết Chứng âm cho kết âm, chứng tỏ q trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Mẫu xét nghiệm cho kết dƣơng tính chu kỳ nhiệt là: Ct = 32,1 Chứng tỏ nồng độ RNA-HCV đích huyết thấp Bỏ kênh huỳnh quang “FAM” chọn kênh huỳnh quang “HEX” Lúc chứng nội có đƣờng biểu diễn tuyến tính cắt đƣờng chứng tỏ DNA chứng nội hoạt động Kết dƣơng tính đƣợc nhân với 150, từ tính đƣợc hàm lƣợng khuếch đại số copies/ml máu là: 4,1 x103 copies/ml Kết sau nhân với với 150 lớn 3x102 nên mẫu dƣơng tính yếu Vậy mẫu dƣơng tính với nồng độ 4,1 x 103 copies/ml 31 4.1.2 Phân tích kết mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng 106 Mẫu chuẩn dƣơng Chứng nội 104 102 Mẫu xét nghiệm Chứng âm Hình 4.6 Kết chạy real-time PCR mẫu dƣơng tính dƣới ngƣỡng Ngƣỡng định lƣợng x 102 copies/ml Định lƣợng nồng độ tác nhân phải dựa vào đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng nồng độ 102, 104, 106 Phƣơng trình hồi quy tuyến tính đƣợc xây dựng dựa vào nồng độ Tại chu kỳ khác thiết bị ghi nhận huỳnh quang tƣơng ứng chu kỳ đó, đƣờng thẳng qua điểm giao chu kỳ tín hiệu huỳnh quang phƣơng trình hồi quy tuyến tính cần dựng Chọn kênh huỳnh quang “FAM” cho giếng chuẩn dƣơng, mẫu chứng âm Các thông số standard: hệ số tƣơng quan tuyến tính R2 1,000, hiệu suất nhân bảnbằng 99,6%, hệ số dốc – Slope -3,436 đạt yêu cầu tiến hành lấy kết Chứng âm cho kết âm, chứng tỏ q trình xét nghiệm khơng bị ngoại nhiễm Bỏ kênh huỳnh quang “FAM” chọn kênh huỳnh quang “HEX” Lúc chứng nội có đƣờng biểu diễn tuyến tính cắt đƣờng chứng tỏ DNA chứng nội hoạt động Mẫu xét nghiệm cho kết dƣơng tính sau chu kỳ nhiệt 36 nên đƣợc cho dƣơng tính dƣới ngƣỡng nghĩa tín hiệu huỳnh quang mà thiết bị huỳnh quang ghi nhận dƣới ngƣỡng tín hiệu để có khả định lƣợng Kết dƣơng tính nhỏ x 102 copies/ml nên định lƣợng đƣợc nồng độ mẫu sau chạy phản ứng real-time PCR 32 4.1.3 Phân tích kết mẫu âm tính 106 Mẫu chuẩn dƣơng 104 Chứng nội 102 Mẫu xét nghiệm Chứng âm Hình 4.7 Kết chạy real-time PCR mẫu âm tính Ở kênh huỳnh quang “FAM” Chứng âm cho kết âm, chứng tỏ trình xét nghiệm không bị ngoại nhiễm Mẫu xét nghiệm cho kết âm tính Bỏ kênh huỳnh quang “FAM” chọn kênh huỳnh quang “HEX” Lúc chứng nội có đƣờng biểu diễn tuyến tính cắt đƣờng chứng tỏ DNA chứng nội hoạt động chứng minh mẫu không bị ức chế Kết luận mẫu âm tính 4.2 Phân tích kết mẫu chạy kiểu gien HCV Sau kết thúc trình real-time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết Tùy thuộc máy, phân tích đồ thị dạng “Linear” dạng “Log” hai Trong tube iVA HCV Genotype 1-6 rPCR mix, probe phát kiểu gien đƣợc đánh dấu với màu HEX, probe phát kiểu gien đƣợc đánh dấu với màu FAM Trong tube iVA HCV Genotype 2-3 rPCR mix, probe phát kiểu gien đƣợc đánh dấu với màu FAM, probe phát kiểu gien đƣợc đánh dấu với màu HEX 33 4.2.1 Kiểu gien Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn kiểu gien 1, 2, 3, 6: Kiểu gien 1, 2, 3, 6; D: Chứng âm Chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn huỳnh quang tuyến tính vƣợt tín hiệu (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) màu “FAM” với kiểu gien - màu “HEX” với kiểu gien - 3, chứng âm có đƣờng biểu diễn thẳng khơng vƣợt qua tín hiệu (đƣờng biểu diễn âm