Ứng dụng kỹ thuật REALTIME PCR trong chẩn đoán bệnh sốt mf ở người do vi khuẩn ORIENTIA TSUTSUGAMUSHI

Các xét nghiệm chẩn đoán sốt mò có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định ca bệnh trên lâm sàng và nghiên cứu dịch tễ học của bệnh.. Các xét nghiệm này rất đa dạng về nguyên tắc thực hiệ

VŨ NGŨ NGŨ NGỌỌỌC LIÊNC LIÊNC LIÊN Ứ

ỨNG DNG DNG DỤỤỤNG KNG KNG KỸỸỸ THUTHUTHUẬẬẬT REALTIME PCR TRONG T REALTIME PCR TRONG T REALTIME PCR TRONG CH

CHẨẨẨN ĐOÁN BN ĐOÁN BN ĐOÁN BỆỆỆNH SNH SNH SỐỐỐT MÒ T MÒ T MÒ ỞỞỞ NGƯNGƯNGƯỜỜỜI DO VI KHUẨN I DO VI KHUẨN I DO VI KHUẨN ORIENTIA ORIENTIA

TSUTSUGAMUSHI TSUTSUGAMUSHI

Chuyên ngành: Công nghChuyên ngành: Công nghệệệ sinh hsinh hsinh họọọcccc

Mã s

Mã sốốố:60420201:60420201:60420201

LULUẬẬẬN VĂN THN VĂN THN VĂN THẠẠẠC SC SC SĨĨĨĨ

Hướng dẫn khoaHướng dẫn khoa họchọchọc::::

TSTSTS Lê Thị HộiLê Thị HộiLê Thị Hội

HÀ N

HÀ NỘỘỘI 2016I 2016I 2016 LLLLỜỜỜI CI CI CẢẢẢM ƠN M ƠN M ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới TS.Lê Thị Hội là người thầy, người hướng dẫn khoa học, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nghiên cứu, góp ý và sữa chữa luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- Ban Giám hiệu và phòng Đào tạo Sau Đại học của Viện Đại học

Mở Hà Nội

- Ban Giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những thầy cô, đồng nghiệp,

đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cũng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ và người thân trong gia đình, đặc biệt là chồng và con trai đã luôn cảm thông chia sẻ và hết lòng vì tôi trong cuộc sống cũng như trên con đường nghiên cứu khoa học

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2016

Vũ Ngũ Ngũ Ngọọọc Liênc Liênc Liên

LLLLỜỜỜI CAM ĐOANI CAM ĐOANI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nguyên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của thầy cô hướng dẫn

Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ một công trình nào

Tác giTác giảảả lululuậậận vănn vănn văn

DANH MDANH MỤỤỤC CÁC CHC CÁC CHC CÁC CHỮỮỮ VIVIVIẾẾẾT TT TT TẮẮẮTTT

dNTP - Dideoxynucleosid triphosphate

ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay -Xét

nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men

IIP - Indirect Immunoperoxidase– Xét nghiệm kháng

thể miễn dịch oxy hóa gián tiếp

O tsutsugamushi - Orientiatsusugamushi

PCR - Polymerase Chain Reaction - Phản ứng khuếch

đại chuỗi gen

RFA - Rapid Flow Assay -Xét nghiệm thẩm thấu nhanh

MỤỤỤC LC LC LỤỤỤCCC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ BỆNH SỐT MÒ 3

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ: VI KHUẨNORIENTIA TSUTSUGAMUSHI 6

1.4 DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỐT MÒ 9

1.4.1 Nguồn bệnh 9

1.4.2 Trung gian và phương thức truyền bệnh 9

1.5 SINH BỆNH HỌC CỦA BỆNH SỐT MÒ 11

1.6 BIỂU HIỆN LÂM SÀNG 12

1.6.1 Thời gian ủ bệnh 12

1.6.2 Thời kỳ khởi phát bệnh 12

1.6.3.Thời kỳ toàn phát 12

1.6.4.Thời kỳ hồi phục 15

1.7 ĐIỀU TRỊ VÀPHÒNG BỆNH 15

1.7.1 Điều trị đặc hiệu 15

1.7.2 Điều trị hỗ trợ 17

1.7.3 Phòng bệnh 17

1.8 XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN 17

1.8.1 Các phương pháp nuôi cấy và phân lập Orientia 17

1.8.2 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 26

2.2 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 28

2.2.2 Hóa chất 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.3.2 Tách chiết lớp tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) 30

2.3.3 Tách chiết DNA 31

2.3.4.Thiết kế cặp mồi và probe 32

2.3.5 Thành phần phản ứng (Master mix) 33

2.3.6 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Realtime PCR 34

2.3.7 Nhận định và phân tích kết quả 34

2.3.8 Phương pháp xác định độ đặc hiệu phản ứng 34

2.3.9 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng 35

2.3.10 Phương pháp đánh giá hiệu quả chẩn đoán của phương pháp trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng 35

2.4 ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH SỐT MÒ 36

3.1.1 Tuổi và giới của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm sốt mò 36

3.2 Phân bố bệnh nhân nghi ngờ sốt mò theo tháng 38

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR XÁC ĐỊNH O TSUTSUGAMUSHI 40

3.1.2.Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên DNA tổng số tách từ chủng vi khuẩn Orientia tsutsugamushi nuôi cấy 40

3.1.3 Độ đặc hiệu của phản ứng 43

3.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REALTIME PCRXÁC ĐỊNH VI

KHUẨN O TSUTSUGAMUSHITRỰC TIẾP TỪ MẪU BỆNH PHẨM 45

3.1.1 Tách chiết DNA 45

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 51

CHƯƠNG 5: KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 7

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Bảng phân loại bệnh Ricketssia [3], [14], [26], [29], [31] 4

Bảng 2.1: Các máy và thiết bị chính 28

Bảng 2.2: Trình tự mồi và probe sử dụng cho kỹ thuật Realtime PCR 33

Bảng 3.1: Phân bố của bệnh nhân theo giới 36

Bảng 3.2: Phân bố của bệnh nhân sốt mò theo lứa tuổi 37

Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân nghi ngờ sốt mò theo tháng 38

Bảng 3.4: Nồng độ và độ tinh sạch DNA 40

Bảng 3.5: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR trên plasmid tách dòng 43

Bảng 3.6: Độ đặc hiệu của phản ứng Realtime PCR 44

Bảng 3.7 Tỷ lệ bệnh nhân nghi ngờ sốt mò sử dụng phương pháp Realtime PCR 46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1:O tsutsugamushi (dấu mũi tên) trên tiêu bản nhuộm Diff-Quick 7

