Nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại việt nam

Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển đó, ngành chăn nuôi lợn cũng có nhiều thách thức đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong đó Hội chứng bệnh do PCV2 đư

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

i

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

ii

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ, PGS.TS Phạm Công Hoạt đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, cán bộ Cục Thú y, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương và Ban quản lý dự án CDC đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà N ội, ngày tháng năm 2019

iii

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận án x

Thesis abstract xii

Ph ần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

1.5.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Ph ần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tình hình chăn nuôi lợn tại Việt Nam 4

2.2 Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra ở lợn nuôi 5

2.2.1 Giới thiệu về PCV2 5

2.2.2 Dịch tễ học của bệnh do PCV2 8

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh 9

2.2.4 Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2 11

2.2.5 Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2 14

2.2.6 Chẩn đoán 16

2.2.7 Phòng bệnh 18

2.2.8 Điều trị 22

2.3 Hiện tượng đồng nhiễm do PCV2 gây ra 22

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2 23

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

iv

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 29

Ph ần 3 Nội dung – Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Địa điểm nghiên cứu 33

3.2 Thời gian nghiên cứu 33

3.3 Vật liệu nghiên cứu 33

3.4 Nội dung nghiên cứu 35

3.5 Phương pháp nghiên cứu 35

3.5.1 Phương pháp tính toán dung lượng mẫu 35

3.5.2 Phương pháp điều tra hồi cứu 38

3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu 38

3.5.4 Phương pháp chiết tách ADN/ARN 38

3.5.5 Phương pháp Realtime PCR 39

3.5.6 Phương pháp PCR 40

3.5.7 Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen 41

3.5.8 Phương pháp phân tích trình tự gen 42

3.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 42

3.5.10 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian 42

3.5.11 Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền 45

3.5.12 Phương pháp xử lý số liệu 45

Ph ần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 46

4.1 Sự lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam 46

4.1.1 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương 46

4.1.2 Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi 52

4.1.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi 53

4.1.4 Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra 56

4.2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 59

4.2.1 Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 59

4.2.2 Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam 60

4.2.3 Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam 64

4.2.4 Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian 66

4.2.5 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam 68

v

4.2.6 Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam 73

4.3 Hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus 76

4.3.1 Kết quả xác định sự có mặt của một số virus đồng nhiễm 77

4.3.2 Kết quả nghiên cứu hiện tượng đồng nhiễm PCV2 với một số virus 83

4.3.3 Đặc điểm sinh học phân tử của loài virus mới đồng nhiễm với PCV2 87

Ph ần 5 Kết luận và đề nghị 92

5.1 Kết luận 92

5.2 Đề nghị 92

Những công trình của tác giả công bố có liên quan đến luận án 93

Tài liệu tham khảo 94

Phụ lục 112

vi

CSFV Classical Swine Fever Virus

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay

PBS Phosphate – Buffered - Saline

PCR Polymerase chain reaction

PCV Porcine circovirus

PCV1 Porcine circovirus type 1

PCV2 Porcine circovirus type 2

PCV3 Porcine circovirus type 3

PCVAD Porcine circovirus type 2-associated disease PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome

PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome

PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

vii

2.1 Một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu,

lưu hành tại Việt Nam hiện nay 20

3.1 Mồi sử dụng để phát hiện các virus nghiên cứu 34

3.2 Trình tự mồi dùng chẩn đoán và giải trình tự gen PCV2 35

3.3 Trình tự mồi dùng giải trình tự gen PCV3 35

3.4 Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu 37

3.5 Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2d dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian 43

3.6 Tóm tắt thông tin trình tự gen ORF2 của các chủng PCV2b dùng phân tích đặc điểm dịch tễ học theo không gian - thời gian 44

4.1 Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương 47

4.2 Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô khác nhau trên địa bàn nghiên cứu 52

4.3 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn 53

4.4 Trình tự gen được đưa trên Genbank 60

4.5 Motif đặc trưng genotype của PCV2 lưu hành ở Việt Nam 64

4.6 Kết quả xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm 78

4.7 Kết quả xác định sự đồng nhiễm virus trong mẫu bệnh phẩm 83

viii

2.1 Phân bố tổng số lợn nuôi theo địa phương năm 2017 4

2.2 Cây phát sinh loài của PCV2 5

2.3 Cấu trúc PCV2 6

2.4 Khả năng bài tiết PCV2 ở lợn bị nhiễm 8

2.5 Phát triển của nhiễm PCV2 biểu hiện thành PCVAD 10

2.6 Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS 12

2.7 Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS 13

2.8 Sự phân bố PCV2 trên thế giới 24

2.9 Phân loại genotype của PCV2 ở Việt Nam 31

4.1 Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2 46

4.2 Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu 49

4.3 Một số triệu chứng điển hình ở lợn mắc PMWS 57

4.4 Một số bệnh tích điển hình ở lợn mắc PMWS 58

4.5 Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh có trình tự được phân tích 61

4.6 Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam 62

4.7 Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam 65

4.8 Phân bố các nhóm di truyền của PCV2 ở Việt Nam theo không gian và thời gian 67

4.9 Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2b giữa các nước 69

4.10 Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm nhập vào Việt Nam 71

4.11 Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm nhập vào Việt Nam 72

4.12 Sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d 74

4.13 Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam 75

ix

4.14 Kết quả PCR xác định sự có mặt của virus đồng nhiễm 77

4.15 Các tỉnh có mẫu dương tính với các virus đồng nhiễm 80

4.16 Sự phân bố theo không gian của virus đồng nhiễm PCV2 86

4.17 Trình tự gen ORF2 của 5 chủng PCV3 phân lập tại Việt Nam 88

4.18 Khoảng cách di truyền giữa các chủng PCV3 của Việt Nam và thế giới 89

4.19 Cây phát sinh chủng loại của PCV3 lưu hành ở Việt Nam 90

4.20 Quan hệ di truyền giữa PCV2 và PCV3 lưu hành ở Việt Nam 91

x

circovirus type 2 (PCV2) ở lợn nuôi tại Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu:

Sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản nhiều giai đoạn và dựa vào thuật toán thống kê Phân tích mẫu bằng phương pháp realtime PCR/PCR để xác định mẫu nhiễm PCV2

Sử dụng chương trình tin sinh học Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999) để phân tích trình tự nucleotide Sử dụng chương trình MEGA 7 (Tamura et al., 2013) để xây

dựng cây phát sinh chủng loại Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA) để phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotide gen ORF2 của 64 chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam từ 2004 đến 2017

Sử dụng phần mềm Quantum GIS để mô tả mức độ và sự phân bố của PCV2 ở

lợn nuôi tại Việt Nam Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây

dựng lại quá trình phát tán (dispersal pathway) của các chủng PCV2d theo không gian và thời gian (spatio-temporal dynamics), với các tham số của mô hình dựa theo

kết quả nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009) Sử dụng chương trình SpreaD3 (Bielejec et al., 2016) để tính toán giá trị Bayes factor (cho biết mức tin cậy của dự

đoán các con đường phát tán) Giá trị BF trong khoảng BF > 150, 3 < BF < 150 và 1

< BF < 3 lần lượt ứng với mức dự đoán có độ tin cậy cao, có căn cứ và chưa đủ căn

cứ về con đường phát tán (Kass and Raftery, 1995)

Số liệu được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1)

xi

* T ỷ lệ lưu hành porcine circovirus type 2 (PCV2) ở Việt Nam:

(i) Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14% Tỷ lệ lưu hành PCV2 tại 14

tỉnh dao động từ 16% đến 88%; (ii) Ở các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ

lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể tỷ lệ lưu hành PCV2 cao nhất ở những trại có mức quy mô đàn >500 con (47,5%), thấp nhất là trại có quy mô đàn từ 100