tính) với hai màu Thí nghiệm đạt yêu cầu tiếp tục phân tích kết Chọn kênh huỳnh quang “HEX” Kiểu gien dƣơng tính rõ cắt baseline Ct = 30,6 Kiểu gien âm tính Bỏ kênh huỳnh quang “HEX” chọn kênh huỳnh quang “FAM” Kiểu gien 6, kiểu gien âm tính 4.2.2 Kiểu gien Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn kiểu gien 1, 2, 3, 6: Kiểu gien 1, 2, 3, 6; D: Chứng âm 34 Chứng dƣơng có đƣờng biểu diễn huỳnh quang tuyến tính vƣợt q tín hiệu (đƣờng biểu diễn dƣơng tính) probe đánh dấu màu “FAM” với kiểu gien - probe đánh dấu màu “HEX” với kiểu gien - 3, chứng âm có đƣờng biểu diễn thẳng khơng vƣợt qua tín hiệu (đƣờng biểu diễn âm tính) với hai màu Thí nghiệm đạt yêu cầu tiếp tục phân tích kết Chọn kênh huỳnh quang “FAM” Kiểu gien dƣơng tính rõ thể tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vƣợt khỏi tín hiệu cắt baseline Ct = 35,9, kiểu gien âm tính Bỏ kênh huỳnh quang “FAM” chọn kênh huỳnh quang “HEX” Kiểu gien 1, kiểu gien âm tính tín hiệu huỳnh quang khơng vƣợt qua khỏi tín hiệu Kết luận mẫu nhiễm kiểu gien 4.3 Tình hình nhiễm HCV Bệnh viện 175 Dương tính Dương tính ngưỡng Âm tính 14% 18% 68% Hình 4.11 Biểu đồ phân bố nhiễm HCV Bệnh viện 175 Theo kết nghiên cứu thu đƣợc số 28 bệnh nhân có anti-HCV dƣơng đƣợc thực xét nghiệm real-time PCR có trƣờng hợp bao gồm dƣơng tính dƣơng tính dƣới ngƣỡng chiếm tỷ lệ 32%, 18 trƣờng hợp âm tính chiếm tỷ lệ 68% Theo kết nhóm thực RNA-HCV, ta thấy có 32% trƣờng hợp antiHCV dƣơng có mang RNA-HCV, chứng minh có mang vi rút dạng hoạt động Các trƣờng hợp anti-HCV dƣơng, RNA-HCV âm do: bệnh nhân nhiễm khỏi bệnh, kháng thể tồn Kết nghiên cứu thu đƣợc có tỷ lệ dƣơng tính 32% Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Tuyết Vân (2007), nghiên cứu 85 mẫu huyết cho kết tỷ lệ nhiễm RNA-HCV 82% Sở dĩ có kết nghiên cứu có tỷ lệ dƣơng tính khác nhƣ do: 35 Đối tƣợng nghiên cứu khác Trong đề tài thực nghiên cứu bệnh nhân có anti-HCV dƣơng Bệnh viện 175, bệnh nhân không rõ nguyên nhân thời gian bị nhiễm HCV Còn nghiên cứu Nguyễn Thị Tuyết Vân đối tƣợng phạm nhân nghiện chích ma túy trại giam Đăk Trung, Gia Trung Trung tâm giáo dục xã hội Tây Nguyên biết rõ thông tin Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), đối tƣợng nguy nhiễm HCV đối tƣợng tiêm chích ma túy thuộc đối tƣợng nhiễm lây nhiễm HCV cao Sự thiết kế mồi mẫu dòcả hai nghiên cứu dựa vào vùng 5’NC Tuy nhiên, kỹ thuật nghiên cứu Nguyễn Thị Tuyết Vân RT-PCR, nghiên cứu real-time RT-PCR Theo Phạm Hùng Vân (2008), kỹ thuật realtime PCR có độ nhạy tin cậy cao RT-PCR Ngồi định tính kỹ thuật realtime PCR cho biết lƣợng copies theo thời gian thật (real-time) Số mẫu nghiên cứu Bệnh viện 175 28 mẫu huyết Số mẫu tƣơng đối so với số mẫu nghiên cứu Nguyễn Thị Tuyết Vân 85 mẫu huyết thanh.Với số mẫu 28 chƣa có ý nghĩa mặt thống kê Ý nghĩa mặt dịch tễ học: nƣớc ta nƣớc phát triển, chƣa đầy đủ hạ tầng sở y tế cộng đồng, kế hoạch dự phòng nhiễm HCV chƣa đƣợc trọng Giáo dục cố vấn kiến thức bệnh đối tƣợng nguy để ngăn ngừa lây nhiễm chƣa cao Bệnh viêm gan C diễn biến âm thầm, ngƣời nhiễm siêu vi C lây nhiễm cộng đồng khơng biết nhiễm mắc bệnh viêm gan HCV 4.4 Kết xác định kiểu gien HCV Trong mẫu huyết dƣơng tính RNA-HCV có