áp dụng phương pháp elisa phát hiện độc tố lt của các chủng escherichia coli phân lập trong thực phẩm

Bộ y tế Viện dinh dỡng Báo cáo đề tài áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố LT của các chủng Escherichia coli phân lâp trong thực phẩm Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dinh Dỡng Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến 5751 05/4/2006 Hà Nội - 2005 1 Bộ y tế Viện dinh dỡng Báo cáo đề tài áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố LT của các chủng Escherichia coli phân lâp trong thực phẩm Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến Cán bộ thực hiện: Phạm Thị Thanh Yến Nguyễn Lan Phơng Nguyễn ánh Tuyết Hà Thị Anh Đào Hà Nội - 2005 2 I. Đặt vấn đề: Tiêu chảy là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em đặc biệt là ở các nớc vùng nhiệt đới, trong đó Escherichia coli (E.coli) là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cấp ở trẻ em . E.coli gây tiêu chảy đợc chia làm 5 loại, bao gồm (1): E.coli gây bệnh (Enteropathogenic E. coli, viết tắt là EPEC) E.coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic E. coli, viết tắt là ETEC) E.coli xâm nhập (Enteroinvasive E.coli, viết tắt là EIEC) E.coli gây chảy máu (Enterohemorrhage E.coli, viết tắt là EHEC) E.coli bám dính (Enteroaggregative E.coli, viết tắt là EAggEC) E.coli sinh độc tố ruột (ETEC) là chủng vi khuẩn sinh độc tố ruột trong ruột non của ngời và súc vật gây ỉa chảy mất nớc giống tả. Có 2 loại độc tố ruột: độc tố chịu nhiệt ST (Stable Toxin) bị phá hủy ở 100 0 C trong 15 phút và độc tố không chịu nhiệt LT (Labile Toxin) dễ bị phá hủy ở 60 0 C trong 15 phút. Có chủng E.coli có cả 2 loại độc tố LT và ST, nhng cũng có chủng chỉ có LT hoặc ST(2). LT là phân tử lớn oligomer, có cấu trúc và chức năng giống độc tố tả (CT cholera toxin), vì vậy cơ chếgây bệnh của ETEC tơng tự nh bệnh tả. LT gồm 2 nhóm chính : LT1 và LT2. Độc tố LT1 gây bệnh ở ngời và động vật. LT2 chỉ gây bệnh ở động vật, hiếm khi gây bệnh ở ngời.LT có tính kháng nguyên (là kháng nguyên lông) nên có vai trò quan trọng trong nghiên cứu văcxin phòng bệnh.ST có cấu trúc phân tử nhỏ, không có tính kháng nguyên nên ít đợc nghiên cứu hơn. Độc tố ST gồm 2 loại: Sta và STb. E.coli sinh độc tố là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở trẻ em các nớc đang phát triển. Một số nghiên cứu cho thấy khoảng 10 - 30% các 3 trờng hợp tiêu chảy ở trẻ em là do E.coli sinh độc tố. Các điều tra dịch tễ cho thấy: thực phẩm và nớc ở vùng có dịch tiêu chảy tỷ lệ nhiễm ETEC rất cao, hầu hết trẻ em nuôi bộ ( sau khi cai sữa ) ở những vùng này bị nhiễm ETEC qua thức ăn. Điều kiện khí hậu nóng ẩm, đặc biệt vào mùa hè là một trong những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của ETEC trong thực phẩm và nớc. Trong những năm gần đây để phát hiện độc tố của E.coli có nhiều kỹ thuật đợc áp dụng nh: kỹ thuật ELISA, ngng kết (latex aglutination) và phản ứng chuỗi men (PCR) (3, 4). E.coli là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ô nhiễm của các loại thực phẩm. Theo số liệu nghiên cứu, khảo sát của Phòng thí nghiệm Vi sinh - Viện Dinh dỡng cho thấy: tỷ lệ nhiễm E.coli chiếm khoảng 15 - 25% trong tổng số các mẫu thực phẩm có nguy cơ (5). Do vậy, việc xác định E.coli trong các mẫu thực phẩm có khả năng sinh độc tố gây tiêu chảy đóng vai trò quan trọng trong công tác giám sát VSATTP một cách có hiệu quả. Trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng kỹ thuật ELISA để xác định độc tố LT của các chủng E.coli phân lập đợc trong thực phẩm năm, 2004 do phơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. II. Mục tiêu đề tài Triển khai kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố LT của các chủng E.coli phân lập trong thực phẩm. III. Đối tợng, thời gian và kỹ thuật áp dụng 1. Đối tợng: - Mẫu thực phẩm: tổng số 80 mẫu, trong đó: + 60 mẫu lòng lợn cha qua chế biến + 10 mẫu lòng lợn đã qua chế biến + 10 mẫu tiết canh - Địa điểm lấy mẫu: chợ Ngọc Hà (quận Ba Đình), chợ Cầu Giấy (quận Cầu Giấy), chợ Thanh Xuân (quận Thanh Xuân). 