ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 ( PCV2 )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE (PCV2) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : VÕ TẤN LỰC Niên khóa : 2007 – 2011 Tháng năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR SỬ DỤNG EVAGREEN ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PORCINE CIRCOVIRUS TYPE (PCV2) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS TRẦN THỊ DÂN VÕ TẤN LỰC KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng năm 2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin bày tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ người thân gia đình tạo điều kiện động viên suốt trình học tập Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, ban chủ nhiệm môn Công nghệ sinh học tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập trường PGS.TS Trần Thị Dân KS Võ Khánh Hưng tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt q trình thực khóa luận Các thầy cô anh chị Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học Môi trường – trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt nghiệp Thầy Phạm Hùng Vân, chị Trang anh, chị công ty Nam Khoa giúp đỡ em hồn thành khóa luận Tập thể lớp Cơng nghệ sinh học khóa 2007 bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình học tập thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn đến bạn Trâm Anh luôn động viên, giúp đỡ dành cho tơi tình cảm tốt đẹp Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2011 Võ Tấn Lực iii TÓM TẮT Hội chứng gầy còm heo sau cai sữa (Post-weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS) bệnh bật gần heo sau cai sữa, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho chăn nuôi heo giới Ở Việt Nam, mẫu hạch heo thu thập từ trại chăn nuôi công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh tỉnh lân cận kiểm tra kỹ thuật PCR, kết có 36% mẫu dương tính với PCV2 gây PMWS Đồng thời tỷ lệ mẫu máu có kháng thể chống PCV2 có chiều hướng tăng dần qua năm, cụ thể năm 2000 38,97%, từ năm 2003 - 2004 84,9%, năm 2005 90,26% Vì chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình real-time PCR sử dụng EvaGreen nhằm định tính định lượng vi-rút máu heo sau cai sữa, góp phần kiểm sốt bệnh PMWS trại Vùng gen ORF1 chèn vào plasmid, dùng hệ thống tế bào chủ E.coli DH5α khuếch đại vùng gen Sau ly trích tinh plasmid chứa vùng gen ORF1, sản phẩm plasmid tinh chèn đoạn gen đích sử dụng để xây dựng đường chuẩn cho phương pháp real-time PCR Trong nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp real-time PCR sử dụng EvaGreen để kiểm tra 19 mẫu máu heo sau cai sữa, kết cho thấy 18 19 mẫu cho kết dương tính với PCV2 số ban đầu mẫu cao, 104 – 105 sao/ml máu iv SUMMARY Research title: Use of EvaGreen - based real-time PCR assay to detect and quantify porcine circovirus type (PCV2) Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) was a recently emerged disease of nursery pigs, caused serious economic loss for the swine industry in the world In Vietnam, samples lymph of node collected from four intensive farms at Ho Chi Minh city and some surrounding provinces were tested by PCR assay The results were 36 percent of samples positive to PCV2 The proportion of blood sample having antibody against the virus also increased in several years In 2000, that was 38,9%; then 84,9% from 2003 to 2004, and 90,26% in 2005 Thus, we constructed real-time PCR procedure using EvaGreen to detect and quantify it in blood of the nursery pigs that helped control PMWS at intensive farms ORF1 was inserted into plasmid, and then host cell E.coli DH5α was used to amplify it The plasmid containing ORF1 was extracted The purified plasmid that was inserted