Hình 1.2: Chu kỳ lây nhiễm của bệnh sốt mò 10

Hình 1.3:Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang sau các chu kỳ của Real-time PCR 24 Hình 2.1 : Kit tách chiết DNA 29

Hình 3.1: Phân bố bệnh nhân theo giới 37

Hình 3.2: Phân bố của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm sốt mò theo lứa tuổi 38

Hình 3.3: Phân bố bệnh nhân nghi ngờ sốt mò theo tháng 39

Hình 3.4: Đường chuẩn Realtime-PCR từ DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn Orientia tsutsugamushi nuôi cấy 41

Hình 3.5: Đồ thị khuếch đại của mẫu vi khuẩn nuôi cấy pha loãng 42

Hình 3.6: Kết quả xác định độ đặc hiệu của phản ứng Realtime-PCR 44

Hình 3.7: Tỷ lệ bệnh nhân nghi sốt mò sử dụng phương pháp Realtime PCR 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt mò là bệnh truyền nhiễm cấp ‰nh do vi khuẩn ký sinh nội bào Orientia tsutsugamushi gây nên, có ổ bệnh thiên nhiên là các loài gặm nhấm với vector truyền bệnh là ấu trùng mò [1]

Trên thế giới, bệnh có xu hướng gia tăng ở một số nước Châu Á-Thái Bình Dương Nhiều báo cáo gần đây như ở Trung Quốc có 27.391 ca mắc mới trong thời gian từ 2006-2012, Thái Lan trên 200 ca mỗi năm [12],[13]

Việt Nam nằm trong vùng lưu hành của bệnh, bệnh phân bố ở đều khắp các tỉnh phía Bắc Tuy nhiên bệnh sốt mò vẫn còn ít được quan tâm do thiếu công vụ chẩn đoán, nhiều trường hợp sốt mò còn chưa được chẩn đoán xác định và điều trị tại các tuyến cơ sở [2]

Bệnh có biểu hiện là sốt cao liên tục, vết đốt xuất hiện trên da ở khoảng 20% số bệnh nhân, phát ban và nổi hạch toàn thân Bệnh có thể tiến triển nặng do sốt cao liên tục nhiều ngày và có thể dẫn đến gây tử vong nếu không được chẩn đoán đúng và điều trị đặc hiệu Các xét nghiệm chẩn đoán sốt mò

có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định ca bệnh trên lâm sàng và nghiên cứu dịch tễ học của bệnh Các xét nghiệm này rất đa dạng về nguyên tắc thực hiện cũng như khả năng áp dụng thực tế.Trong đó phương pháp sinh học phân tử Realtime PCR là phương pháp được ứng dụng nhiều trongchẩn đoán

do có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao

Việc chẩn đoán Orientia tsutsugamushi trong phòng thí nghiệm trên thế giới cũng như ở Việt Nam chủ yếu dựa vào phản ứng huyết thanh học và sinh học phân tử vì các Orientia tsutsugamushi rất khó nuôi cấy do tính chất

ký sinh nội bào bắt buộc của nó (đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh học cấp

3) Tuy nhiên, phản ứng huyết thanh học trong chẩn đoán Orientia tsutsugamushi có những điểm hạn chế nhất định làm giảm giá trị của kỹ thuật này trong việc chẩn đoán sớm Đó là: (I) đáp ứng miễn dịch kháng thể chỉ có thể phát hiện được ở tuần thứ hai của bệnh; (II) không có ngưỡng giá trị thấp nhất của hiệu giá kháng thể giới hạn cho chẩn đoán; (III) mẫu máu kép để tìm động lực kháng thể cho chẩn đoán xác định là yêu cầu bắt buộc cho chẩn đoán song không phải lúc nào cũng đảm bảo được; (IV) có phản ứng chéo xảy

ra giữa các loài khác nhau; (V) Orientia tsutsugamushie khó nuôi cấy nên việc sản xuất kháng nguyên phục vụ cho chẩn đoán huyết thanh học cũng gặp khó khăn [4,6]

Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là bệnh viện đầu ngành về truyền nhiễm trên cả nước Hàng năm, theo báo cáo các ca bệnh nghi nghờ sốt mò khá lớn, tuy nhiên chưa có một phương pháp xác định chính xác vi khuẩn Orientia tsutsugamushi gây bệnh sốt mò được áp dụng tại các bệnh viện và các cơ sở y tế

Do tính cấp thiết như vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: ““““ỨỨỨNG DNG DNG DỤỤỤNG NG NG KKKỸỸỸ THU

THUẬẬẬT REALTIME PCR TRONGT REALTIME PCR TRONGT REALTIME PCR TRONG CHCHCHẨẨẨN ĐOÁN BN ĐOÁN BN ĐOÁN BỆỆỆNH SNH SNH SỐỐỐT MÒ T MÒ T MÒ ỞỞỞ NGƯNGƯNGƯỜỜỜI DO VI I DO VI KHUẨN

KHUẨN ORIENTIA TSUTSUGAMUSORIENTIA TSUTSUGAMUSORIENTIA TSUTSUGAMUSHIHIHI” ” ”

với các mục tiêu như sau:

CHƯƠNG 1: TCHƯƠNG 1: TỔỔỔNG QUANNG QUAN1.1 VÀI NÉT V

1.1 VÀI NÉT VỀỀỀ LLLLỊỊỊỊCH SCH SCH SỬỬỬ BBBỆỆỆNH SNH SNH SỐỐỐT MÒT MÒT MÒ

Bệnh được biết đến từ rất sớm, mô tả đầu tiên về trường hợp có triệu chứng tương tự sốt mò được tìm thấy tại Trung Quốc vào thế kỉ thứ 3 trước công nguyên với tên gọi “Sha-shi” Năm 1810, Hishimoto (Nhật Bản) tìm ra căn nguyên gây bệnh là Thrombidide’s và đặt tên là tsutsugamushi Năm 1910, Brumpt phát hiện Trombiculaakamushi là trung gian truyền bệnh hay gặp nhất Năm 1930, Nagayo đặt tên bệnh là Orientia tsutsugamushiorientalis, sau đó Ogata đổi thành Orientia tsutsugamushi hay “Scrub Typhus”

Trong chiến tranh thế giới thứ hai, bệnh sốt mò là nỗi kinh hoàng cho binh sĩ của các bên tham chiến tại Châu Á- Thái Bình Dương với số ca mắc bệnh và tỷ lệ tử vong cao do chưa tìm được thuốc điều trị đặc hiệu