4 - Cách lấy mẫu: các mẫu lòng lợn ( lòng già, non) và tiết canh đợc mua vào buổi sáng từ 10 đến 11 giờ. Mỗi mẫu lấy tối thiểu là 250g, đựng vào túi polyetylen vô trùng, rồi đa ngay về phòng thí nghiệm để kiểm tra trong vòng không quá 3 giờ. 2. Thời gian tiến hành đề tài: - Phân lập các chủng E.coli từ thực phẩm: 7 27 tháng 12 năm 2004 - Triển khai kỹ thuật ELISA : 3 27 tháng 5 năm 2005 3. Kỹ thuật áp dụng: - Kỹ thuật xác định E.coli trong thực phẩm theo TCVN5159 1990 để phân lập các chủng E.coli. - Kỹ thuật ELISA xác định độc tố LT của các chủng E.coli (1). IV. Nội dung và kết quả triển khai A. Kết quả phân lập E.coli trong thực phẩm: Tên chợ Thực phẩm Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Lòng non 1 1 Lòng già 1 1 Chợ Ngọc Hà Tiết canh 4 2 Lòng non 2 1 Lòng già 3 3 Chợ Cầu Giấy Tiết canh 2 1 Lòng non 3 3 Chợ Thanh Xuân Lòng già 4 4 Cộng 20 16 Qua kiểm tra 20 mẫu lòng lợn sống, tiết canh tại 3 chợ: Ngọc Hà, Cầu Giấy, Thanh Xuân chúng tôi đã thu thập đợc 16 chủng E.coli. 5 B. Tiển khai kỹ thuật ELISA 1. Nguyên lý + GM1 LT KT1 KT2 Enzym Cơ chất ELISA ( Enzyme- Linked Immunosorbent assay ) là phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể có gắn men. - GM1 có vai trò thụ thể bám diính độc tố LT. KT1 (kháng thể 1) : là huyết thanh thỏ kháng độc tố LT. - KT2 (kháng thể 2) : Là huyết thanh dê ( Ig G dê kháng thỏ ) có gắn enzym ( thờng gọi là cộng hợp men ). - Khi xảy ra sự kết hợp giữa LT và KT1, thì cơ chất giúp đo đợc hoạt động của enzym, từ đó xác định đợc số lợng KT1 gắn vào LT, qua đó xác định đợc LT. 2. Vật liệu, hoá chất, môi trờng - Canh thang BRILA ( Merck ) - Thạch ENDO ( Merck ) - Thạch Citrat Simmons ( Merck ) - Pastone ( Sanofi ) - Môi trờng canh thang trypticase soy (Merck) - GM1 (Monosialoganglioside - Sigma ) - Huyết thanh thỏ kháng độc tố LT ( Sigma ) 6 - Cộng hợp men: Huyết thanh dê gắn với men phophatase kiềm (Goat Antihuman IgG - Alkaline phosphatase conjugate - Sigma) - Cơ chất : OPD (O-Phenylenediamine dihydrochloride tablet-Sigma) - Phosphate Buffered Saline (PBS, pH 7,4) - BSA (Bovine Serum Albumine - Sigma Fine Chemical) - Khay nhựa 96 giếng đáy bằng (Nunc - 439454); pi pet và đầu típ - Máy đọc ELISA (Biorad) - Eppendorf - ống Falcol - Máy lắc Voltex - Máy ly tâm 3. Chủng thử nghiệm - Chứng dơng: ETEC EBa-35 (Nhật Bản) - Chứng âm: STEC O111-19 (Nhật Bản) - Các chủng E.coli phân lập từ các mẫu thực phẩm 4. Chuẩn bị dịch nổi chủng E.coli đ phân lập đợc và các chủng chứng dơng, chứng âm: 16 chủng E.coli đã phân lập và chủng ETEC EBa-35 (chứng dơng) và chủng STEC O111-19 (chứng âm) đợc nuôi cấy trong canh thang Trypcase soy (9ml canh thang/ống), ủ ấm 37 o C/18 giờ. Sau đó cho vào ống ly tâm ( 4 ml canh trùng/ống), rồi ly tâm 2000 vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi. 5. Chuẩn bị các dung dịch đệm: + Dung dịch mẹ Na 2 HPO 4 5,48g Na 2 H 2 PO 4 .H 2 O 1,575g Nớc cất 100ml pH = 7,2 + R1-Đệm phủ đĩa 7 Dung dịch mẹ 20ml NaCl 9g Nớc cất 1000ml pH = 7,2 + R2-Đệm rửa NaCl 8,5g Tween 20 1ml NaN 3 0,2g Nớc cất 1000ml + R3-Đệm khoá R1 10ml BSA 0,1g + R4-Đệm pha kháng thể: R1 10ml BSA 0,1g Tween 20 10àl + R5-Đệm pha cơ chất Tris base 1,21g MgCl 2 30àl Nớc cất 8ml Chỉnh pH = 9,8 bằng HCl