– 300 con (27,42%) (iii) Ở các nhóm tuổi lợn đều phát hiện được mẫu dương tính với PCV2, tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn thịt là cao nhất (45,16%), lợn con theo mẹ và lợn nái tương ứng là 39,58% và 32,35%

* Kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam:

Ở Việt Nam, chỉ có sự lưu hành genotype PCV2b bao gồm nhánh 1A/1B, nhóm tái tổ hợp và genotype PCV2d Ở cả 3 miền Bắc - Trung - Nam, đều thấy sự hiện diện đồng thời nhiều nhóm di truyền của PCV2 ở một tỉnh, trong cùng một khoảng thời gian Các chủng phân lập ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b có nguồn gốc từ Trung Quốc và Hàn Quốc, các chủng thuộc genotype PCV2d từ 2004 - 2017 đều có nguồn gốc đầu tiên từ Trung Quốc, nhưng nằm ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại

* Kết quả xác định sự đồng nhiễm porcine circovirus type 2 (PCV2) với một

số virus:

PCV2 đồng nhiễm với 04 virus (PPV, TTV, PCV3, PRRS), cụ thể đồng nhiễm PCV2/PPV là cao nhất (35,42%), PCV2/TTV (13,19%), PCV2/PRRS (7,64%) và phát hiện được sự lưu hành của PCV3 với tỷ lệ 4,17% và các chủng PCV3 đều thuộc về nhóm di truyền PCV3a

Kết quả góp phần làm đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam Đồng thời, đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam Đây là cơ sở khoa học quan trọng để nâng cao các

biện pháp phòng chống nhằm giảm nguy cơ lợn mắc PMWS, nâng cao hiệu quả của ngành chăn nuôi lợn

xii

THESIS ABSTRACT PhD candidate: Pham Hong Quan

Thesis title: Investigating the prevalence and the molecular epidemiology of porcine

circovirus type 2 (PCV2) circulating in pig’s population in Vietnam

Major: Veterinary Epidemiology Code: 9 64 01 08

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research objective

Determining the prevalence and molecular epidemiological characteristics of PCV2 and the co-infection of PCV2 with other DNA/RNA viruses in pigs in Vietnam

Materials and Methods

In this thesis, a simple multiple-stage random sampling design and statistical algorithms were used The collected samples were tested using rRT/PCR to detect PCV2

Nucleotide sequences was analyzed using Bioedit v7.1.3.0 (Hall, 1999)

Phylogenetic trees of PCV2 was generated using MEGA 7 (Tamura et al., 2013)

The diversity of the ORF2 genomic sequences of the 64 PCV2 viruses collected in Vietnam between 2004 and 2017 was analyzed using Principal Coordinate Analysis (PCoA) method

The extent and distribution of PCV2 viruses circulated in Vietnam were described using Quantum GIS software The dispersal pathway of spatio-temporal dynamics (PCV2d) with the parameters of the model based on the previous study

(Lemey et al., 2009) was reconstructed using BEAST software (Drummond et al.,

2012) The Bayes factor (BF) values (indicating the reliability of predicted pathways)

were calculated using the SpreaD3 program (Bielejec et al., 2016) BF values of 150,

3 and <BF <150 and 1 <BF <3 respectively corresponded to predicted levels of high reliability, evidence and insufficient grounds for spread (Kass and Raftery, 1995) The data is processed by MS Excel 2010 software; The difference between factors were compared by the χ2 test (Minitab 14.0 software) and the Fisher Exact Test (SAS 9.1 software)

Main findings and conclutions

* The prevalence of PCV2 in Vietnam:

(i) The prevalence of PCV2 in Vietnam was 41,14% The prevalence of PCV2

in the 14 selected provinces ranged from 16% to 88% (ii) In different herd sizes,

the prevalence of PCV2 was different The prevalence of PCV2 was highest in

xiii

pigs farms with herd size > 500 (47,5%), the lowest prevalence of PCV2 was

detected in herd sizes with the scale of 100 - 300 (27,42%) (iii) The PCV2

viruses were detected in all different age groups The highest prevalence of PCV2 was in the fattening pigs (45,16%), followed by piglets and sow groups with 39,58% and 32,35%

* Results of molecular epidemiological characteristics of porcine circovirus type 2 (PCV2) circulating in pigs in Vietnam, 2004 - 2017:

In Vietnam, only the genotype PCV2b circulated including the 1A / 1B arm, the recombinant and the PCV2d genotype In all three regions of North - Central - South, there was a simultaneous presence of several genetic groups of PCV2 in one province at the same time The PCV2 strains isolated in Vietnam of gennotype PCV2b are originally belong to Chinese and Korean PCV2 viruses, the PCV2 strains

of genotype PCV2d from 2004 to 2017 are originally belong to Chinese PCV2 viruses, but they were in different branches of the PCV2 phylogenetic tree

* Results of PCV2 co-infection with others viruses in pigs:

Results of PCV2 co-infection with others viruses (PPV, TTV, PCV3, PRRS), co-infection PCV2/PPV was highest at 35,42%, PCV2/TTV at 13,19%,

PCV2/PRRS at 7,64% and identification of new PCV3 virus in Vietnam with a

detection rate of 4,17% and five PCV3 strains in Vietnam were belong to the PCV3a genetic group

This result contributes to the overall epidemiological picture of PCV2 virus in Vietnam At the same time, the prevalence of new PCV3 virus in pigs in Vietnam was further identified This is a very important scientific basis to improve the prevention and control measures of the disease to reduce the risk of PMWS and to improve the efficiency of the pig industry

Key words: PCV2 genotype 2d, molecular epidemiology, spatio-temporal dynamics

1

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng đang ngày càng phát triển và chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta Tổng đàn lợn trên cả nước tại thời điểm 01/10/2017 đạt trên 27,4 triệu con (Cục Chăn nuôi, 2017) Cùng với các tiến bộ kỹ thuật về giống, thức ăn, quản lý, thú y kết hợp với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước làm cho ngành chăn nuôi lợn ở nước ta phát triển với tốc độ tương đối cao, mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân đồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia Tuy nhiên, bên cạnh với sự phát triển đó, ngành chăn nuôi lợn cũng có nhiều thách thức đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong đó Hội chứng bệnh do PCV2 được coi là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn Một số nghiên cứu cho thấy thiệt hại hằng năm do PCV2 gây ra đối với ngành chăn nuôi lợn là rất lớn: tại Anh là khoảng 35 triệu bảng anh và đối với các nước thuộc liên minh châu Âu vào khoảng 562 - 900 triệu euro (Armstrong and Bishop, 2004) Tại Mỹ, PCVAD gây thiệt hại kinh tế trung bình 3 - 4 đô la/lợn, thậm chí có đàn lên đến 20 đô la/lợn

(Gillespie et al., 2009) và PCV2 được coi là virus gây bệnh quan trọng nhất trong ngành chăn nuôi (Opriessnig et al., 2007)

Tại Việt Nam, Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa đã được chứng minh xuất hiện lần đầu tiên vào năm 2000, gây ra những ảnh hưởng đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006) Tuy nhiên các nghiên cứu về

sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số mầm bệnh khác đến nay còn hạn chế và mới chỉ tập trung theo vùng, miền như các nghiên cứu về sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học tại miền Nam: (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006; Lâm Thị Thu Hương và cs., 2005) xác định có sự lưu hành của PCV2 ở Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận; Nguyễn Ngọc Hải

và cs (2013) ghi nhận các chủng PCV2 thu nhận tại tỉnh Đồng Nai và TP Hồ Chí Minh chủ yếu là 2 kiểu gen PCV2b và PCV2d; nghiên cứu của Lê Thị Thu Phương và cs (2018) khẳng định PCV2 lưu hành ở 13 tỉnh phía Nam thuộc các genotype 2b, 2d và nhóm tái tổ hợp; tại miền Trung: Phạm Hoàng Sơn Hưng và

cs (2018) ghi nhận sự lưu hành PCV2 ở Nghệ An và tại miền Bắc: (Huỳnh Thị

Mỹ Lệ và cs., 2012; Nguyễn Viết Không và cs., 2013; Trương Anh Đức và cs.,

ở lợn con sau cai sữa Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh trong điều kiện thực nghiệm một mình PCV2 không gây bệnh mà kết hợp với một số virus như