Việt Nam là một nước nằm trong vùng lưu hành của bệnh Đầu thế kỷ

XX, Yersin và Vassal đã có mô tả về một loại bệnh giống với sốt phát ban do chấy rận nhưng khác với bệnh trên ở tính chất phát ban Ở Việt Nam, sốt mò được ghi nhận từ rất sớm và được phát hiện ở cả ba miền Bắc, Trung và Nam

Từ năm 1918 bệnh sốt mò được mô tả lẻ tẻ về lâm sàng trong quân đội viễn chinh Pháp nhưng đến năm 1965 bệnh mới chính thức được xác nhận Từ đó đến nay thỉnh thoảng vẫn có những vụ dịch sốt mò xảy ra Tháng 6 năm 1965 một vụ dịch xảy ra ở Sơn La Năm 1969 dịch xảy ra trong quân đội tại tỉnh Hà Tuyên với 175 bệnh nhân và 2 ca tử vong [3]

1.2 Đ

1.2 ĐẶẶẶC ĐIC ĐIC ĐIỂỂỂM CHUNG VÀ PHÂN LOM CHUNG VÀ PHÂN LOM CHUNG VÀ PHÂN LOẠẠẠI BI BI BỆỆỆNH DO NH DO NH DO ORIENTIA TSUTSUGAMUSHIORIENTIA TSUTSUGAMUSHIORIENTIA TSUTSUGAMUSHI Bệnh do Orientia tsutsugamushi có những đặc điểm chung là:

- Bệnh được truyền bởi các côn trùng chân đốt

- Tổn thương đặc hiệu của bệnh là nội mạc mạch máu

- Có các triệu chứng chung là sốt cao, phát ban

- Điều trị: Vi khuẩn Orientia tsutsugamushi đều nhạy cảm với các kháng sinh nhóm cyclin và chloramphenicol [3], [34]

Chân đốt

Động vật

Đường lây chính

Gây dịch

Weil Felix Nhóm s

nhấm, chó

Ve đốt Tản

phát

OX19 OX2

nhấm, chó

Ve đốt Tản

phát

OX19 OX2

chuột Sốt nổi

mụn

R akari Mỹ,

Nga, Châu Phi

Mò hút máu

Gặm nhấm, chó

Mò đốt

Tản phát

Âm tính

Gặm nhấm nhỏ

Phân

bọ chét trên

da

Tản phát

Người Phân

chấy rận trên

da

Dịch lớn

Á, …

Ấu trùng

mò

Gặm nhấm hoang

dã

Mò đốt

Tản phát

OXk

B

Bệệệnh do các loài khácnh do các loài khácnh do các loài khác

Sốt Q Coxiella

burnetili

Khắp nơi

vật có

vú

Hít phải mầm bệnh

Dịch nhỏ

Âm tính

Sốt chiến

hào

R quintana Châu

Phi, Mỹ…

Rận, chấy

Người Phân

rận trên

da

Thành dịch

Âm tính

1.3 TÁC NHÂN GÂY B

1.3 TÁC NHÂN GÂY BỆỆỆNH SNH SNH SỐỐỐT MÒT MÒT MÒ:::: VI KHUVI KHUVI KHUẨẨẨNNNORIENTIA TSUTSUGAMUSHIORIENTIA TSUTSUGAMUSHIORIENTIA TSUTSUGAMUSHI Tác nhân gây bệnh sốt mò là do vi khuẩn Orientia tsusugamushi (trước kia gọi là Orientia tsutsugamushi orientalis hoặc R tsusugamushi) thuộc họ Rickettsia là vi khuẩn Gram âm, kích thước nhỏ 0.5-0.8 x 1.2-3 µm Vi khuẩn Orientiatsusugamushi là vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc Mỗi tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi một lớp thành tế bào rất mềm và một lớp màng tế bào Vỏ vi khuẩn không chứa các peptidoglycan và lypopolysaccharide [32]

Hình 1.1:

Hình 1.1:O tsutsugamushiO tsutsugamushiO tsutsugamushi (d(d(dấấấu mu mu mũi tũi tũi tên) trên tiêu bên) trên tiêu bên) trên tiêu bảảản nhun nhun nhuộộộm Diffm Diffm Diff QuickQuickQuick

Orientia tsutsugamushi có đặc điểm trung gian giữa vi khuẩn và virus

quang học: hình cầu hoặc hình que

ngắn, hình sợi, xếp riêng rẽ từng con,

từng đôi, hoặc thành từng đám ở

trong bào tương tế bào chủ

- Vật liệu di truyền chứa DNA - Chịu

sự tác dụng của kháng sinh

- Ký sinh nội bào bắt buộc

- Không nuôi cấy được trong các môi trường nuôi cấy thông thường

- Xâm nhập vào tế bào vật chủ thông qua cơ chế thực bào, đi vào tế bào chất, phát triển ở vùng cận nhân tế bào Vi khuẩn giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ bằng cách nảy chồi và được bao bọc bởi một lớp màng tế bào vật chủ tương tự như virus có vỏ

Phân lo

Phân loạạại:i:i: Trước kia O tsutsugamushi có tên gọi là R tsutsugamushi thuộc họ Rickettsia, là loài duy nhất trong nhóm sốt mò Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây chỉ ra sự khác biệt lớn về mặt cấu trúc và di truyền của R tsutsugamushi với các Orientia tsutsugamushi khác Khi phân tích trình tự gen 16S rARN, khoảng cách khác biệt giữaR tsutsugamushi và các vi khuẩn khác trong giống Orientia tsutsugamushi gần bằng với khoảng khác biệt tiến hóa giữa các giống trong họ Orientia tsutsugamushile[15].Vì vậy R tsutsugamushiđược tách ra một giống riêng mang tên O tsutsugamushi

O tsutsugamushicó sức đề kháng yếu, thường bị tiêu diệt nhanh bởi nhiệt độ cao và các thuốc sát trùng thông thường

Các chủng Orientia có tính kháng nguyên rất đa dạng tùy thuộc vào vật chủ trung gian và vùng địa lý Sự khác biệt về mặt kháng nguyên của các chủngOrientia có thể xác định được bằng phương pháp huyết thanh học và phương pháp sinh học phân tử Một vùng địa lý có thể có nhiều chủng Orientia cùng tồn tại nên dễ xảy ra hiện tượng tái nhiễm và khó khăn trong quá trình sản xuất vắc xin Có 3 type huyết thanh chính là Karp, Kato và Gilliam; ngoài ra có hơn 30 type huyết thanh khác đã được xác định Các kháng nguyên của Orientia tsutsugamushi có tính đặc hiệu cao không gây miễn dịch chéo với các kháng nguyên Ricketsia khác [1],[2],[3],[4]