the target gene was used to construct standard curve for real-time PCR assay In this study we applied real-time PCR assay to test 19 blood samples of nursery pigs, the results showed 18 of 19 samples being positive to PCV2 and the DNA copies number of these samples was quite high, about 10 - 105 copies/ml blood v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung thực đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu hội chứng gầy còm heo sau cai sữa 2.1.1 Dịch tễ học PCV2 2.1.2 Triệu chứng bệnh tích PMWS 2.1.2.1 Triệu chứng PMWS 2.1.2.2 Bệnh tích PMWS 2.2 Porcine circovirus type – vi-rút gây hội chứng PMWS 2.3 Các phương pháp chẩn đoán PMWS 2.4 Tổng quan phương pháp PCR real-time PCR 2.4.1 Phương pháp PCR 2.4.1.1 Nguyên tắc phương pháp PCR 2.4.1.2 Các thành phần phản ứng PCR 2.4.1.3 Các bước phản ứng 2.4.1.4 Ưu nhược điểm 2.4.2 Phương pháp real-time PCR .10 2.4.2.1 Khái niệm phương pháp real-time PCR 10 2.4.2.2 Nguyên tắc phương pháp real-time PCR 10 vi 2.4.2.3 Nguyên lý hoạt động hệ thống real-time PCR 11 2.4.2.4 Hóa chất phương pháp real-time PCR .11 2.4.2.5 Nguyên lý định lượng kỹ thuật real-time PCR .16 2.4.2.6 Phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy .18 2.4.2.7 Ưu nhược điểm phương pháp real-time PCR 19 2.4.2.8 Ứng dụng phương pháp real-time PCR 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Vật liệu 20 3.2.1 Mẫu 20 3.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ dùng cho phản ứng PCR real-time PCR .20 3.2.3 Hóa chất 21 3.3 Phương pháp nghiên cứu .22 3.3.1 Thu mẫu bảo quản mẫu 22 3.3.2 Ly trích DNA 22 3.3.3 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 23 3.3.3.1 Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ORF1 24 3.3.3.2 Thực phản ứng nối (ligation) 26 3.3.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp E.coli DH5α phương pháp calcium chloride 27 3.3.3.4 Biến nạp plasmid pGEM-T Easy chèn DNA đích vào tế bào khả nạp 28 3.3.3.5 Chọn lọc tế bào biến nạp plasmid DNA 28 3.3.3.6 Tách chiết plasmid DNA 28 3.3.3.7 Kiểm tra plasmid DNA PCR 29 3.3.3.8 Kiểm tra plasmid DNA phương pháp giải trình tự 30 3.3.3.9 Pha loãng plasmid DNA 30 3.3.4 Thực phản ứng real-time PCR 31 3.3.4.1 Chuẩn bị hỗn hợp để chuẩn bị thực phản ứng real-time PCR 32 3.3.4.2 Thiết lập chương trình real-time PCR phần mềm máy CFX96 33 3.3.4.3 Phân tích kết .33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR 35 4.1.1 Sản phẩm PCR 492 bp ORF1 .35 vii 4.1.2 Vi khuẩn E.coli DH5α chứa plasmid chèn đoạn gen đích 36 4.1.2.1 Ly trích plasmid DNA từ khuẩn lạc chọn lọc 36 4.1.2.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn gen đích 36 4.1.2.3 Kiểm tra đoạn gen đích chèn vào plasmid .37 4.2 Kết thực real-time PCR 38 4.3 Kết phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy 40 4.4 Ứng dụng real-time PCR sử dụng EvaGreen mẫu thực tế .41 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair CV Coefficient of variation Ct Threshold cycle dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate GMO Genetically modified organism IHC Immunohistochemistry IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside ISH In situ hybridisation LB Luria bertani OD Optical density ORFs Open reading frames PCR Polymerase chain reaction PCV Porcine circovirus virus PCV1 Porcine circovirus virus type PCV2 Porcine circovirus virus type PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome PK-15 Pig kidney-15 PMWS Post-weaning multisystemic wasting syndrome PRDC Porcine respiratory disease complex PRRSV Porcine respiratory and reproductive syndrome virus RF Replicate form SD Standard deviation SNP Single nucleotide polymorphism SQ Starting quantity TBE Tris borate EDTA Tm Melting temperature ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần hóa chất phản ứng PCR sử dụng iAdvance iVAPCR Mastermix.25 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2-492F, PCV2-492R .26 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng ligation 27 Bảng 3.4 Thành phần hóa chất phản ứng PCR sử dụng PCR Master Mix 2X 29 Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2-83F, PCV2-83R 30 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng real-time PCR sử dụng EvaGreen qPCR Mastermix 32 Bảng 4.1 Số lượng ban đầu mẫu chuẩn với lần lập lại .40 Bảng 4.2 Phân tích biến động giá trị Ct nồng độ chuẩn 40 Bảng 4.3 Độ lệch chuẩn số ban đầu 19 mẫu thực tế .42 Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại 19 mẫu thực tế .44 x real-time PCR Một thông số khác biểu đồ đường chuẩn quan trọng hiệu khuếch đại (E%) Trong thí nghiệm này, hiệu khuếch đại 134,7% vượt ngưỡng tối ưu phản ứng real-time PCR 90 - 105% (Phạm Hùng Vân, 2002), chứng tỏ thao tác hút hòa chất chưa xác Một phản ứng PCR đạt lý tưởng sau chu kỳ nhiệt, cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng gấp đơi, ngun nhân DNA đích nhân đơi sau chu kỳ, chu kỳ ngưỡng khoảng tương ứng Các kết thu nhận bảng 4.1 cho thấy, chu kỳ phát mẫu chuẩn tốt, khoảng chu kỳ, đặc biệt từ chuẩn đến chuẩn 3, có trường hợp từ chuẩn đến chưa thực tốt gần chu kỳ Bảng 4.1 Số ban đầu mẫu chuẩn với lần lặp lại Mẫu Ct trung bình Sq (bản sao/ phản ứng) Mẫu chuẩn 16,53 106 Mẫu chuẩn 19,84 105 Mẫu chuẩn 22,84 104 Mẫu chuẩn 24,52 103 Chứng âm N/A N/A Sq: số ban đầu, N/A: âm tính (hay ngưỡng phát hiện) Bảng 4.2 Phân tích biến động giá trị Ct nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn plasmid ( sao/ phản ứng) 106 105 104 103 Trung bình 16,53 19,84 22,84 24,52 Ct SD 0,085 0,07 0,092 0,094 SD: Độ lệch chuẩn chuẩn plasmid, CV: hệ số biến động CV (%) 0,514 0,352 0,406 0,385 Độ lệch chuẩn chu kỳ ngưỡng nồng độ chuẩn plasmid DNA khơng có chênh lệch lớn chủ yếu nằm khoảng 0,07 đến 0,094, đồng thời phân tích biến động chuẩn plasmid DNA, nhận thấy hệ số biến động (CV) giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) chuẩn plasmid nằm 0,385% đến 0,514%, chứng tỏ độ lặp lại chuẩn cao (bảng 4.2) 4.3 Kết phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy Phân tích đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy chuẩn, chúng tơi nhận thấy ngồi sản phẩm đặc hiệu với nhiệt độ nóng chảy từ 80 - 80,60C, có 40 sản phẩm khuếch đại khơng đặc hiệu với nhiệt độ nóng chảy khoảng 73,6 – 74,60C Điều tượng nhị trùng đoạn mồi (hình 4.8) Những sản phẩm phụ không đặc hiệu nguyên nhân dẫn đến hiệu khuếch đại đạt 134,7% (vượt ngưỡng cho phép), bên cạnh sản phẩm đặc hiệu đoạn mồi khuếch đại trình tự đích, có sản phẩm khơng đặc hiệu q trình khuếch đại đoạn mồi tự bắt cặp với tạo nhị trùng đoạn mồi Vì màu nhuộm huỳnh quang EvaGreen bắt cặp lên tất mạch đơi DNA, tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ EvaGreen tín hiệu từ sản phẩm đặc hiệu sản phẩm không đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Hình 4.8 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy chuẩn : Chuẩn 1; : Chuẩn 2; : Chuẩn 3; :Chuẩn 4.4 Ứng dụng real-time PCR sử dụng EvaGreen để định lượng mẫu thực tế Tiến hành ly trích DNA từ 19 mẫu thực tế, sau chạy real-time PCR với cặp mồi PCV-83F VÀ PCV-83R đồng thời chạy kèm với mẫu chuẩn Hình 4.9 cho thấy mẫu thực tế dương tính trừ mẫu cho kết âm tính Những mẫu dương tính có đường biểu diễn huỳnh quang vượt qua đường mẫu âm tính có đường biểu diễn nằm đường Số ban đầu mẫu thực tế định lượng dựa biểu đồ đường chuẩn thể mối quan hệ log10 số ban đầu chu kỳ ngưỡng (hình 4.10) 41 Hình 4.9 Biểu đồ khuếch đại mẫu xét nghiệm, mẫu chuẩn chứng âm : Chuẩn 1, : Chuẩn 