nồng độ ≥ x 102 copies/ml mang định kiểu gien cho kết dƣới Bảng 4.1 Kết định kiểu gien HCV Kiểu gien HCV Số lƣợng 3 Tổng 36 Số lƣợng bệnh nhân nhiễm kiểu gien trƣờng hợp số lƣợng bệnh nhân nhiễm kiểu gien 1, khơng có trƣờng hợp nhiễm kiểu gien kiểu gien Theo kết nhƣ trình bày bảng 4, Với kiểu gien kiểu gien khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời chiếm tỷ lệ cao trƣờng hợp tái phát Kiểu gien thƣờng gặp vùng Đông Nam Á nên khả đáp ứng điều trị đặc hiệu chƣa có nhiều nghiên cứu Vùng xác định kiểu gien HCV mà Việt Á sử dụng để thiết kế mồi mẫu dò vùng 5’NC Theo Phạm Hùng Vân (2008) vùng bảo tồn gien HCV nhạy cảm cho chẩn đốn Cơng ty Nam Khoa lựa chọn vùng để định lƣợng định kiểu gien Nguyên tắc định kiểu gien mà Nam Khoa thực kết hợp real-time PCR giải trình tự vùng 5’NC sau so sánh với ngân hàng liệu NCBI Phƣơng pháp cho kết xác nhiên tốn thời gian chẩn đoán dài (24 giờ) Trong đó, Việt Á sử dụng mẫu dò đặc hiệu mồi đặc hiệu định kiểu gien cách nhanh chống (3 giờ) Số lƣợng mẫu 4, chƣa thỏa mãn số lƣợng thống kê Tuy nhiên theo số nghiên cứu số lƣợng mẫu lớn phân bố kiểu gien nhƣ sau: theo Nguyễn Thanh Hảo ctv, thực 123 đối tƣợng cho máu tình nguyện, số ngƣời nhiễm kiểu gien HCV kiểu gien 1: 86 ngƣời; kiểu gien 6: 37 ngƣời Phòng thí nghiệm NKBiotek năm 2008 có kết 2000 mẫu huyết đƣợc gửi làm xét nghiệm định kiểu gien kiểu gien có 1160 ca, kiểu gien 340 ca, lại kiểu gien kiểu gien (trích dẫn Phạm Hùng Vân, 2008) Tóm lại, kiểu gien phổ biến vi rút Việt Nam kiểu gien kiểu gien Về phƣơng diện điều trị, kiểu gien đƣợc xem nhƣ yếu tố tiên đoán cho việc đáp ứng với trị liệu interferon đơn có phối hợp với ribavirin Thời gian điều trị kiểu gien 48 tháng Kiểu gien đƣợc tìm hiểu nên chƣa thiếu thơng tin tiên lƣợng đáp ứng điều trị thời gian điều trị 37 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Quy trình chẩn đốn viêm gan C kỹ thuật real-time PCR sử dụng Taqman probe với probe phát tác nhân gây bệnh đƣợc đánh màu FAM probe phát chứng nội đƣợc đánh dấu màu HEX phát đƣợc ca nhiễm RNA-HCV chiếm tỷ lệ 32% số 28 ca đƣợc chẩn đốn có anti-HCV dƣơng tính Quy trình khơng xảy tƣợng ngoại nhiễm nhiễm chéo mẫu Quy trình đƣợc áp dụng cho định kiểu gien HCV cho kết có trƣờng hợp nhiễm kiểu gien có trƣờng hợp nhiễm kiểu gien Khơng có trƣờng hợp nhiễm kiểu gien kiểu gien 5.2 Đề nghị Các nhận xét bƣớc đầu dựa 28 trƣờng hợp nghiên cứu, có điều kiện xin đƣợc tiếp tục đƣợc nghiên cứu với với số lƣợng lớn để có đƣa nhận xét khách quan 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Ngọc Bảo 2000 Chƣơng 3: dịch tễ học nhiễm siêu vi viêm gan C Trong “Viêm gan siêu vi C – Từ cấu trúc siêu vi đến điều trị” Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, trang 42 – 45 Nguyễn Hồng Chƣơng 2005 Xây Dựng Quy Trình Định Lƣợng Vi rút Viêm Gan Siêu Vi C (HCV) Bằng Kỹ Thuật Real-time RT-PCR (reverse transcription polemerase chain reaction) Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học, Đại Khoa Học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng 2008 Sinh học phân tử, tái lần Nhà xuất giáo dục, Tp Hồ Chí Minh, trang 196 - 209 Bùi Hữu Hồng 2000 Chƣơng 1: cấu trúc tính biến dị di truyền siêu vi viêm gan C Trong “Viêm Gan Siêu Vi C - Từ cấu trúc siêu vi đến điều trị” Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, trang - 23 Trƣơng Thị Xuân Liên 1994 Tình hình nhiễm virus Viêm Gan C Thành phố Hồ Chí Minh.Luận Văn phó tiến sĩ chuyên ngành sinh học vi sinh, Khoa Học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thanh Thảo 2006 Vi-rút học Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, trang 177 - 198 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải 2008 Những Kỹ Thuật PCR ứng dụng phân tích Nhà xuất Khoa Học Tự Nhiên Công Nghệ, Hà Nội, trang 28 - 40, 404 - 437 Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR - Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, trang 34 - 67, 95 - 108 Nguyễn Thị Tuyết Vân 2007 Tình hình nhiễm virus viêm gan C ngƣời nghiện chích ma túy trại giam Đăk Trung, Gia Trung Trung tâm giáo dục xã hội Tây Nguyên Luận văn thạc sĩ y học, Đại Học Y Dƣợc Tp Hồ Chí Minh TÀI LIÊU TIẾNG ANH 10 Brechot C 1995 Virus de I’hépatite C: structure et variabilité génétique – Méd Mal In – fect Special P 1056 – 1066 39 11 WHO 1999 Hepatitis C: global prevalence, Weekly Epidermiological Record, 72(46) 12 Philippe Halfon, Marc Bourlière, Guillaume Pénaranda, Hacène Khiri, and Denis Ouzan4 2006 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY “Real-Time PCR Assays for Hepatitis C Virus (HCV) RNA Quantitation Are Adequate for Clinical Management of Patients with Chronic HCV Infection”, p 2507 - 2511 13 Philippe Halfon, Christa Roubicek, Alter, Victoria Gerolami, Yves Quentin, Hacene Khiri, Gérad Pepe and Yvon Berland, Apr 2002 Journal of clinical microbiology, “Use of Phylogenetic Analysis of Hepatitis C Virus (HCV) Hypervariable Region Sequences To Trace an Outbreak of HCV in an Autodialysis Unit”, p 1541–1545 TÀI LIÊU WEB 14 http://www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm Truy cập ngày 12/04/2012 15 http://www.epgonline.org/hepatitiskiểu gien.aspx Truy cập Ngày 12/04/2012 16 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Hepatitis_C_virus_patients.aspx Truy cập ngày 12/04/2012 17 http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/3n_.E1.BB.A9ng.html Truy cập ngày 10/05/2012 18 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/index.html Truy cập ngày 12/05/2012 19 http://www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm Truy cập ngày 13/05/2012 20 http://www.nathnac.org/pro/factsheets/hep_c.htm Truy cập ngày 12/06/2012 21 http://www.ahvinhnghiem.org/images/ViemganC.jpg 13/05/2012 40 Truy cập ngày ... RÚT VIÊM GAN C TẠI BỆNH VIỆN 175 Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS VŨ BẢO CHÂU HUỲNH THÁI QUI CN CHU THỊ THU HÀ Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên xin gửi lời cám ơn đến cha mẹ ngƣời thân... lớp DH08SH bạn bè cổ vũ, động viên suốt q trình học tập Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2012 Huỳnh Thái Qui i TÓM TẮT Bệnh viêm gan siêu vi vi rút viêm gan C (Hepatitis C virus – HCV) bệnh nguy hiểm tác... hợp nhiễm Ngoài ra, HCV xảy bệnh nhân chƣa đƣợc truyền máu khơng có yếu tố nguy rõ rệt HCV có khuynh hƣớng diễn tiến sang mạn tính làm cho nguồn dự trữ bệnh cộng đồng mức cao 2.1.2 Dịch tễ học