Quá trình xâm nhập của O tsutsugamushi vào tế bào vật chủ bắt đầu bằng việc gắn kết với các phân tử protein trên bề mặt tế bào, chủ yếu là các proteglycan mang heparan sulfat Xử lý các tế bào L-929 nhiễm Orientia bằng heparan sulfat và heparin trước khi gây nhiễm làm giảm số tế bào L-929 nhiễm Orientia; các dòng tế bào đột biến không tổng hợp được heparan sulfat rất ít nhạy cảm với sự xâm nhập của O tsutsugamushi[39]

1.4.2 Trung gian và phương th

1.4.2 Trung gian và phương thứứức truyc truyc truyềềền bn bn bệệệnhnhnh

Trung gian truyền bệnh là mò Leptotrombidium (L) như L akamushi, L deliense, L fletcheri, L pallidum, L scutellare, L arenicolavà một số loài mò

khác Tại mỗi vùng dịch tễ có thể có nhiều loài mò cùng tồn tại và truyền bệnh [25], [36]

HìnhHình 1.2: Chu k1.2: Chu k1.2: Chu kỳỳỳỳ lây nhilây nhilây nhiễễễm cm cm củủủa ba ba bệệệnh snh snh sốốốt mòt mòt mò

Ấu trùng của mò ký sinh ở các động vật có sương sống chủ yếu là chuột

và các thú nhỏ khác trong lớp gặm nhấm, là giai đoạn duy nhất có thể đốt người Thông thường ấu trùng mò chỉ sống bằng thực vật Khi ấu trùng nhiễm

O tsutsugamushi hút máu người, O tsutsugamushisẽ xâm nhập qua vị trí đốt

mật độ của quần thể mò là một yếu tố ảnh hưởng đến tần suất mắc bệnh sốt

mò ở vùng bệnh lưu hành [1], [2]

1.5 SINH B

1.5 SINH BỆỆỆNH HNH HNH HỌỌỌC CC CC CỦỦỦA A A BBBỆỆỆNH SNH SNH SỐỐỐT MÒT MÒT MÒ

Cơ chế bệnh sinh của bệnh được biểu hiện qua sơ đồ sau:

Orientia xâm nhập và nhân lên

qua vết đốt của ấu trùng mò

Nốt phỏng, loét, hoại tử, đóng vảy + sưng hạnh (do vi khuẩn xâm nhập vào hệ bạch huyết)

Vào máu, tăng sinh trong tế bào nội mô mạch máu, viêm mạch máu nhỏ

Tăng tính

thấm thành

mạch, thoát huyết

tương

Phù nề tổ chức, Tràn dịch các màng

Tụt huyết

áp, Huyết khối

Tổn thương mạch máu nhỏ ở hầu hết các cơ quan giải thích cho những thay đổi bệnh lý đa dạng của bệnh như phù, tụt huyết áp, tràn dịch các màng

do thoát huyết tương, tăng tính thấp thành mạch, thiếu oxy cơ tim gây viêm tim, các tổn thương chức năng gan thận, rối loạn điện giải, thiếu máu, kể cả phát ban và xuất huyết cũng được giải thích theo cơ chế này

1.6 BI

1.6 BIỂỂỂU HIU HIU HIỆỆỆN LÂM SÀNGN LÂM SÀNGN LÂM SÀNG

1.6.1 Th

1.6.1 Thờờời gian i gian i gian ủủủ bbbệệệnhnhnh

Kéo dài từ 6 đến 21 ngày (trung bình từ 8 đến 12 ngày) sau khi bị ấu trùng mò đốt Thời kỳ này có thể tìm thấy vết loét do ấu trùng mò đốt [1] 1.6.2 Th

1.6.2 Thờờời ki ki kỳỳỳỳ khkhkhởởởi phát bi phát bi phát bệệệnhnhnh

Biểu hiện chính là sốt thường đột ngột hoặc bán cấp Các biểu hiện kèm theo: rét run, nhức đầu, chóng mặt, đau mỏi cơ, nhức mắt, xung huyết kết mạc mắt[1]

1.6.3.Th

1.6.3.Thờờời ki ki kỳỳỳỳ toàn pháttoàn pháttoàn phát

Các triệu chứng thường gặp là sốt, vết loét ngoài da, phát ban, sưng hạch lymphô, tổn thương các cơ quan và phủ tạng [28], [29]

SốSốốt:t:t:là triệu chứng phổ biến thường kéo dài từ 1 đến 3 hoặc 4 tuần (trung bình là 2 tuần) Tính chất sốt: thường liên tục, hình cao nguyên, đôi khi dao động; nhiệt độ có thể lên tới 39-40ºC hoặc hơn Mạch nhiệt độ có thể phân li giống trong bệnh thương hàn Bệnh nhân có cảm giác rét run hoặc ớn lạnh trong 1- 2 ngày đầu, giai đoạn sau chủ yếu sốt nóng

VếVếết đt đt đốốốt ngoài da: t ngoài da: t ngoài da: Tỷ lệ bệnh nhân có vết đốt ở mỗi nước, mỗi vùng dịch

tễ và quần thể nghiên cứu là khác nhau Ở Việt Nam gặp khoảng 20% các trường hợp, đây là dấu hiệu chẩn đoán bệnh dễ dàng

Vết loét có thể gặp ở nhiều nơi trên cơ thể thông thường ở các vùng da mỏng, bộ phận sinh dục, nách, bẹn, hậu môn, háng, Vết loét thường có hình tròn hoặc hình bầu dục đường kính từ 1mm đến 20 mm Vết loét khởi đầu là một nốt sần đỏ, giữa mọng nước sau đó vỡ ra và loét hoại tử nổi gờ trên mặt

da

Sưng hạSưng hạạch: ch: ch: Có hai loại hạch to

Viêm hạch khu vực nguyên phát: tại nơi gần vết loét do ấu trùng mò đốt, hạch sưng to bằng hạt táo, quả xoan hoặc có thể to hơn Hạch khu vực thường to hơn hạch nơi khác Lúc đầu chỉ tức sau hơi đau, có thể viêm quanh hạch Hạch khu vực thường xuất hiện cùng với sốt hoặc sau sốt 2-3 ngày Hạch to tại chỗ có thể định hướng tìm vết loét nhất là những vết loét nhỏ, ở những vị trí bất thường

Viêm hạch toàn thân thứ phát: thường xuất hiện sau hạch khu vực, nhưng thường sưng ít, di động, thường thấy ở nách, bẹn, cổ Ở Việt Nam, thường 100% bệnh nhân sốt mò đều có hạch sưng to [3]