PRRS (Changhoon et al., 2014), PPV (Krakowka et al., 2000), TTV (Lee et al.,

2010) mới gây bệnh thể lâm sàng

Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm làm rõ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân

tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus trong điều kiện sản xuất thực tế của các cơ sở chăn nuôi lợn xuyên suốt ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam trên cả nước Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới và đề ra các biện pháp phòng chống bệnh do PCV2 có hiệu quả, nhất là công tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vacxin phòng bệnh cho đàn lợn trong nước

- Xác định sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN, ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam

Mẫu được thu thập từ các trại nuôi lợn thuộc 14 tỉnh nghiên cứu đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam ở Việt Nam bao gồm: Thái Nguyên, Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị,

3

Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang và Vĩnh Long

Thời gian thực hiện từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 3 năm 2019

- Xác định được tỷ lệ lưu hành và bổ sung đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam

- Đánh giá được sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus (PPV, TTV, PRRS, PCV3) ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Trong quá trình thực hiện đề tài đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Đây là một trong những nghiên cứu có hệ thống về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus ở lợn nuôi tại Việt Nam

- Đây là nghiên cứu mới về Porcine circovirus 3 (PCV3), một loài virus mới lưu hành của ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo về PCV

- Trên cơ sở phát hiện của đề tài về một loài virus mới PCV3, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về đánh giá sự lưu hành, cũng như vai trò gây bệnh và tác động của PCV3 tới sức sản xuất của đàn lợn để đưa ra các giải pháp phòng, chống có hiệu quả

4

Ngành chăn nuôi lợn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển nông nghiệp của nước ta Hiện nước ta có đàn lợn khoảng 27,4 triệu con, tốc độ tăng trưởng đàn lợn, giai đoạn 2007 – 2017 đạt 0,91%/năm (Cục Chăn nuôi, 2017) Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam chủ yếu là chăn nuôi nhỏ lẻ ở qui mô hộ gia đình, môi trường chăn nuôi không đảm bảo vệ sinh thú y, phong tục tập quán của người Việt Nam mang nhiều yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch bệnh ở lợn như: sử dụng thịt lợn tươi sống là chủ yếu, giết mổ nhỏ lẻ tại hộ gia đình, sử dụng cả thịt lợn mắc bệnh, buôn bán lợn nhỏ lẻ không qua kiểm dịch thú y, chăn nuôi lợn tận dụng nguồn thức ăn thừa từ các nhà hàng, nên nhiều loại dịch bệnh

ở lợn, trong đó có Hội chứng bệnh do PCV2 có thể tồn tại, lưu hành trong thời gian dài

Nguồn: Cục Chăn nuôi (2017)

5

2.2.1 Giới thiệu về PCV2

2.2.1.1 Phân loại

PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae (Lukert et al., 1995) Họ

circoviridae gồm hai giống, được xác định là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia súc và gia cầm:

- Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV) Virus này được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập được từ bệnh nhân mắc bệnh gan; tuy nhiên chúng không được coi là nguyên nhân gây bệnh Một số nghiên cứu gần đây cho thấy TTV cũng có thể gây bệnh cho một số loài vật nuôi khác như lợn, và có thể phân lập được từ huyết thanh của lợn mắc PMWS tại Tây Ban Nha (Francisco de Grau, 2012)

- Giống Circovirus: gồm các virus đã phát hiện được từ động vật như porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), circovirus ở chim hoàng yến

(Phenix et al., 2001), circovirus ở chim bồ câu (Woods et al., 1993),

circovirus ở chim sẻ (Shivaprasad et al., 2004), circovirus ở mòng biển (Smyth et al., 2006), circovirus ở thiên nga (Halami et al., 2008), circovirus ở

ngỗng (Soike et al., 1999), circovirus ở vịt (Hattermann et al., 2003), circovirus ở quạ (Stewart et al., 2006)

Nguồn: Franzo et al (2015)

Nguồn: Gillespie et al (2009)

Dựa trên các nghiên cứu phát sinh loài và PCR-RFLP trước đó, PCV2 có 4 genotype (PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d) và 8 nhóm di truyền: PCV2b (1A-

1C) và PCV2a (2A-2E) (Saha et al., 2012; Franzo et al., 2015; Guo et al., 2010; Segalés et al., 2008; Olvera et al., 2007) được công nhận

Theo Hamel et al (1998) PCV là một virus trần không có vỏ bọc bên ngoài

Bộ gen gồm 11 khung đọc mở ORFs (open reading frame) mã hóa cho các phân tử protein của virus, trong đó hai khung đọc mở chính (ORF1 và ORF2) theo hướng ngược nhau

7

Hiện nay trên thế giới các nghiên cứu về PCV thường tập trung vào ba ORF

là ORF1, ORF2 và ORF3

ORF1 (vị trí 51 đến 995) mã hóa cho các protein liên quan đến sự nhân lên của virus (viral replication protein – Rep), có khối lượng phân tử 35,8 kDa

(Mankertz et al., 1998) Sự tương đồng amino acid của phân tử protein quy định

bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%

ORF2 (vị trí 1734/1735 đến 1030/1033/1034) mã hóa cho các protein liên quan đến sự hình thành vỏ capsid của virus (capsid protein – Cap), có khối lượng phân tử 27,8 kDa (Mankertz et al., 1998; Nawagitgul et al., 2000) Sự tương đồng amino acid của phân tử protein do ORF2 mã hóa giữa PCV1 và PCV2 là 66% Sản phẩm ORF2 chứa các điểm quyết định kháng nguyên, kích thích sinh kháng thể chống lại virus, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một công cụ để chẩn đoán phân biệt PCV

ORF3 (vị trí 671 đến 357) mã hóa protein có khối lượng phân tử 11,9 kDa, được cho là có liên quan đến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus

(Liu et al., 2006); sự tương đồng amino acid của protein này giữa PCV1 và

PCV2 là 62%

2.2.1.3 Sức đề kháng

PCV2 có khả năng sống được 15 phút ở nhiệt độ 70oC, bị bất hoạt ở pH= 3

Ở nhiệt độ phòng, khi bị tác động trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formaldehyde, iodine, vikon và cồn thì hiệu giá của virus sẽ giảm Nghiên cứu in vitro cho thấy PCV2 có khả năng đề kháng tốt với nhiệt độ Nhiệt độ > 75oC trong 1 giờ mới làm giảm hiệu giá virus Do đó, PCV2 có khả năng tồn tại một thời gian dài trong điều kiện tại các trang trại Có thể phân lập được PCV2 trong bệnh phẩm của lợn bảo quản ở -70oC (Ellis et al., 1998)