2, : Chuẩn 3, : Chuẩn : Mẫu dương tính, : Chứng âm, : Mẫu âm tính Hình 4.10 Biểu đồ đường chuẩn mẫu chuẩn kèm với mẫu thực tế : chuẩn ; : mẫu thực tế Sau hai lần lặp lại, độ lệch chuẩn chu kỳ ngưỡng số ban đầu 19 mẫu thực tế tóm tắt qua bảng 4.3 Bảng 4.3 Độ lệch chuẩn số ban đầu 19 mẫu thực tế Mẫu thực tế Ct trung bình SD chu kỳ ngưỡng Sq trung bình (bản sao/phản ứng) Sq trung bình (bản sao/ml)* (1) (2) 26,37 24,14 25,06 24,52 23,28 (3) 0,282 0,113 0,191 0,282 0,481 (4) 3,09 102 2,05 103 9,38 102 1,5 103 4,44 103 (5) 6,18 104 4,1 105 18,76 104 105 8,88 105 42 Bảng 4.3(tt) Độ lệch chuẩn số ban đầu 19 mẫu thực tế (1) 11 12 13 14 15 16 17 18 19 10 (2) 25,17 25,01 24,16 25,84 24,17 24,32 26,61 36,95 25,89 26,27 25,01 25,85 24,82 N/A (3) 0,12 0,071 0,134 0,374 1,682 0,035 1,513 0,091 0,183 0,791 0,042 0,622 0,254 - (4) 8,5 102 9,76 102 2,01 103 4,9 102 7,24 102 1,74 103 3,59 102 0,036 4,61 102 3,7 102 9,74 102 5,1 102 1,15 103 - (5) 17 104 19,52 104 4,02 105 9,6 104 14,48 104 3,49 105 7,19 104 7,18 9,22 104 7,41 104 1,95 105 10,2 104 2,31 105 - N/A: âm tính hay ngưỡng phát hiện, Ct: Chu kỳ ngưỡng, Sq: Số ban đầu, SD: độ lệch chuẩn chu kỳ ngưỡng, *: tính tốn theo cơng thức Sq trung bình (bản sao/ml) = Sq trung bình (bản sao/ phản ứng) 200, với 200 hệ số thu hồi sau tách chiết mẫu Kết định lượng mẫu thực tế thể qua bảng 4.3 Trong 19 mẫu thực tế kiểm tra có 18 mẫu cho kết dương tính với PCV2, đặc biệt mẫu số nhiễm PCV2 nặng mẫu khác với chu kỳ ngưỡng lên sớm 23,28 số trung bình 8,88 105 (bản sao/ml máu) Riêng mẫu số 10 cho kết âm tính, đường biểu diễn khuếch đại nằm đường Độ lệch chuẩn chu kỳ ngưỡng mẫu thấp, qua cho thấy khả định lượng xác độ lập lại cao Sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu Hình 4.11 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy mẫu thực tế :Mẫu dương tính; : Mẫu âm tính; 43 : Mẫu chuẩn Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại mẫu dương tính xuất đỉnh đường cong nhiệt độ nóng chảy nhiệt độ nằm khoảng nhiệt độ nóng chảy mẫu chuẩn (80 – 80,60C) Mẫu âm tính số 10 khơng xuất đỉnh đường cong nhiệt độ nóng chảy (hình 4.11) Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại 19 mẫu thực tế Mẫu Mẫu chuẩn 11 12 13 14 15 Nhiệt độ nóng chảy Tm ( 0C) 80 - 80,6 80,2 80,4 80,4 80,2 80,4 80,3 80,2 80,2 80,2 80,2 80,2 80,1 80,1 80,4 16 17 18 19 10 80,3 80,3 80,4 80,3 - Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại từ mẫu dương tính tương đương với mẫu chuẩn hay nói cách khác, sản phẩm khuếch đại mẫu thực tế chuẩn có chiều dài tương tự Các kết từ đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy (hình 4.11) phù hợp với kết biểu đồ khuếch đại (hình 4.9), điều chứng tỏ kết phản ứng real-time PCR sử dụng EvaGreen xác 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bước đầu áp dụng quy trình chèn vùng gen ORF1 vào plasmid, sau biến nạp vào tế bào chủ E.coli DH5α Tiến hành nuôi cấy chọn lọc tế bào chủ mang đoạn gene đích, tạo sở để xây dựng đường chuẩn cho phản ứng real-time PCR Thực phản ứng real-time PCR với đường chuẩn xây dựng được, đường chuẩn có độ tuyến tính cao độ lặp lại cao (hệ số biến động chu kỳ ngưỡng thấp, CV từ 0,385% đến 0,514%) tiền đề để ứng dụng quy trình real-time PCR để định lượng vi-rút PCV2 diện máu heo sau cai sữa, kết cho thấy có 18 19 mẫu dương tính PCV2 5.2 Đề nghị Xác định số tối thiểu PCV2 phương pháp real-time PCR 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Lê Hồng Hạnh 2005 Phát porcine circovirus type kĩ thuật PCR heo nghi mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa heo còi ngun nhân khác Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư Chăn nuôi thú y, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Phạm Thị Mỹ Hạnh 2005 Phát định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV)trên tôm sú (Penaeus monodon) kĩ thuật Real-time PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Lâm Thị Thu Hương, Đường Chi Mai, Trần Hoàng Vũ 2005 Bước đầu ghi nhận diện porcine circovirus type heo biểu còi số trại heo cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh vùng phụ cận Tạp chí Khoa học kĩ thuật Nông Lâm Nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp.HCM, số 3/2005 Nguyễn Thái Thủy 2008 PCR real-time PCR Bio-Rad Laboratories VN Phạm Thị Huyền Trang 2010 Khảo sát nhiễm PCV2 loại mẫu: huyết thanh, hạch phân từ heo còi kic thuật PCR Khóa luận tốt nghiệp kĩ sư Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Trưởng 2005 Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gene phương pháp Real-time PCR Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Phạm Hùng Vân 2002 PCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng nước 10 Applied Biosystems 2003 Creating standard curves with genomic DNA or plasmid DNA templates for use in quantitative PCR 11 Chae C 2003 Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis and pathology The Veterinary Journal 168: 41–49 12 Crowther R A., Berriman J A., Curran W L., Allan G M and Todd D 2003 Comparison of the structures of three Circoviruses: chicken anemia virus, porcine circovirus type 2, and beak and feather disease virus Journal of Virology, 13036–13041 13 Cao S., Chen H., Zhao J., Lu J., Xiao S., Jin M., Guo A., Wu B and He Q 2005 Detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus and porcine pseudorabies virus from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by multiplex PCR Veterinary Research Communications 29: 263-269 14 Darwich L., Segal´ J., and Mateu E 2004 Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome caused by porcine circovirus 2: an immune riddle Archives Virology 149: 857–874 46 15 Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P G., Elvinger F and Meng X J 2004 A chimeric porcine circovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic PCV type (PCV2) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pig Journal of Virology, 6297–6303 16 Grierson S S., King D P., Sandvik T., Hicks D., Spencer Y., Drew T.W., and Banks M 2004 Archives Virology 149: 1171–1183 17 Guo Long J, Lu Yue H, Wei Yan W, Huang Li P, Liu Chang M 2010 Porcine circovirus type (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China Journal Virology 7: 273 18 Hamel Andre L., Lin Lihua L., and Nayar Gopi P.S 1998 Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs Journal of Virology, 5262–5267 19 Lefebvre D J., Costers S., Doorsselaere J Van, Misinzo G., Delputte P L and Nauwynck H J 2008 Antigenic differences among porcine circovirustype strains, as demonstrated by the use of monoclonal antibodies Journal of General Virology 89: 177–187 20 Lefebvre David J., Doorsselaere J Van, Delputte P L and Nauwynck H.J 2009 Recombination of two porcine circovirus type strains Archives Virology 154:875–879 21 Mankertz Annette, Persson F., Mankertz J., Blaess G and Buhk Hans – Joerg 1997 Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus, Journal of Virology, 2562–2566 22 McIntosh Kathleen A., Tumber Anju, Harding John C.S., Krakowka Steven, Ellis John A., Hill Janet E 2008 Development and validation of a SYBR green real-time PCR for the quantification of porcine circovirus type in serum, buffy coat, feces, and multiple tissues Veterinary Microbiology 133: 23–33 23 Meerts P., Misinzo G., McNeilly F and Nauwynck H J 2005 Replication kinetics of different porcine circovirus strains in PK-15 cells, fetal cardiomyocytes and macrophages Archives Virology 150: 