Phát ban:

Phát ban: là triệu chứng hay gặp nhưng cũng tùy theo tác giả và tùy vùng địa lý, riêng ở Việt Nam gặp khoảng 70% Ban thường xuất hiện vào cuối tuần 1 và đầu tuần 2 của bệnh, thường là ban dát sẩn, kích thước từ hạt kê đến 1 cm Mọc khắp toàn thân (lưng, ngực, bụng, tứ chi) trừ lòng bàn chân, bàn tay, khoảng 10% có ban xuất huyết Thời gian tồn tại ban từ vài giờ đến 1 tuần [3]

TổTổổn thương hô hn thương hô hn thương hô hấấấp: p: p: tổn thương hô hấp là một biểu hiện rất thường gặp

ở bệnh nhân sốt mò, bao gồm viêm phế quản, viêm phổi không điển hình, viêm phổi kẽ và hội chứng suy hô hấp tiến triển (ARDS) Bệnh nhân có ho khan

đi kèm những biểu hiện bất thường khi nghe phổi và những biểu hiện trên X quang [37]

Bi

Biểểểu hiu hiu hiệệện tun tun tuầầần hoàn:n hoàn:n hoàn: các biểu hiện tim mạch gặp trong bệnh sốt mò như: giãn mạch làm da hồng hào, xung huyết kết mạc mắt rất hay gặp giúp phân biệt với sốt rét và thương hàn Hạ huyết áp thường xuất hiện từ cuối tuần thứ 2, do một số nguyên nhân như sức co bóp tim giảm, sốt cao mất nước, tình trạng này có thể thấy rõ khi bệnh nhân chuyển từ tư thế nằm sang ngồi Trường hợp nặng có thể gặp viêm cơ tim ổ và lan tỏa là một biểu hiện nặng của sốt mò, biểu hiện bằng T1 mờ, thổi tâm thu, ngoại tâm thu, kích thước tim to, nhịp ngựa phi thoáng qua và một số biểu hiện bất thường nhẹ trên điện tim như PR kéo dài, sóng T ngược [38]

Bi

Biểểểu hiu hiu hiệệện thn thn thầầần kinh:n kinh:n kinh: Các biểu hiện thần kinh có thể gặp trong sốt mò là viêm màng não và viêm não Rối loạn ý thức thường xuất hiện vào tuần thứ hai của bệnh Bệnh nhân có các dấu hiệu của viêm não-màng não như mê sảng, vật vã, tinh thần chậm chạp, hôn mê, co giật, rối loạn cảm giác, run chân tay Giảm thính lực là một biểu hiện thần kinh khư trú thường gặp trong sốt

mò Viêm màng não trong sốt mò thực tế là viêm màng não tăng lymphô bào Tri

Triệệệu chu chu chứứứng cơ quan khác: ng cơ quan khác: ng cơ quan khác:

Về tiêu hóa: thường phân táo trong các ngày sốt, đôi khi có thể ỉa lỏng vài ngày, đau vùng thượng vị giống như viêm dạ dày nhưng các triệu chứng này thường hết khi khỏi bệnh Gan lách có thể to nhưng thường chỉ mấp mé

bờ sườn, ít đau

Thận tiết niệu: có thể có protein trong nước tiểu, thiểu niệu, trường hợp nặng có thể tăng urê huyết

Tuy nhiên nếu không được điều trị bệnh có thể gặp các biến chứng nặng và thường là nguyên nhân tử vong như:

Tim mạch: hạ huyết áp, viêm cơ tim, trụy tim mạch, viêm tắc động mạch tĩnh mạch…

Hô hấp: viêm phế quản, viêm phổi không điển hình, viêm phổi bội nhiễm, viêm phổi nặng, ARDS

Thần kinh: viêm não, viêm màng não

Thận: viêm thận, suy thận (urê, creatinin máu tăng)

Xuất huyết: nôn, ho ra máu, đi ngoài phân đen [1], [3]

1.7 ĐI

1.7 ĐIỀỀỀU TRU TRU TRỊỊỊỊ VÀPHÒNG BVÀPHÒNG BVÀPHÒNG BỆỆỆNHNHNH

1.7.1 Đi

1.7.1 Điềềều tru tru trịịịị đđđặặặc hic hic hiệệệuuu

Các thuốc trong nhóm tetracyline: là lựa chọn ưu tiên cho sốt mò Thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có thời gian bán thải kéo dài và có ít tác dụng phụ

Doxycycline là thuốc được lựa chọn hàng đầu Liều thường dùng là viên 100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài 3-7 ngày

Tetracyline được sử dụng ở liều 2g/24 giờ đầu chia 4 lần, cách nhau 6 giờ, những ngày tiếp theo 1g/24 giờ chia 3 lần cách nhau 8 giờ Dùng đến khi cắt sốt 2-3 ngày; nếu cắt sốt càng nhanh, số ngày dùng sau khi hết sốt càng kéo dài thêm Tái phát, dùng 1g/24 giờ cho đến khi hết sốt 2-3 ngày

Nhóm tetracyline chống chỉ định với trẻ em dưới 8 tuổi do có nguy cơ ảnh hưởng tới sự hình thành răng và gây biến đổi màu răng vĩnh viễn tuy nhiên vẫn có thể cân nhắc trong những trường hợp có biến chứng nguy hiểm Chloramphenicol: được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều khuyến cáo là 2g/ngày chia 4 lần cho đến khi hết sốt 2-3 ngày Nguy cơ của chloramphenicol là thiếu máu do giảm sinh tủy liên quan đến liều dùng, gây tuyệt sản tủy do tính nhạy cảm bẩm sinh ở một số bệnh nhân hay tăng ung thư máu ở trẻ em Vì vậy chloramphenicol không phải là thuốc ưu tiên lựa chọn hàng đầu trong điều trị sốt mò

Các thuốc macrolide: cũng có tác dụng với sốt mò có thể chỉ định ở phụ

nữ mang thai và trẻ em dưới 8 tuổi, tốt nhất là azithromycin Ở phụ nữ mang thai tetracyline có nguy cơ gây dị dạng thai, ảnh hưởng tới sự phát triển xương và răng thai nhi và nguy cơ độc với gan của mẹ Chloramphenicol có thể sử dụng trong giai đoạn đầu thai kì nhưng chống chỉ định ở thời điểm sắp sinh gây nguy cơ hội chứng xám ở trẻ sơ sinh Chính vì những lý do trên, azithromycin là lựa chọn ưu tiên cho phụ nữ mang thai Phác đồ uống azithromycin 500 mg/ngày trong 3 ngày