Khả năng đề kháng với chất sát trùng cũng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu trong điều kiện in vitro Potassium peroxymonosulfate (KHSO5), sodium hydroxide (NaOH) khiến cho PCV2 bị bất hoạt trong thời gian ngắn thì hỗn dịch NH4/glutaraldehyde cần phải thời gian dài hơn mới bất hoạt được virus

này (Kim et al., 2010) Formaldehyde có hiệu quả kém hơn so với các chế phẩm

trong thành phần có iodine và phenol, mà không ảnh hưởng đến hiệu giá của

virus (Martin et al., 2010) Nhìn chung, việc giảm hiệu giá của PCV2 trong điều

kiện in vitro khi sử dụng sản phẩm có chứa chất oxy hóa, halogen hoặc NaOH là

8

rõ rệt hơn so với các chế phẩm có iodine, alcohol, phenol hoặc formaldehyde

(Royer et al., 2001) Việc bất hoạt hoàn toàn PCV2 trong điều kiện in vitro rất

khó khăn và đòi hỏi thời gian dài (Yilmaz and Kaleta, 2004)

2.2.2.1 Loài cảm thụ

PCV2 phân bố rộng rãi ở loài lợn, các loài vật khác không mẫn cảm với PCV2 Gần đây, nghiên cứu của (Potter et al., 2012) đã khẳng định bản chất di truyền của từng giống lợn có ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm với PCVAD

Chen et al (2007) cho biết trong các loài được kiểm tra huyết thanh học

gồm lợn, gà, vịt, dê và trâu, bò thì chỉ xác định được kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh của lợn

2.2.2.2 Chất chứa mầm bệnh

Mầm bệnh có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc PMWS, trong huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng (Segalés et al., 2005)

Nguồn: Segalés et al (2008)

Virus còn có thể bài thải qua nhiều đường khác nhau trong một thời gian dài; trong đó bài thải qua tinh dịch, phân, nước tiểu, sữa non, sữa từ lợn nhiễm bệnh (Chiou et al., 2011; Patterson et al., 2010; Segalés et al., 2005) Việc tăng bài thải virus ở động vật có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của PCVAD thường cao hơn rõ rệt so với lợn không có biểu hiện triệu chứng bệnh

9

2.2.2.3 Phương thức truyền lây

PCV2 có thể dễ dàng lây nhiễm và gây bệnh ở lợn khi các yếu tố ngoại cảnh bất lợi tác động vào như: mật độ quá dày, lợn đang bị stress, chăm sóc vệ sinh kém, hệ thống cùng vào cùng ra chưa áp dụng đúng mức yêu cầu…

Sự lây lan của PCV2 ở đàn lợn địa phương đã được báo cáo ở các phạm vi

khác nhau từ lợn sang lợn (Dupont et al., 2009; Shen et al., 2010), từ người sang lợn (Alarcon et al., 2011), từ động vật gặm nhấm sang lợn (Lórincz et al., 2010),

từ ký sinh trùng sang lợn (Blunt et al., 2011; Yang et al., 2012), từ môi trường chuồng trại sang lợn (Verreault et al., 2010)

Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng - mũi Bệnh có thể lây qua tiếp xúc, qua phân, qua đường hô hấp và tinh dịch của lợn đực giống Bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) có thể xác định được mầm bệnh

có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc PMWS, trong huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng (Segalés et al., 2005)

PCV2 cũng có thể truyền trực tiếp từ mẹ sang con qua nhau thai, là nguyên nhân khiến cho mầm bệnh tồn tại lâu trong đàn, lợn con bị nhiễm virus ngay từ khi mới sinh Tuy nhiên, đường truyền lây này ít gặp Ngoài ra, PCV2 còn được tìm thấy trong sữa đầu, nhưng để khẳng định được đây có phải là đường truyền lây bệnh hay không thì cần phải tiếp tục nghiên cứu (Gillespie et al., 2009)

2.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Cho đến nay, ảnh hưởng của PCV2 đến hệ miễn dịch của lợn vẫn còn nhiều tranh cãi và cần phải có các nghiên cứu để làm sáng tỏ Nghiên cứu cần tập trung làm rõ tác động qua lại giữa giai đoạn sau nhiễm trùng và trước khi biểu hiện triệu chứng lâm sàng để giải thích hiện tượng nhiễm trùng cấp tính hoặc mạn tính Điểm đặc trưng quan trọng nhất quan sát được khi lợn bị hội chứng PCVAD là số lượng bạch cầu giảm rất nhanh (leucopenia) PCV2 tác động làm giảm tế bào lympho và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như tế bào đơn nhân, đại thực bào và tế bào tua (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch dẫn tới tác động đáng kể lên sức sản xuất ở lợn như tăng trọng trung bình hàng ngày, tỷ lệ chuyển đổi thức ăn, khoảng thời gian mang thai, lứa đẻ, stress, đồng nhiễm

(Opriessnig et al., 2007), từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh

khác xâm nhập và gây bệnh

Opriessnig et al (2007) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong đàn có thể bị

nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng

Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là cấu trúc và độc lực virus, giống lợn, sự đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ thể Ở lợn cùng tiêm một loại vắc xin nhưng có chất bổ trợ khác nhau (đặc biệt bổ trợ dầu) sẽ làm cho thời gian nhiễm virus cũng như số lượng PCV2 trong huyết thanh và mô bào tăng lên, tế bào lympho bị tổn thương nặng hơn so với những lợn được tiêm vắc xin bổ trợ là keo phèn (Vanderstichel and Hurnik, 2003; Marlin et al., 2006) Thí nghiệm của (Krakowka et al., 2007) cũng cho thấy khi lợn được tiêm vắc xin

phòng bệnh do M hyopneumoniae, sau đó gây nhiễm PCV2 thì thời gian PCV2 có

đồng thời với một số mầm bệnh truyền nhiễm hoặc không truyền nhiễm (Rovira et

al., 2002) Do đó PCV2 được coi là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây thành bệnh (Tomás et al., 2008) Darwich et al (2003) cho biết có thể một số mầm bệnh

có cùng cơ chế sinh bệnh gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của lợn, khiến cho lợn nhiễm PCV2 có triệu chứng của PMWS

2.2.4.1 Triệu chứng lâm sàng

Những mô tả trước đây của Gillespie et al (2009), Opriessnig et al., (2007), Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2012) cho thấy cho thấy hiện tượng xác gầy và sưng ở các hạch lympho (đặc biệt hạch bẹn nông và hạch màng treo ruột) là phổ biến (tỷ

lệ dao động từ 94,87 % đến 100%), Lâm Thị Thu Hương (2012) cho biết biến đổi bệnh tích đại thể của lợn mắc chứng PMWS nuôi tại miền Đông Nam Bộ chủ yếu

là sưng hạch bẹn (89,09%), Bùi Trần Anh Đào và cs (2015) cho thấy triệu chứng lâm sàng điển hình của lợn mắc PCV2 thu thập được là còi cọc, lông thô, khô xơ xác (100%), ngoài ra có một tỷ lệ lớn (83,72%) lợn có triệu chứng về hô hấp và 67,44% lợn bị ỉa chảy Các triệu chứng khác xuất hiện ít hơn ở một số lợn như hạch bẹn mông sưng (tỷ lệ 48,44%), da nhợt nhạt (41,86%), viêm da (19,95%), hoàng đản (9,03%), viêm khớp (11,6%) và co giật (9,98%)

12

Hình 2.6 Một số triệu chứng lâm sàng điển hình ở lợn nghi mắc PMWS

Nguồn: Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp (2012)

2.2.4.2 Bệnh tích

Lợn mắc PMWS nhìn chung hiện tượng sưng và xuất huyết ở các hạch lympho là phổ biến Ngoài ra, các tổn thương còn biểu hiện ở một số cơ quan như phổi có biểu hiện viêm ở các mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết (Gillespie et al., 2009; Opriessnig et al., 2007) Lâm Thị Thu Hương (2012) cho biết biến đổi bệnh tích đại thể của lợn mắc chứng PMWS chủ yếu

là sưng hạch bẹn (89,09%), sưng hạch màng treo ruột (60,00%), viêm phổi kẽ (63,64%); ngoài ra còn có một tỷ lệ bị teo gan (30,91%), thận có điểm trắng (26,30%) và loét dạ dày vùng thực quản (28,18%) Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2012) cho thấy hiện tượng sưng ở các hạch lympho là phổ biến (tỷ lệ dao động từ 94,87 % đến 100%); tỷ lệ 160 có bệnh tích ở hạch amidan là 53,85%, biểu hiện ở một số cơ quan như phổi (92,31% các trường hợp có biểu hiện viêm ở các mức độ khác nhau, nhiều trường hợp bị viêm dính màng phổi với thành lồng ngực), gan (41,02%), thận (30,77%) và ruột 163 (28,21%), lách (17,95%) Bùi Trần Anh Đào và cs (2015) cũng chỉ ra bệnh lý đại thể chủ yếu

13

biểu hiện ở đường hô hấp (90,7%), tiêu hóa (86%) và hệ lympho (86%): hạnh lympho sưng to, xuất huyết, phổi xuất huyết, xen kẽ giữa vùng lành và vùng tổn thương; ruột chứa đầy hơi, thành ruột mỏng, niêm mạc ruột xuất huyết

điểm hoại tử

Hình 2.7 Một số triệu chứng bệnh tích điển hình ở lợn nghi mắc PMWS

Nguồn: Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp (2012)

14

2.2.5.1 Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (PMWS)

Hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS) được phát hiện lần đầu tiên tại Canada vào những năm đầu thập niên 1990 Bệnh thường xảy ra ở lợn từ 5 – 16 tuần tuổi, phổ biến nhất là từ 8-12 tuần tuổi Tỷ lệ ốm thường dao động từ 4 - 30% (đôi khi lên đến 50 - 60%),

tỷ lệ chết khoảng từ 4 - 20% nhưng cũng có thể 50% Do khi lợn mắc bệnh thường còi cọc và giảm hiệu quả kinh tế nên khoảng 70 – 80% lợn có triệu chứng PCVAD bị giết thịt

Triệu chứng của PMWS thường không đặc trưng và thay đổi tùy ca bệnh Bằng thực nghiệm quan sát thấy hiện tượng còi cọc, da nhợt nhạt, thở khó, đôi khi bị ỉa chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng đản Giai đoạn đầu bị bệnh các hạch lympho ngoại vi đều bị sưng to (Sagalés, 2012)

Bệnh tích đặc trưng khi mổ khám thấy các hạch lympho bị sưng to trong giai đoạn đầu của bệnh Bệnh tiến triển, hạch lympho trở lại kích thước bình thường và thậm chí bị teo nhỏ, tuyến ức bị teo Phổi có thể sưng to, dai chắc như cao su, tương ứng với bệnh tích vi thể viêm kẽ phổi Nhiều trường hợp phế quản

bị viêm tơ huyết Gan, phổi, thận, tim trong nhiều trường hợp bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt nhỏ Một số lợn bị hoàng đản trong giai đoạn cuối của bệnh Thận có nốt hoại tử màu trắng (viêm kẽ thận không có mủ)

2.2.5.2 Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)

Hội chứng này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1993 tại Anh PDNS xảy ra

ở lợn con, lợn thịt và lợn trưởng thành (11 - 14 tuần tuổi) Tỷ lệ nhiễm khoảng dưới 1% nhưng đôi khi có thể cao hơn Tỷ lệ chết có thể lên đến 100% ở đàn lợn trên 3 tháng tuổi nhưng chỉ khoảng 50% với lợn nhỏ hơn Lợn chết chỉ sau một vài ngày có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Những con sống sót có thể tăng trọng trở lại sau 7 - 10 ngày

Lợn mắc PDNS có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn, sốt (41oC) hoặc không sốt, nằm một chỗ, lười vận động hoặc đi lại khó khăn, cứng nhắc Triệu chứng rõ nhất là trên da xuất hiện những đám phát ban có màu đỏ tía, không có hình dạng nhất định, bắt đầu ở vùng chân sau và mông, có trường hợp nốt ban lại phân tán khắp cơ thể Bệnh tiến triển, hình thành đám vẩy sẫm ở những nơi có bệnh tích, sau đó nhạt màu dần, đôi khi để lại sẹo

15

Thường thì bệnh tích ở da và thận đều xuất hiện khi lợn mắc PDNS, tuy nhiên có những trường hợp chỉ biểu hiện một trong hai bệnh tích trên Bệnh tích đại thể là hiện tượng hoại tử và xuất huyết mô bào, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử mạch máu Hạch lympho, đặc biệt là hạch bẹn và hạch ở thận xuất huyết màu đỏ, sưng to Lợn chết ở thể cấp tính, hai bên thận sưng to, trên bề mặt có nốt màu trắng, phù thũng bể thận, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử có mủ tiểu cầu thận và viêm kẽ thận Lách bị nhồi huyết

Giống như các trường hợp mắc PMWS, có nhiều căn nguyên được xác định kết hợp với PCV2 gây nên hội chứng viêm da viêm thận ở lợn Hiện nay mặc dù

có nhiều giả thuyết đưa ra nhưng vẫn chưa xác định được nguyên nhân gây bệnh Một nghiên cứu công bố năm 2004 (Wellenberg et al., 2004) cho biết hàm lượng kháng thể IgG và IgM kháng PCV2 tăng lên trong các ca mắc PDNS Đây có thể

là nguyên nhân gây viêm cầu thận và viêm mạch quản do hậu quả rối loạn hệ

>90 ngày, lợn con sinh ra bình thường Mổ khám thai chết có hiện tượng gan xung huyết, tim sưng to, trên bề mặt có nhiều điểm hoại tử Bệnh tích vi thể rõ nhất là

hiện tượng cơ tim bị viêm tơ huyết hoặc hoại tử Tuy nhiên, dữ liệu từ các trường hợp cho thấy rằng hầu hết các đàn lợn nuôi dường như được miễn dịch với hội chứng này (Opriessnig et al., 2007)

2.2.5.4 Hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn (PCV2 – Associated Respiratory Disease)

Hội chứng này cũng đóng vai trò gây bệnh đường hô hấp phức hợp ở lợn Bệnh xảy ra ở lợn từ 8 – 16 tuần và thường cộng phát với một số nguyên nhân

16

khác Triệu chứng bao gồm giảm khả năng tăng trọng, giảm chuyển hóa thức ăn, lợn mệt mỏi, sốt, ho và khó thở Bệnh tích đặc trưng gồm viêm kẽ phổi, phế quản viêm loét hoặc hoại tử nặng, phế nang viêm tơ huyết (Harms et al., 2002)

2.2.5.5 Hội chứng viêm ruột ở lợn (PCV2 – Associated Enteritis)

Thường xảy ra ở lợn từ 8 – 16 tuần tuổi, gây chứng viêm hồi tràng mạn tính

có liên quan đến Lawsonia intracellularis Lợn bị bệnh có triệu chứng tiêu chảy,

còi cọc, giảm tăng trọng và tăng tỷ lệ chết

Bệnh tích bao gồm viêm ruột dạng hạt, rõ nhất là ở các mảng Peyer’s Hạch màng treo ruột bị sưng to, niêm mạc ruột tăng sinh dày lên

Một số nghiên cứu gần đây cho biết lợn bị nhiễm PCV2 có thể gây viêm mạch quản tiểu não và viêm xuất huyết màng não PCV2 còn liên quan đến triệu chứng opisthotonus, chứng giật cầu mắt và co giật ở lợn từ 6 – 8 tuần tuổi

(Gillespie et al., 2009) Tuy nhiên theo một số tác giả khác PCV2 lại không có

liên quan gì đến hội chứng thần kinh ở lợn (Segalés, 2011)

2.2.5.6 Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng (PCV2 subclinical infection)