427–441 24 Steiner Esther, Balmelli Carole, Gerber Heidi, Summerfield Artur and McCullough Kenneth 2009 Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type in subclinically infected pigs BMC Veterinary Research 5:45 25 Steven D Sorden 2000 Update on porcine circovirus and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) Swine Health and Production 8(3): 133-136 26 Zhou J.Y., Chen Q.X., Ye J.X., Shen H.G., Chen T.F and Shang S.B 2006 Serological investigation and genomic characterization of PCV2 isolates from different geography regions of Zhejiang province in China Veterinary Research communications 30: 205-220 27 Zong-zhao Yang, Mudasser Habib, Jiang-bing Shuai, Wei-huan Fang 2007 Journal of Zhejiang University Science B 8: 162-169 47 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp pha loãng plasmid DNA Tiến hành pha loãng plasmid DNA theo hệ số pha loãng bậc 10 với số plasmid DNA 106 sao, 105 sao, 104 sao, 103 Dung dịch gốc plasmid DNA có nồng độ 230 ng/µl, phản ứng thực với thể tích plasmid DNA 5µl Phương pháp:  Tính khối lượng Khối lượng trung bình phân tử DNA mạch đơi 660 g/mol, plasmid có chiều dài L (base) (kể đoạn DNA chèn vào) khối lượng L 660 (g) Mặt khác, theo định luật Avogadro, mol chứa 6,023 1023 phân tử ( hay số plasmid) Vì khối lượng là: M = L [(1mole/6,023 1023) (660 g/1 mole) = 3507 1,096 10-21 = 3,8436 10-18 g L: chiều dài plasmid DNA (bp) (plasmid + đoạn gen chèn = 3015 + 492)  Tính khối lượng plasmid chứa số quan tâm Số Khối lượng (g) 108 3.8436 10-10 107 3.8436 10-11 106 3.8436 10-12 105 104 3.8436 10 -18 3.8436 10-13 3.8436 10-14 103 3.8436 10-15 102 3.8436 10-16 101 3.8436 10-17 100 3.8436 10-18  Nồng độ plasmid DNA cần thiết để đạt số quan tâm Số Khối lượng plasmid Nồng DNA cần (g) độ cuối phản ứng (g/µl) 108 3.8436 10-10 7.6872 10-11 107 3.8436 10-11 7.6872 10-12 106 3.8436 10-12 7.6872 10-13 105 3.8436 10-13 104 3.8436 10-14 7.6872 10-15 103 3.8436 10-15 7.6872 10-16 102 3.8436 10-16 7.6872 10-17 101 3.8436 10-17 7.6872 10-18 100 3.8436 10-18 7.6872 10-19 ÷5 µl 7.6872 10-14  Chuẩn bị dãy pha loãng plasmid DNA Thể tích cần thiết tính theo cơng thức sau: C1.V1 = C2.V2 (230 10-12) V1 = (7,6872 10-11) 100 V1 = 33,42 (µl) Thể tích pha lỗng 100 – 33,42 = 66,58 (µl)  Dãy pha loãng plasmid DNA Độ Nguồn pha Nồng độ Thể tích Thể tích Thể Nồng độ cuối Số đầu(g/µl) plasmid pha tích (g/µl) DNA lỗng cuối (µl) (µl) (µl) /5µl lỗng (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) Stock 230 10-9 45 50 230 10-10 PL1 230 10-10 45 50 230 10-11 PL2 230 10-11 45 50 230 10-12 PL3 230 10-12 33,42 67,58 100 7,6872 10-11 108 PL4 7,6872 10-11 10 90 100 7,6872 10-12 107 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) PL5 7.,6872 10-12 10 90 100 7,6872 10-13 106 PL6 7,6872 10-13 10 90 100 7,6872 10-14 105 PL7 7,6872 10-14 10 90 100 7,6872 10-15 104 PL8 7,6872 10-15 10 90 100 7,6872 10-16 103 Phụ lục Trình tự vùng gen giải trình tự TTGGGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGT GATTTGGTAACCATCCCACCACTTGTTTCTAGGTGGTTTCCAGTATGTGGTT TCCGGGTCTGCAAAATTAGCAGCCCATTTGCTTTTGCCACACCCAGGTGGC CCCACAATGACGTGTACATTCGTCTTCCAATCACGCTTCTGCATTTTCCCGC TCACTTTCAAAAGTTCAGCCAGCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACAG GGTGCTGCTCTGCAACGGTCACCAGACTCCCGCTCTCCAACAAGGTACTCA CAGCAGTAGAGAGGTCACTCCGTTGTCCTTGAGATCTAGGAGCTCCACATT CTATCAGTAAGTTGCCTTCTTTACTGCAATATTCTTTATTCTGCTGATCTGT TCCTTTCGCTTTCTCGATGTGGCAGCGGGCACCAAAATACCACTTCACTTT ATTAAAAGTTTGCTTCTTCACAAAATTAGCGAACCCCTGTAGGTGGGGTGT TCGGCCCTCCTCATTACCCTCCTCGCCAACAATAAATCGAATTCCCGCGGC CGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGT GAGTCGTATTAA Phụ lục Một số chủng PCV2 sử dụng để align với gen đích giải trình tự Mã số Genbank Mô tả HM161711.1 