Các kháng sinh đặc hiệu có hiệu quả điều trị tốt, nhiệt độ sẽ giảm sau khi dùng thuốc 24-48 giờ Có tác giả cho rằng với người lớn dùng liều duy nhất

200 mg doxycycline có tác dụng như dùng tetracyline 7 ngày Tuy nhiên những trường hợp sử dụng phác đồ ngắn ngày bệnh có thể tái phát sau khi ngừng điều trị Vì vậy phác đồ dài ngày thường được khuyến cáo sử dụng

Về sự kháng thuốc của Orientia: Đã có thông báo về sự xuất hiện một

số chủng O tsutsugamushi giảm nhạy cảm với doxycycline và chloramphenicol nhưng còn nhạy cảm với azithromycin và rifampicin tại Thái Lan [1], [3]

1.7.2 Đi

1.7.2 Điềềều tru tru trịịịị hhhỗỗỗ trtrtrợợợ

Người bệnh sốt mò cần được điều trị hỗ trợ như bù nước và điện giải,

hạ sốt, nhất là khi bệnh nhân sốt cao kéo dài Dùng các thuốc trợ tim mạch khi huyết áp hạ, viêm cơ tim; hỗ trợ hô hấp nếu cần Chăm sóc điều dưỡng tốt, nâng cao thể trạng [1]

1.8 XÉT NGHIỆỆỆM CHM CHM CHẨẨẨN ĐOÁNN ĐOÁNN ĐOÁN

1.8.1 Các phương pháp nuôi c

1.8.1 Các phương pháp nuôi cấấấy và phân ly và phân ly và phân lậậập Orientiap Orientiap Orientia

Phân lập nuôi cấy vi khuẩn O tsutsugamushi là phương pháp chẩn đoán sốt mò chính xác nhất được thực hiện tại phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp 3 Với phương pháp này, người ta tiêm vào ổ bụng chuột nhắt trắng trưởng thành 1ml máu của bệnh nhân Sau 7-15 ngày chuột có thể bị bệnh với các biểu hiện như: sốt, nổi hạnh xuất huyết hoặc chết Tiến hành mổ chuột lấy dịch ổ bụng hoặc các mô: gan, lách, phúc mạc… làm tiêu bản nhuộm theo phương pháp Romanovski Quan sát dưới kính hiển vi quang học để tìm mầm bệnh Ngoài ra có thể phân lập Orientia trên phôi gà, trên các dòng tế bào động vật và người [18], [22] Tuy nhiên nhìn chung các phương pháp này chủ yếu sử dụng trong nghiên cứu, ít có ý nghĩa trên lâm sàng vì cho kết quả muộn và tốn kém Khi phân lập Orientia trên phôi gà, bệnh phẩm chứa Orientia được tiêm vào túi thể vàng của phôi gà 7-9 ngày tuổi trong điều kiện

vô trùng và giữ ở 35oC Phôi gà thường chết sau khi gây nhiễm 9-11 ngày Orientia tạo nên các tổn thương kích thước nhỏ (0.5-1.0mm) dạng dầy màng đến những tổn thương lớn (5x18x11 mm) dạng u sùi trên màng mạch của phôi Có thể tìm thấy số lượng lớn Orientia ở những tổn thương này

1.8.2 Các phương pháp ch

1.8.2 Các phương pháp chẩẩẩn đoán huyn đoán huyn đoán huyếếết thanh ht thanh ht thanh họọọcccc

1.8.2.1 Ph

1.8.2.1 Phảảản n n ứứứng Weilng Weilng Weil Felix vFelix vFelix vớớới kháng nguyên OXi kháng nguyên OXi kháng nguyên OX KKK

Do O tsutsugamushi có cấu trúc kháng nguyên tương tự như Proteus mirabilis nên người ta sử dụng kháng nguyên OX-K của vi khuẩn trên làm kháng nguyên trong phản ứng Weil-Felix để chẩn đoán sốt mò Phương pháp trên đã được sử dụng rộng rãi chẩn đoán sốt mò trước những năm 1960 Kháng thể xuất hiện vào cuối tuần 1 và cao nhất vào tuần 3,4 của bệnh sau đó giảm dần và hết vào tuần 5-6 Để xác định hiệu giá, lấy máu lần 1 trước ngày

thứ 10 của bệnh và lấy máu lần 2 vào tuần 3-4 của bệnh Hiệu giá kháng thể

từ 4 lần trở lên được coi là dương tính

Vì phản ứng Weil-Felix có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao nên dần được thay thế bằng những xét nghiệm sử dụng kháng nguyên từ Orientia 1.8.2.2 Xét nghi

1.8.2.2 Xét nghiệệệm kháng thm kháng thm kháng thểểể mimimiễễễn dn dn dịịịịch huch huch huỳỳỳỳnh quang gián tinh quang gián tinh quang gián tiếếếp (Indirect p (Indirect Fluorescent Antibody

Fluorescent Antibody ––– IFA)IFA)IFA)

Xét nghiệm dùng kháng nguyên Orientia được cố định trên lam kính, sau đó ủ với huyết thanh cần xét nghiệm, rửa cho lam khô nhỏ dung dịch huyết thanh kháng globulin người đã được đánh dấu huỳnh quang Phức hợp kháng nguyên-kháng thể-kháng globulin gắn chất đánh dấu được soi trên kính hiển vi huỳnh quang [23] Đây là xét nghiệm giúp chẩn đoán nhanh và rất đặc hiệu Phương pháp trên cũng được sử dụng nhiều trong điều tra dịch tễ học IFA cũng có những hạn chế như sử dụng kháng nguyên là Orientia nuôi cấy trong phôi gà hoặc trong môi trường nuôi cấy tế bào là những quy trình thực hiện ở phòng xét nghiệm an toàn sinh học cấp ba, xét nghiệm này yêu cầu nhân viên có kỹ thuật và việc đọc kết quả phụ thuộc vào chủ quan của nhân viên kỹ thuật

1.8.2.3 Xét nghi

1.8.2.3 Xét nghiệệệm kháng thm kháng thm kháng thểểể mimimiễễễn dn dn dịịịịch peroxidase gián tich peroxidase gián tich peroxidase gián tiếếếp (Indirect p (Indirect Immunoperoxidase

Immunoperoxidase ––– IIP)IIP)IIP)

Nguyên lý của phương pháp IIP tương tự như IFA chỉ khác huyết thanh kháng globulin người được gắn với peroxidase thay vì gắn với chất phát huỳnh quang trong IFA Phức hợp kháng nguyên-kháng thể- kháng globulin sau đó dược phát hiện bằng dung dịch cơ chất chứa diaminobenzindine và peroxide IIP có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự như IFA, cũng sử dụng kháng

nguyên từ Orientia tuy nhiên kết quả được đọc bằng kính hiển vi thường không cần kính hiển vi huỳnh quang