Dựa vào kết quả huyết thanh học cho thấy tỷ lệ nhiễm PCV2 là rất cao nhưng tỷ lệ lợn có triệu chứng lâm sàng thấp hơn rất nhiều, điều đó có nghĩa bệnh do PCV2 gây ra biểu hiện ở thể cận lâm sàng (Segalés, 2011) PCV2 có thể nhiễm trong 1 – 2 hạch lympho nhưng lợn không có triệu chứng điển hình Tuy nhiên, sự nhiễm PCV2 này sẽ làm giảm hiệu quả việc sử dụng vắc xin; bên cạnh

đó, mặc dù lợn khỏe mạnh nhưng vẫn có hiện tượng hạch lympho bị sưng to, viêm hoại tử nên có trường hợp phải hủy bỏ thân thịt khi giết mổ

17

chứng lâm sàng, đặc biệt tỷ lệ mắc và chết do PMWS Cần chẩn đoán phân biệt triệu chứng hô hấp ở lợn mắc bệnh Tai xanh với hội chứng PMWS Trong trường hợp PDNS, cần chẩn đoán phân biệt với một số nguyên nhân gây viêm da cũng như các bệnh gây xuất huyết ở thận; đặc biệt với bệnh dịch tả lợn cổ điển, dịch tả lợn Châu Phi Bên cạnh đó, cũng cần phân biệt hội chứng rối loạn sinh sản do PCV2 với các bệnh gây sảy thai và con chết yểu

2.2.6.2 Ch ẩn đoán huyết thanh học

Chẩn đoán huyết thanh học rất có ý nghĩa trong việc xác định sự phơi nhiễm PCV2 trong quần thể lợn Tuy nhiên, giá trị chẩn đoán của các phản ứng huyết thanh học vẫn còn là câu hỏi cần bàn cãi vì nhiều lợn khỏe mạnh có kháng thể dương tính nên nếu dùng để chẩn đoán PCVAD thì sẽ không phân biệt được đàn có bệnh và đàn không có bệnh Các phương pháp thường được sử dụng là ELISA (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay), miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, phản ứng IPMA (immunoperoxidase monolayer assay), phản ứng trung hòa virus, …

2.2.6.3 Chẩn đoán sinh học phân tử

Việc xác định kháng nguyên PCV2 được coi là "gold standard" để chẩn đoán PCVAD với phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là kỹ thuật PCR, in situ hybridization (ISH),

Opriessnig et al (2007) cho biết kỹ thuật PCR được sử dụng gồm: 1)

Multiplex PCR: có thể xác định một số sản phẩm PCR được nhân lên; 2) Nested PCR: giúp tăng khả năng xác định một lượng nhỏ sản phẩm PCR được nhân lên; 3) Multiplex-nested PCR: dùng để phát hiện đồng thời PCV1/PCV2/PPV và PCV1/PCV2; 4) Quantitative real - time PCR: để xác định lượng PCV2 genomic copy trong huyết thanh hoặc mô bào; 5) Reverse transcription PCR: để xác định PCV2 ARN có mặt khi PCV2 nhân lên Theo Segalés (2011), sử dụng kỹ thuật "real time quantitative PCR" xác định số lượng kháng nguyên (hoặc nucleic acid) trong 1ml huyết thanh hoặc trong 500ng mô bào của phôi cũng rất có ý nghĩa, có thể chẩn đoán được bệnh do PCV2 gây ra Tuy nhiên phương pháp này mới chỉ được áp dụng giới hạn ở một số phòng thí nghiệm

18

2.2.6.4 Chẩn đoán phân biệt

Ngoài PCV2 gây hội chứng còi cọc sau cai sữa, một số bệnh khác có triệu chứng tương tự như Hemaglutinating Encephalomyelitis, bệnh do porcine

teschovirus nên cần chẩn đoán phân biệt

2.2.7.1 Vệ sinh phòng bệnh

Mối quan hệ giữa quản lý đàn và điều kiện chăn nuôi với quá trình nhiễm PCV2: Một số nghiên cứu về dịch tễ học đã khẳng định rằng vấn đề quản lý trang trại, nhà xưởng, chuồng trại và điều kiện chăn nuôi có ảnh hưởng lớn đến khả

năng phát sinh dịch PCVAD (Dewey et al., 2006; Woodbine et al., 2007) Điều

đó có nghĩa là điều kiện chăn nuôi ở trang trại sẽ có thể khiến cho PCV2 nhân lên với số lượng lớn, hoặc trực tiếp hoặc gián tiếp Thực tế, phương thức chăn nuôi

và quản lý đàn có ảnh hưởng rất lớn đến sự bùng phát PCV2 trong đàn Trong nghiên cứu này tác giả cũng khuyến cáo quy mô đàn khi cai sữa và sự ghép đàn trong chăn nuôi công nghiệp có ảnh hưởng rất lớn đến tuổi nhiễm PCV2 Do đó gợi ý các kỹ thuật thực hành trang trại giúp hạn chế, thay đổi quá trình nhiễm PCV2, khiến cho lợn nhiễm PCV2 sớm và do đó nguy cơ mắc PCVAD cao hơn

(Andraud et al., 2008) Kết hợp với thông tin lứa tuổi nhiễm và nguy cơ mắc

PCVAD, người ta cho rằng hiện tượng chia tách lợn từ nhiều nguồn khác nhau được thực hiện cho đến khi nguy cơ giảm xuống (khoảng hơn 7 tuần) cũng sẽ làm giảm nguy cơ mới mắc các bệnh liên quan đến PCV2 (Rose et al., 2012)

2.2.7.2 Biện pháp phòng bệnh

Áp dụng đồng bộ nhiều biện pháp phòng, chống như:

- Thay đổi phương thức chăn nuôi, chuyển từ chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán sang chăn nuôi theo hướng công nghiệp

- Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi

- Chuồng trại phải đảm bảo vệ sinh thú y như thường xuyên quét dọn, tiêu độc khử trùng, thoáng mát vào mùa hè, che ấm vào mùa đông Định kỳ phun tiêu độc khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi bằng các loại thuốc sát trùng Phân, nước tiểu, chất thải trong chăn nuôi phải được thu gom xử lý bằng các phương pháp thích hợp Kiểm soát tốt các nguồn nguyên vật liệu khi đưa vào trang trại,

19

- Lợn mua về cần được kiểm dịch, phải tôn trọng quy tắc cách ly triệt để lợn mới mua về Trong thời gian cách ly đảm bảo lợn không bị bệnh hoặc kết quả kiểm tra huyết thanh đảm bảo mới được phép nhập đàn

- Chăm sóc nuôi dưỡng tốt nhằm nâng cao sức đề kháng cho đàn lợn, tránh stress, tạo môi trường thuận lợi để lợn sinh trưởng phát triển

Theo Gillespie et al (2009) việc sử dụng kháng sinh (ví dụ sử dụng chlorotetracycline để điều trị bệnh do M hyopneumoniae gây ra) hoặc kháng sinh

phòng vi khuẩn kế phát có thể giúp phòng được bệnh do PCV2 gây ra rất hiệu quả Ngược lại, một số yếu tố khác như sự nhiễm PRRSV, TTV và PPV, quy mô đàn cai sữa lớn, lại là nguy cơ làm cho PCVAD phát sinh; vì vậy việc giảm các yếu tố nguy cơ này sẽ giúp hạn chế bệnh

2.2.7.3 Phòng bệnh bằng vắc xin

Hiện nay, nhiều loại vắc xin cho PCV2 có trên thị trường bao gồm: vắc xin virus PCV2 vô hoạt, vắc xin protein capsid của virus PCV2, vắc xin virus tái tổ hợp PCV1 và PCV2 vô hoạt