Porcine circovirus phân lập XT, gene hoàn chỉnh HM161710.1 Porcine circovirus phân lập BX-2, gene hoàn chỉnh HM038030.1 Porcine circovirus chủng AH, gene hoàn chỉnh HM038017.1 Porcine circovirus chủng BDH, gene hoàn chỉnh GU252370.1 Porcine circovirus chủng YZ0901, gene hoàn chỉnh GU083583.1 Porcine circovirus phân lập PCV2C53, gene hoàn chỉnh Phụ lục Bảng kết định lượng real-time PCR 19 mẫu thực tế chuẩn (6) Starting Quantity (SQ) (7) Log Starting Quantity (8) Well Fluor Content Sample Threshold Cycle ( C(t)) C(t) Mean (1) (2) (3) (4) (5) SQ Mean (9) C04 SYBR Std 10^6 16,61 16,61 1,00E+06 1,00E+06 D04 SYBR Std 10^6 16,44 16,44 1,00E+06 1,00E+06 E04 SYBR Std 10^6 16,53 16,53 1,00E+06 1,00E+06 C05 SYBR Std 10^5 19,77 19,77 1,00E+05 1,00E+05 D05 SYBR Std 10^5 19,91 19,91 1,00E+05 1,00E+05 E05 SYBR Std 10^5 19,84 19,84 1,00E+05 1,00E+05 C06 SYBR Std 10^4 22,94 22,94 1,00E+04 1,00E+04 D06 SYBR Std 10^4 22,76 22,76 1,00E+04 1,00E+04 E06 SYBR Std 10^4 22,81 22,81 1,00E+04 1,00E+04 C07 SYBR Std 10^3 24,45 24,45 1,00E+03 1,00E+03 D07 SYBR Std 10^3 24,49 24,49 1,00E+03 1,00E+03 E07 SYBR Std 10^3 24,63 24,63 1,00E+03 1,00E+03 A01 SYBR Unkn 26,57 26,57 2,58E+02 2,412 2,58E+02 B01 SYBR Unkn 26,17 26,17 3,61E+02 2,558 3,61E+02 A03 SYBR Unkn 24,22 24,22 1,92E+03 3,282 1,91E+03 B03 SYBR Unkn 24,06 24,06 2,19E+03 3,34 2,19E+03 A08 SYBR Unkn 24,93 24,93 1,05E+03 3,019 1,04E+03 B08 SYBR Unkn 25,2 25,2 8,26E+02 2,917 8,26E+02 C02 SYBR Unkn 24,72 24,72 1,25E+03 3,097 1,25E+03 D02 SYBR Unkn 24,32 24,32 1,75E+03 3,244 1,75E+03 E01 SYBR Unkn 22,94 22,94 5,69E+03 3,755 5,69E+03 F01 SYBR Unkn 23,62 23,62 3,19E+03 3,504 3,19E+03 E02 SYBR Unkn 25,26 25,26 7,87E+02 2,896 7,87E+02 F02 SYBR Unkn 25,09 25,09 9,12E+02 2,96 9,12E+02 E03 SYBR Unkn 25,06 25,06 9,32E+02 2,969 9,32E+02 F03 SYBR Unkn 24,96 24,96 1,02E+03 3,008 1,02E+03 F04 SYBR Unkn 24,07 24,07 2,18E+03 3,338 2,18E+03 G04 SYBR Unkn 24,26 24,26 1,84E+03 3,266 1,84E+03 G02 SYBR Unkn 25,58 25,58 5,99E+02 2,777 5,99E+02 H02 SYBR Unkn 26,11 26,11 3,80E+02 2,58 3,80E+02 H07 SYBR Unkn 10 N/A N/A N/A 0,00E+00 H08 SYBR Unkn 10 39,95 39,95 2,85E-03 -2,545 2,85E-03 C01 SYBR Unkn 11 25,36 25,36 7,24E+02 2,86 7,24E+02 D01 SYBR Unkn 11 22,98 22,98 5,49E+03 3,739 5,49E+03 C03 SYBR Unkn 12 24,35 24,35 1,71E+03 3,232 1,71E+03 D03 SYBR Unkn 12 24,3 24,3 1,79E+03 3,252 1,79E+03 A04 SYBR Unkn 13 25,54 25,54 6,20E+02 2,792 6,20E+02 B04 SYBR Unkn 13 27,68 27,68 9,96E+01 1,998 9,96E+01 A05 SYBR Unkn 14 37,04 37,04 3,39E-02 -1,47 3,39E-02 B05 SYBR Unkn 14 36,91 36,91 3,79E-02 -1,421 3,79E-02 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) A07 SYBR Unkn 15 26,02 26,02 4,10E+02 2,613 4,10E+02 B07 SYBR Unkn 15 25,76 25,76 5,14E+02 2,711 5,14E+02 F06 SYBR Unkn 16 25,71 25,71 5,36E+02 2,729 5,36E+02 G06 SYBR Unkn 16 26,83 26,83 2,06E+02 2,313 2,06E+02 F08 SYBR Unkn 17 24,98 24,98 1,00E+03 3,001 1,00E+03 G08 SYBR Unkn 17 25,04 25,04 9,46E+02 2,976 9,46E+02 A09 SYBR Unkn 18 25,41 25,41 6,93E+02 2,84 6,93E+02 B09 SYBR Unkn 18 26,29 26,29 3,28E+02 2,515 3,28E+02 C09 SYBR Unkn 19 24,64 24,64 1,33E+03 3,124 1,33E+03 D09 SYBR Unkn 19 25 25 9,79E+02 2,99E+00 9,79E+02 Phụ lục Bảng kết nhiệt độ nóng chảy 19 mẫu thực tế chuẩn Well Fluor Content Sample (1) (2) (3) (4) Melt Temperature (5) Peak Height (6) Begin Temperature (7) End Temperature (8) C04 SYBR Std 10^6 80,6 223,6 77,4 83 D04 SYBR Std 10^6 80,6 250,68 77,2 83,2 E04 SYBR Std 10^6 80,6 246,03 76,8 83 C05 SYBR Std 10^5 73,6 61,08 69,6 77 C05 SYBR Std 10^5 80,4 210,47 77 83,2 D05 SYBR Std 10^5 74,6 67,4 70,2 77,2 D05 SYBR Std 10^5 80,4 224,61 77,4 83,2 E05 SYBR Std 10^5 74,2 61,49 66 77 E05 SYBR Std 10^5 80,4 212,25 77,6 82,8 C06 SYBR Std 10^4 74,6 65,65 66 77,4 C06 SYBR Std 