1.8.2.4 Xét nghi

1.8.2.4 Xét nghiệệệm hm hm hấấấp thp thp thụụụ mimimiễễễn dn dn dịịịịch gch gch gắắắn men (Enzyme Linked Immunosorbent n men (Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Assay ELISA)ELISA)ELISA)

ELISA sử dụng kháng nguyên là Orientianuôi cấy trên các dòng tế bào hoặc kháng nguyên vỏOrientia tái tổ hợp r56 [18] Các xét nghiệm ELISA thương mại thường được sản xuất dưới dạng kit 96 giếng IgG:Kháng nguyên của Orientia được gắn vào màng polystyrene ở đáy của giếng phản ứng hình chữ U Nguyên lý phương pháp tưng tự như IIP tuy nhiên kết quả được đọc bằng máy ELISA nên không phụ thuộc vào chủ quan của người đọc Phương pháp trên có thể tiến hành với số lượng bệnh phẩm lớn phù hợp với chẩn đoán hồi cứu hoặc khảo sát dịch tễ học Để khẳng định bệnh nhân bị sốt mò bằng phương pháp này thì đòi hỏi mẫu bệnh phẩm phải được thu thập ở 2 giai đoạn, giai đoạn sốt cấp tính và giai đoạn phục hồi ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu tương tự IFA và IIP Tuy nhiên do yêu cầu thu mẫu bệnh phẩm như trên nên rất khó áp dụng

1.8.3.5 Xét nghi

1.8.3.5 Xét nghiệệệm thm thm thẩẩẩm thm thm thấấấu nhanh (Rapid Flow Assay u nhanh (Rapid Flow Assay u nhanh (Rapid Flow Assay ––– RFA)RFA)RFA)

RFA là kỹ thuật miễn dịch màu giúp phát hiện kháng thể IgM và IgG với kháng nguyên tái tổ hợp r56 của O tsutsugamushi có độ nhạy, độ đặc hiệu có thể so sánh được với IFA Kháng nguyên r56 phản ứng với kháng thể trong huyết hanh người và nhũ dịch vàng sẽ giải phóng ra yếu tố vàng làm chuyển màu của cửa sổ phản ứng [20], [21] Phản ứng có độ nhạy và độ đặc hiệu có thể so sánh với IFA và có thể phát hiện đáp ứng kháng thể sớm hơn IFA Ưu điểm của RFA là không cần có dụng cụ đặc biệt để thực hiện, cho kết quả nhanh trong vòng 15 phút và đọc được bằng mắt thường

Ngoài các phương pháp trên còn có các phương pháp khác như: ngưng kết hồng cầu thụ động, phản ứng kết hợp bổ thể, vi ngưng kết để phát hiện kháng thể kháng O tsutsugamushi Đối với xét nghiệm ngưng kết hồng cầu thụ động và ngưng kết latex sử dụng kháng nguyên Orentia hấp thụ trên bề mặt hồng cầu cừu hoặc hạt latex Kháng nguyên có mặt trong huyết thanh người/động vật sẽ làm ngưng kết hồng cầu hoặc hạt latex trong nhũ dịch 1.8.2.6 Phương pháp khu

1.8.2.6 Phương pháp khuếếếch đch đch đạạại gen (Polymerase Chain Reation i gen (Polymerase Chain Reation i gen (Polymerase Chain Reation ––– PCR)PCR)PCR)

K

Kỹỹỹỹ thuthuthuậậật PCR t PCR t PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullin và cộng

sự phát minh năm 1985 Thực ra đây là một phương pháp tổng hợp gen in vitro không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng tổng hợp chuỗi DNA với sự tham gia của enzym DNA – polymerase chịu nhiệt, một đoạn DNA được dùng để làm mồi và một mạch đơn DNA làm khuôn Kỹ thuật này đã có ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh…[5], [16]

Bệnh phẩm từ người và động vật động vật (chuột, ấu trùng mò) được

xử lý để tách chất liệu di truyền của Orientia; chuỗi nucleotide đích thường là gen mã hóa protein vỏ 56 kDa, 47 kDa hoặc một số gen khác Phản ứng được thực hiện qua ba chu kỳ: tách DNA, gắn mồi và kéo dài đoạn DNA, lặp lại nhiều lần bằng máy PCR trong môi trường có chứa oligonucleotide mồi ở điều kiện nhiệt độ nhất định cho từng chu kỳ Sản phẩm sau đó được nhận định bằng điện di trên gel, kỹ thuật lai (microplate hybridization) và một số phương pháp khác Hai kỹ thuật PCR tổ (nested PCR) và PCR cắt đoạn bằng các emzyme giới hạn (Restriced Fragment Length Polymorphism Analysis – RFLP)

còn cho phép xác định chủng Orientia có mặt trong bệnh phẩm xét nghiệm[27], [35]

PCR dạng tổ (nested PCR): chuỗi nucleotide tạo ra sau phản ứng PCR ban đầu được sử dụng để tiếp tục nhân bản một đoạn đặc hiệu trong trình tự chuỗi Sản phẩm PCR thứ hai sẽ là đoạn AND đặc hiệu cho chủng Orientia được xét nghiệm [24]

PCR cắt đoạn bằng các enzyme giới hạn (RFLP): Sản phẩm của phản ứng PCR thứ nhất được cắt bằng các enyme giới hạn (restricted endonuclease), cho ra sản phẩm thứ hai là các đoạn DNA đặc hiệu cho chủng Orientia được xét nghiệm

PCR được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh lâm sàng và trong các nghiên cứu dịch tễ học Xét nghiệm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép chẩn đoán xác định nhanh ngay trong giai đoạn cấp của bệnh

K

Kỹỹỹỹ thuthuthuậậật Realt Realt Real time PCRtime PCRtime PCR

Kỹ thuật Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà sản phẩm khuếch đại DNA đích hiển thị cùng lúc mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, nên cũng được gọi là PCR thời gian thực [5],[6] Do đặc điểm này mà với kỹ thuật Realtime PCR, người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản

ngay sau khi phản ứng khuếch đại hoàn tất Vì vậy có thể nói Realtime PCR là

kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được

Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR

Đường nền (baseline): là số chu kỳ của phản ứng PCR mà tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị Mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng từ chu kỳ 3 đến chu kỳ 15 và

có thể được thay đổi

Ngưỡng (threshold): là một giá trị huỳnh quang được xác lập một cách tùy ý, dựa trên đường nền