Sử dụng vắc xin được coi là hiệu quả nhất trong các biện pháp phòng PCVAD Tại Mỹ, có khoảng 99% lợn được sử dụng vắc xin phòng bệnh do

PCV2 gây ra (Shen et al., 2012) và tỷ lệ này cũng rất cao tại Anh/Châu Âu (Wieland et al., 2012) Hiện nay có nhiều loại vắc xin được sản xuất từ các chủng

PCV2a Khi tiêm vắc xin cho lợn sẽ sản sinh kháng thể trung hòa, giúp giảm số lượng PCV2 trong cơ thể, từ đó giảm được lượng virus bài thải ra ngoài môi

trường và hạn chế được bệnh truyền ngang (Segalés et al., 2009)

Theo Yang et al (2007) khi thử nghiệm vắc xin vô hoạt PCV2 cho lợn

con 28 ngày tuổi cho thấy tỷ lệ lợn có bệnh tích đã giảm rõ rệt so với lợn không tiêm vắc xin Việc tiêm vắc xin sẽ giúp giảm khả năng nhiễm virus

cũng như nguy có mắc chứng còi cọc sau cai sữa Seo et al (2014) khi nghiên

cứu ảnh hưởng của việc tiêm vắc xin PCV2 cho thấy tiêm vắc xin đã làm giảm

số lượng virus huyết khi công cường độc bằng virus PCV2a hoặc PCV2b, giúp giảm nguy cơ mắc PCVAD Trong thực tế, O’Neill (2012) cho biết nếu dùng vắc xin cho lợn nái sẽ giúp giảm lượng virus huyết ở lợn con, giúp bảo vệ lợn con đến 8 tuần tuổi sau khi sinh

Bằng thực nghiệm người ta đã chứng minh được khả năng bảo hộ phụ thuộc vào lượng kháng thể thụ động Khi lượng kháng thể thụ động cao thì mức bảo hộ

20

tốt hơn khi mức kháng thể thấp, tuy nhiên không hoàn toàn bảo vệ lợn chống lại bệnh do PCV2 gây ra; nhưng nếu hiệu giá kháng thể thụ động thấp thì chắc chắn không bảo hộ được lợn (McKeown et al., 2005)

Kết quả thử nghiệm vắc xin thể ORF2 (Trần Thị Dân và cs., 2010) cho thấy lợn được chủng ngừa vắc xin không thay đổi các chỉ tiêu huyết học và ít bệnh tích liên quan đến PCV2 so với lợn không tiêm Hiệu quả kinh tế được cải thiện ở

lô thí nghiệm (tiêm vắc xin) so với lô đối chứng (không tiêm vắc xin) trong điều kiện trại nhiễm circovirus

Thống kê một số loại vắc xin phòng bệnh do PCV2 gây ra được phép nhập khẩu, lưu hành tại Việt Nam (Bảng 2.1)

Tiêm cho lợn nái liều lượng 2ml/con/lần Lịch trình như sau: lợn hậu bị: tiêm 2 mũi, cách nhau

3 - 4 tuần, mũi thứ 2 chậm nhất 2

tuần trước khi phối; nhắc lại 2-3

tuần trước khi đẻ Lợn nái: tiêm 2 mũi cách nhau 3 - 4 tuần, mũi thứ

2 chậm nhất 2 tuần trước khi đẻ Tiêm nhắc lại: đối với các lứa

tiếp theo, tiêm 1 mũi trước khi đẻ

2 - 3 tuần

(Intervet - Hà Lan)

Virus Circovirus type 2, vô hoạt

Vắc xin dùng cho lợn con khỏe

mạnh từ 3 tuần tuổi trở lên (tiêm

bắp với liều lượng 2ml/ con, tiêm

nhắc lại sau 3 tuần)

(Intervet - Hà Lan)

Kháng nguyên tiểu đơn vị ORF2 của Circovirus type 2 và Mycoplasma

hyopneumoniae

Vắc xin dùng cho lợn con khỏe mạnh từ 3 tuần tuổi trở lên (tiêm bắp với liều lượng 2ml/ con, tiêm nhắc lại sau 3 tuần)

Tiêm cho lợn con từ 3 tuần tuổi

trở lên, tiêm vào cơ ở cổ và ở vùng sau tai; tiêm 2 lần, mỗi lần 2ml và cách nhau 3 tuần

(Boehringer

Virus Circovirus type 2, vô hoạt

Tiêm bắp cho lợn khỏe mạnh từ 2-3 tuần tuổi trở lên, liều lượng 1 ml/con

+ Nái mang thai: mới tiêm vắc xin lần đầu: tiêm bắp 2 lần, mỗi lần 2ml vào lúc 4 - 5 tuần và 2 - 3 tuần trước khi sinh Tiêm lứa kế tiếp trở đi: tiêm bắp 1 lần 2ml vào lúc 2 - 3 tuần trước khi sinh + Lợn con: nếu sinh ra từ lợn mẹ

đã tiêm phòng: tiêm bắp 1 lần 2ml lúc 4 - 5 tuần tuổi Nếu lợn

mẹ chưa tiêm phòng: tiêm bắp 2

Tiêm bắp ở gốc tai cho lợn con

khỏe mạnh từ 2 – 3 tuần tuổi (liều lượng tiêm 2 ml/con)

(ChoongAng vaccine

Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophillus parasuis serotype 4, Haemophillus parasuis serotype 5, Circovirus type 2

Tiêm lần 1: lợn con một tuần tuổi, tiêm 2 ml/con, tiêm bắp tại phần đáy của tai

Tiêm lần 2: lợn con ba tuần tuổi, tiêm 2ml/con tiêm bắp tại đáy tai

(Daesung

Virus Circovirus type 2, vô hoạt

Tiêm 1 liều duy nhất (1 ml/con) cho lợn con lúc 1 ngày tuổi đến 3

- Lợn con: tiêm bắp 1ml/con, lợn

từ 3 tuần tuổi trở lên

- Lợn nái: tiêm bắp 2ml/con, lợn 5-6 tuần tuổi và 2-3 tuần trước khi đẻ tiêm thêm 2ml/con

- Lợn con: tiêm bắp 1ml/con, lợn

Bệnh do virus nên không có thuốc điều trị đặc hiệu Ferreira et al., (2001)

đã thử nghiệm dùng kháng huyết thanh để điều trị nhưng hiệu quả rất khác nhau

Trong thực tế có nhiều giả thuyết được đưa ra nhằm giải thích tại sao có nhiều căn nguyên kết hợp cùng với PCV2 trong hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa Trước hết, có thể một số mầm bệnh có cùng cơ chế sinh bệnh gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của cơ thể, khiến cho lợn nhiễm PCV2 có triệu chứng của

PMWS (Darwich et al., 2003) Opriessnig et al (2007) cho biết mặc dù hầu hết

lợn trong đàn có thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là cấu trúc và độc lực virus, giống lợn, sự đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ thể

Điều dễ dàng nhận thấy là nếu chỉ gây nhiễm PCV2 rất ít khi lợn biểu hiện triệu chứng lâm sàng (Okuda et al., 2003) Trong hầu hết các trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ khi được gây nhiễm đồng thời với một số mầm bệnh

23

truyền nhiễm hoặc không truyền nhiễm (Rovira et al., 2002) Do đó PCV2 được

coi là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây thành bệnh (Tomás et al., 2008) Tại Úc,

đến năm 2010, mặc dù đã chứng minh được đàn lợn nhiễm PCV2 nhưng vẫn chưa chứng minh được sự hiện diện của PMWS, giả thuyết được đưa ra là do

chưa có mầm bệnh kế phát cần thiết để PCV2 gây bệnh (Grau-Roma et al., 2010)

Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh trong điều kiện thực nghiệm một mình PCV2 không gây bệnh mà kết hợp với một số virus như PRRS, PPV, TTV mới gây bệnh thể lâm sàng Changhoon et al (2014) cho biết nhiễm ghép PRRS và PCV2 là một trong những đồng nhiễm phổ biến nhất liên quan đến bệnh lợn trong điều kiện thực nghiệm gần đây Krakowka et al (2000) cũng chứng minh PPV được xác định là ngoài nguyên nhân gây rối loạn sinh sản ở lợn còn góp phần khiến cho lợn nhiễm Porcine circovirus type 2 (PCV2) mắc PMWS Trong khi đó, TTV đồng nhiễm với PCV2 có thể là yếu tố nguy cơ khiến cho lợn có biểu hiện bệnh PCVAD thêm trầm trọng (Lee et al., 2010) Tại Việt Nam, đến nay mới có Hoàng Văn Năm (2012) đánh giá về tỷ lệ đồng nhiễm PRRRV và PCV2 ở lợn mắc PRRS, Lâm Thị Thu Hương (2012) nghiên cứu một số vi khuẩn cộng nhiễm trên heo mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa Nghiên cứu này tiến hành đánh giá sự đồng nhiễm PCV2 với một số virus PRRS, PPV, TTV, PCV3 trong điều kiện sản xuất thực tế tại các cơ sở chăn nuôi lợn ở Việt Nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chăn nuôi lợn là một trong những ngành chăn nuôi phát triển nhanh nhất trên toàn thế giới và đóng góp lớn cho nền kinh tế của nhiều quốc gia Theo

Vidigal et al (2012) các mầm bệnh truyền nhiễm đã thu hút rất nhiều sự chú ý

của các nhà nghiên cứu từ đầu những năm 1990 khi có rất nhiều quốc gia bị tổn thất kinh tế rất lớn từ các tác nhân gây bệnh ở lợn nhất là PCV2

* Các nghiên cứu về lưu hành và phân bố của PCV2:

Được phát hiện năm 1991 tại Canada nhưng nhiều kết quả nghiên cứu hồi cứu với các mẫu bệnh phẩm cho thấy đã có sự lưu hành của PCV2 ở đàn lợn từ năm 1969 tại Bỉ, năm 1970 tại Anh, năm 1973 tại Ireland, năm 1983 tại Canada

(Gillespie et al., 2009), và năm 1983 tại Tây Ban Nha (Rodriguez-Arrioja et al., 2003) (Jacobsen et al., 2009) xét nghiệm các mẫu hồi cứu từ năm 1961-1998

24

bằng kỹ thuật ISH và PCR đã khẳng định sự tồn tại của PCV2 ở lợn từ năm 1962 tại miền Bắc nước Đức

PCV2 được coi là virus gây bệnh quan trọng nhất trong ngành chăn nuôi

(Opriessnig et al., 2007) và được biết đến như là một virus gây bệnh thông thường

bởi vì sự hiện diện của nó trong hầu hết lợn nuôi (Baekbo et al., 2012) Tần suất hiện huyết thanh dương tính PCV2 với tỷ lệ tương đối cao 20-80% ở lợn kết hợp với tỷ lệ mắc bệnh cao là 60% và tỉ lệ chết là 40% tại các trang trại lợn bị ảnh

hưởng (Wang et al., 2009)

PCV2 được báo cáo ở rất nhiều nước trên thế giới bao gồm: Bắc và Nam

Mỹ, Châu Âu, Châu Á, Châu Đại Dương, Trung Đông và Caribê (Kayode et al., 2017) Hiện nay, các kết quả nghiên cứu đã xác định được tỷ lệ lưu hành huyết thanh kháng PCV2, phân lập và xác định genotype cũng như đánh giá được đặc tính di truyền và dịch tễ học phân tử của PCV2

Nguồn: Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs (2012)

Sự phân bố của PCV2 có sự khác nhau giữ các vùng địa lý:

- Châu Á: vụ dịch gần giống PMWS được mô tả tại Đài Loan năm 1995 Từ

đó đến nay PCV2 và PCVAD được xác định lưu hành ở Nhật Bản (Takahagi et

al., 2008), Hàn Qu ốc (An et al., 2007), Thái Lan (Jantafong et al., 2011) và Malaysia (Jaganathan et al., 2011)

Tại Trung Quốc, Wang et al (2009) đã giải trình tự 49 chủng thu thập từ nhiều vùng khác nhau và cho thấy 34 chủng thu thập từ năm 2002-2006 thuộc

25

genotype PCV2a, PCV2b, PCV2d và PCV2e, phổ biến nhất là PCV2b (18 chủng); 12 chủng thu thập trong giai đoạn 2007-2008 đều là PCV2b Bao et al (2017) trong một nghiên cứu hồi cứu 23 mẫu mô lợn dương tính với PCV2 trong giai đoạn 1990 đến 1999 cho kết quả 20/23 chủng thuộc genotype 2a, ba chủng còn lại hình thành một nhóm độc lập, chưa được báo cáo và đặt tên là PCV2f Tại Hàn Quốc, khi sử dụng kỹ thuật PCR kiểm tra 29 mẫu lợn mắc PCVAD

và 9 mẫu lợn không mắc PCVAD phát hiện được sự lưu hành của PCV2a và PCV2b; trong đó cả 29 chủng có nguồn gốc từ lợn mắc PCVAD và 4 chủng từ lợn không mắc PCVAD là PCV2b (Chae and Choi, 2010)

Tại Nhật Bản với 150 mẫu huyết thanh thu thập từ lợn 2-4 tháng tuổi nuôi tại 10 trang trại (15 mẫu/trại) chỉ phát hiện được PCV2a và PCV2b (Takahagi et al., 2008),

trong khi đó tại Thái Lan phát hiện được PCV2b và PCV2e (Jantafong et al., 2011)

- Châu Âu: hầu hết các nước xác định sự có mặt của PCV2b, là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế do PCVAD PCV2a còn được phát hiện ở đàn lợn nuôi tại Ireland từ các mẫu bệnh phẩm lợn mắc PCVAD thu thập từ năm 1997-2003 (trong 5/6 trại xét nghiệm) Trại còn lại phân lập được PCV2b có tỷ lệ chết rất cao (35%) so với 5 trại còn lại Tất cả mẫu thu được sau năm 2003 từ trại mắc hoặc không mắc PCVAD đều chỉ phát hiện được PCV2b

- Bắc Mỹ: hiện tượng đột biến chủng khiến cho PCV2b lưu hành phổ biến được nhiều người quan tâm nghiên cứu Lần đầu tiên PCV2b được xác nhận ở Canada vào năm 2005; sau đó là các công bố về PCV2 tại Kansas, North Carolina và Iowa Các nghiên cứu sau này đã cho thấy sự lưu hành của PCV2a và PCV2b trong khu vực (Gagnon et al., 2007; Olvera et al., 2007)

- Nam Mỹ: không có nhiều nghiên cứu về PCV2, đã xác định genotype phổ biến là PCV2b, cần có các nghiên cứu tiếp theo để khẳng định sự có mặt của

genotype PCV1/2a (Chiarelli-Neto et al., 2009)

- Châu Đại Dương: hiện tại có một số công bố của (O’Dea et al., 2011) về

PCVAD tại Úc; nghiên cứu của (Neumann et al., 2007) về PCV2 phân lập được tại New Zealand

* Kết quả giải trình tự gen và phân tích đặc điểm dịch tễ học:

Trước năm 2014, PCV2 được chính thức công nhận gồm có 3 genotype,

ký hiệu từ PCV2a, PCV2b và PCV2c (Segalés et al., 2008) Trong đó PCV2a chiếm ưu thế trước khi các vụ dịch chính xảy ra trên thế giới, sau đó PCV2b là