10^4 80 94,04 78,2 82,4 D06 SYBR Std 10^4 74,6 83,9 70,2 77,8 D06 SYBR Std 10^4 80,2 152,48 77,8 82,8 E06 SYBR Std 10^4 80,4 195,2 77,2 83 C07 SYBR Std 10^3 74,4 63,53 66 77,6 C07 SYBR Std 10^3 80,4 184,93 77,6 83,4 D07 SYBR Std 10^3 74,4 64,28 71 77,2 D07 SYBR Std 10^3 80,4 194,77 78 83,2 E07 SYBR Std 10^3 74 56,87 71,8 76,6 E07 SYBR Std 10^3 80,2 150,86 77,2 82,4 A01 SYBR Unkn 74,8 86,79 68,8 78 A01 SYBR Unkn 80,2 99,72 78 82,4 B01 SYBR Unkn 74,4 88,99 66 78,2 B01 SYBR Unkn 80,2 93,1 78,2 83,6 A03 SYBR Unkn 80,4 92,08 78,6 82 A03 SYBR Unkn 75,2 122,88 66 78,6 B03 SYBR Unkn 80,4 105,8 78,6 82,4 B03 SYBR Unkn 75,2 132,29 69,6 78,6 A08 SYBR Unkn 75,2 100,14 69,2 78 A08 SYBR Unkn 80,4 141,64 78,4 83 B08 SYBR Unkn 80,4 144,5 76,8 83,4 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) C02 SYBR Unkn 80,2 96,99 78,4 82,4 C02 SYBR Unkn 74,8 102,75 66 78,2 D02 SYBR Unkn 75,2 112,19 66 78,2 D02 SYBR Unkn 80,2 112,87 78,4 82,4 E01 SYBR Unkn 75,6 166,42 69 79 F01 SYBR Unkn 80,4 91,98 78,6 83 F01 SYBR Unkn 75,6 138,66 70 78,6 E02 SYBR Unkn 75,2 101,07 69,2 78 E02 SYBR Unkn 80,4 113,53 78 82,8 F02 SYBR Unkn 75 100,75 68,6 78,4 F02 SYBR Unkn 80,2 108,7 78,4 83 E03 SYBR Unkn 75 107,54 66 78,4 E03 SYBR Unkn 80,2 112,51 78,4 84 F03 SYBR Unkn 74,8 105,25 70,6 78 F03 SYBR Unkn 80,2 120,69 78,2 82,6 F04 SYBR Unkn 80,2 108,49 78,4 82,4 F04 SYBR Unkn 75,2 118,86 70 78,4 G04 SYBR Unkn 80,2 107,4 78,6 82,2 G04 SYBR Unkn 75,2 121,63 68,8 78,6 G02 SYBR Unkn 80,2 80,13 78,6 83,2 G02 SYBR Unkn 75 100,79 69,4 78,6 H02 SYBR Unkn 70,6 55,67 66,8 71,2 H02 SYBR Unkn 80,2 93,57 78,4 83,6 H02 SYBR Unkn 75,4 104,82 71,4 78,4 C01 SYBR Unkn 11 80,2 71,43 78,6 83 C01 SYBR Unkn 11 75,4 100,79 70 78,6 D01 SYBR Unkn 11 75,6 146,29 71,2 79,6 C03 SYBR Unkn 12 80,2 114,27 78,6 82,2 C03 SYBR Unkn 12 75 124,36 69 78,6 D03 SYBR Unkn 12 80,2 104,56 78,4 82,8 D03 SYBR Unkn 12 75 111,85 66 78,4 A04 SYBR Unkn 13 74,6 97,08 69,2 78 A04 SYBR Unkn 13 80,2 104,92 78,2 83,8 B04 SYBR Unkn 13 74,6 80,08 66 77,6 B04 SYBR Unkn 13 80 92,47 77,6 83,6 A05 SYBR Unkn 14 74,8 77,98 71,4 78,2 A05 SYBR Unkn 14 80,2 91,86 78,4 82,4 B05 SYBR Unkn 14 74,4 77,06 69,8 77,8 B05 SYBR Unkn 14 80 86,49 77,8 83 A07 SYBR Unkn 15 74,4 65,19 69,6 77,6 A07 SYBR Unkn 15 80,4 167,47 77,8 83,4 B07 SYBR Unkn 15 74,2 61,26 69,6 77,4 B07 SYBR Unkn 15 80,4 163,79 77,4 84,2 F06 SYBR Unkn 16 74,4 64,67 71,4 77,6 F06 SYBR Unkn 16 80,4 171,61 77,6 83,4 G06 SYBR Unkn 16 74,4 63,31 69 77,2 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) G06 SYBR Unkn 16 80,2 111,65 77,8 84,4 F08 SYBR Unkn 17 80,2 152,52 77,8 83,4 G08 SYBR Unkn 17 74,8 79,46 69,8 77,4 G08 SYBR Unkn 17 80,4 179,68 77,8 83 F08 SYBR Unkn 17 75 88,92 68,6 77,8 A09 SYBR Unkn 18 75,4 72,75 66 78,2 A09 SYBR Unkn 18 80,4 114,08 78,2 83,8 B09 SYBR Unkn 18 74,8 62,72 70,2 77,6 B09 SYBR Unkn 18 80,4 148,87 77,8 83,8 D09 SYBR Unkn 19 74,6 80,5 73 77,8 D09 SYBR Unkn 19 80,4 155,95 77,8 82,8 C09 SYBR Unkn 19 74,6 63,06 71,6 77,4 C09 SYBR Unkn 19 80,2 139,19 77,8 82,6 ... Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR sử dụng EvaGreen định tính định lượng porcine circovirus type (PCV 2) ” 1 .2 Mục đích đề tài Thiết lập quy trình định lượng PCV2 phương pháp real-time PCR sử dụng EvaGreen. .. phản ứng PCR sử dụng PCR Master Mix 2X 29 Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2- 83F, PCV2- 83R 30 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng real-time PCR sử dụng EvaGreen qPCR Mastermix 32. .. chất phản ứng PCR sử dụng iAdvance iVAPCR Mastermix .25 Bảng 3 .2 Quy trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng mồi PCV2- 492F, PCV2- 492R .26 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất phản ứng ligation 27 Bảng 3.4