Chu kỳ ngưỡng (cycle threshold – Ct): được định nghĩa là số chu kỳ PCR

mà ở đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu lớn hơn ngưỡng Nói khác đi, đó là số chu kỳ của phản ứng realtime PCR ở đó tín hiệu đặc hiệu vượt khỏi tín hiệu nền

Nguyên lý của Real-time PCR dựa trên nguyên tắc PCR cơ bản của kỹ thuật PCR truyền thống, trong đó ngoài hai mồi đặc hiệu có thêm DNA probe

(đoạn dò) – là đoạn DNA đặc hiệu với vùng gen đích có gắn thêm chất phát quang florescence (Reporter) và ức chế phát quang (Quencher) trên đầu 5’ và 3’ Khi ở dạng không hoạt động Quencher luôn ức chế sự phát tín hiệu của Reporter Khi có phản ứng xảy ra, nhờ tín hiệu endonuclease của Taq-polymerase trong phản ứng làm thủy phân DNA-probe, Flourescence được giải phóng khỏi Quencher, tín hiệu huỳnh quang tăng dần sau mỗi chu kỳ phản ứng và được ghi nhận trên máy phân tích

Hình 1

Hình 1.333:Hình :Hình :Hình ảảảnh tín hinh tín hinh tín hiệệệu huu huu huỳỳỳỳnh quang sau các chu knh quang sau các chu knh quang sau các chu kỳỳỳỳ ccccủủủa Reala Reala Real time PCRtime PCRtime PCR Các kết quả của Real-time PCR có thể là định tính (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA), số liệu của Real-time PCR có thể thu được mà không cần điện di trên gel agarose[17], [30] Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật Real-time PCR là thời gian thí nghiệm được rút ngắn và do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống khép kín, do đó giảm thiểu tối đa sự nhiễm mẫu.Tuy nhiên, real-

time PCR có nhược điểm là đòi hỏi trang thiết bị và hóa chất đắt tiền đồng thời cũng đòi hỏi người làm thí nghiệm có kinh nghiệm và trình độ cao

CHƯƠNG 2CHƯƠNG 2 Đ

ĐỐỐỐI TƯI TƯI TƯỢỢỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨỨỨUUU

2

2.1 Đ.1 Đ.1 ĐỐỐỐI TƯI TƯI TƯỢỢỢNG NGHIÊN CNG NGHIÊN CNG NGHIÊN CỨỨỨUUU

2.1.1 Đ

2.1.1 Đốốối tưi tưi tượợợng nghiên cng nghiên cng nghiên cứứứuuu

Tất cả bệnh nhân điều trị nội trú và ngoại trú tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 3 năm 2015 đến tháng 12 năm 2016 được các bác sỹ lâm sàng chỉ định xét nghiệm để xác định nhiễm O tsutsugamushi 2.1.2 V

2.1.2 Vậậật lit lit liệệệu nghiên cu nghiên cu nghiên cứứứuuu

ChChChủủủng vi khung vi khung vi khuẩẩẩn: n: n: DNA tổng số của 5 chủng vi khuẩn O tsutsugamushi nuôi cấy được cung cấp từ phòng xét nghiệm tham chiếu về bệnh Rickettsia của Úc 2 chủng vi khuẩn đối chứng là những chủng chuẩn (Echerichia coli,… ) được lấy từ Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương

- Plasmid: Plasmid: Plasmid: Đã được tách dòng 106 copeis đã được chèn gen 47kdal được cung cấp bởi phòng xét nghiệm NaVa của mỹ

MMMẫẫẫu bu bu bệệệnh phnh phnh phẩẩẩmmm: MMMẫẫẫu bu bu bệệệnh phnh phnh phẩẩẩm là mm là mm là mẫẫẫu máu cu máu cu máu củủủa ba ba bệệệnh nhân nghi nh nhân nghi nhi

nhiễễễm O tsum O tsum O tsutsugamushiđưtsugamushiđưtsugamushiđượợợc lc lc lấấấy vào các y vào các y vào các ốốống chng chng chốốống đông có chng đông có chng đông có chứứứa EDTA a EDTA a EDTA Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy phải được đưa ngay tới phòng xét nghiệm và được bảo quản ở 4ºC

2.1.3 Tiêu chu

2.1.3 Tiêu chuẩẩẩn chn chn chọọọn mn mn mẫẫẫuuu

Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong nghiên cứu là mẫu máu được lấy từ những bệnh nhân nghi nhiễm O tsutsugamushi tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương

2.2 V

2.2 VẬẬẬT LIT LIT LIỆỆỆU VÀ THIU VÀ THIU VÀ THIẾẾẾT BT BT BỊỊỊỊ NGHIÊN CNGHIÊN CNGHIÊN CỨỨỨUUU

Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử - Khoa Xét nghiệm - Bệnh Viện Bệnh Nhiệt đới Trung Ương

Tên thiTên thiTên thiếếết bt bt bịịịị Hãng sHãng sHãng sảảản xun xun xuấấấtttt

Máy Realtime PCR ABI 7500Fast

Máy votex BR-2000 votexer Bio Rad

Tủ lạnh sâu: -30ºC, -80ºC Sanyo

Tủ an toàn sinh học Esco

Hóa chất dùng để tách chiết DNA tổng số:

Dung dịch Picoll tách lớp buffy coat

- Kit tách chiết DNA củaQiagen(QIAamp DNA Mini Kit)

+ Dung dịch lysis buffer AL

+ Dung dịch proteinase K

+ Dung dịch carrier RNA

+ Dung dịch ethanol (96 – 100%)

+ Dung dịch Wash buffer AW1

+ Dung dịch Wash buffer AW2

+ Dung dịch Elution buffer AE

HìnhHình 2.12.12.1 : Kit tách chi: Kit tách chi: Kit tách chiếếết DNAt DNAt DNA Hóa chất Realtime PCR:

+ Kit Kapa

+ 50mM MgCl2

+ Mồi xuôi

+ Mồi ngược

2.3.2 Tách chiếếết lt lt lớớớp tp tp tếếế bào máu đơn nhân ngobào máu đơn nhân ngobào máu đơn nhân ngoạạại vi (PBMC)i vi (PBMC)i vi (PBMC)

- 4ml máu được thu vào ống có chứa chất chống đông EDTA Hút 4ml dung dịch Ficoll cho vào ống Falcon 15ml Hút toàn bộ 4ml máu ở ống máu cho từ từ và nhẹ nhàng vào ống Falcon 15ml đã chứa 4ml Ficoll

DNA bệnh phẩm