sau đó thêm nớc cất cho đủ 10ml + Dung dịch dừng phản ứng (NaOH 3M) NaOH 12g Nớc cất 100ml 6. Pha các sinh phẩm - Pha GM1 (nồng độ 5àg/ml): 20 àl GM1 + 3980 àl R1 - Pha huyết thanh thỏ kháng độc tố LT tỷ lệ 1/1000 (Kháng thể 1 - KT1) 4àl KT1 + 4000 àl R4 8 - Pha IgG dê kháng thỏ có gắn enzyme tỷ lệ 1/1000 ( Kháng thể 2 hay còn gọi là cộng hợp men KT 2) 4àl KT2 + 4000 àl R4 - Pha Subtrate: 1 viên OPD + 20 ml R5 7. Tiến hành ELISA Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mẫu chứng dơng, chứng âm và16 chủng E.coli phân lập đợc. Thí nghiệm bố trí theo sơ đồ sau: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A M1 M1 M9 M9 B M2 M2 M10 M10 C M3 M3 M11 M11 D M4 M4 M12 M12 E PC M5 M5 M13 M13 F PC M6 M6 M14 M14 G NC M7 M7 M15 M15 H NC M8 M8 M16 M16 Trong đó: PC: đối chứng dơng (Positive control) NC: đối chứng âm (Negative control) * Các bớc tiến hành: - Bớc 1: Gắn bản GM 1 : 100àl/giếng, rồi để qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Bứơc 2: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút. - Bớc 3: Cho R3: 100àl/giếng, ủ 1 giờ ở 37 o C. - Bớc 4: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút. - Bớc 5: Cho dịch nổi chủng chứng dơng, chủng chứng âm và E.coli cần kiểm tra độc tố, mỗi mẫu 2 giếng : 100àl /giếng ủ 2 giờ ở 37 0 C. - Bớc 6:Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút. - Bớc 7: Cho kháng thể1: 100àl/giếng ủ 1 giờ ở 37 0 C. 9 - Bớc 8: Rửa bản 3 lần với R2: 200 àl/giếng trong 3 phút - Bớc 9: Cho kháng thể 2: 100àl/giếng ủ 1 giờ ở 37 o C. - Bớc 10: Rửa bản 3 lần với PBS -Tween 20: 200 àl/giếng trong 3 phút. - Bớc 11: Cho cơ chất: 100àl /giếng ủ 50 phút ở 37 o C - Bớc 12: Làm ngừng phản ứng bằng NaOH3M: 50àl/giếng, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm cho tới khi chứng dơng có màu vàng rõ, (thời gian chờ không quá 15 phút). IV. Kết quả ELISA Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở bớc sóng 405nm. Hiệu giá mẫu thử nghiệm cao hơn chứng âm gấp 2 lần trở lên thì đợc coi là dơng tính. Khi quan sát bằng mắt xác định phản ứng dơng tính nhờ sự xuất hiện màu vàng trong giếng thí nghiệm, thể hiện sự tơng tác giữa độc tố trong dịch nổi của vi khuẩn E.coli (LT) và kháng thể kháng độc tố của thỏ. Kết quả ELISA cho thấy, màu vàng xuất hiện ở vị trí mẫu số 6 (F2, F3) và mẫu số 14 (F4, F5) tơng tự nh màu ở giếng đối chứng dơng (E1, F1), còn mẫu chứng âm và các mẫu còn lại đều không có màu, chứng tỏ phản ứng không xảy ra, hay nói cách khác là trong dịch nổi không có độc tố LT (xem hình 1). Hình 1: Phản ứng màu ELISA 10 [...]... Elisa đợc thể hiện thông qua biểu đồ 1 11 M 15 Số thứ tự mẫu M 13 M 11 M 9 M 7 M 5 M 3 M 1 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 PC Giá trị OD Biểu đồ 1: Kết quả Elisa của các chủng E .coli V Kết luận: Qua kết quả triển khai đề tài, chúng tôi đã triển khai thành công kỹ thuật ELISA phát hiện đọc tố LT của các chủng Escheria coli phân lập trong thực phẩm 12 Tài liệu tham khảo 1 Hoàng Thu Thuỷ Phơng pháp. .. bình của mẫu số 6 và số 14 lần lợt là 1.553 và 1.655 là tơng đối cao, gần bằng giá trị trung bình của mẫu dơng chuẩn (1.851), cao hơn chứng âm gấp 9,6 lần (mẫu số 6) và 10,3 lần (mẫu số 14), tức là giá trị OD của mẫu số 6 và số 14 cao hơn chứng âm >2 lần đợc coi là dơng tính (có độc tố LT) Vậy trong tổng số 16 chủng E .coli phân lập đợc từ các mẫu lòng lợn sống và tiết canh, thì chỉ có 2 chủng có độc tố. .. lập trong thực phẩm 12 Tài liệu tham khảo 1 Hoàng Thu Thuỷ Phơng pháp kỹ thuật phát hiện độc tố ruột của Escherichia coli Kỹ thuật xétnghiệm Vi sinh vật Y học-Nhà xuất bản văn hoá Hà nội 1991: tr: 91-94 2 Những nghiệm pháp chuẩn đoán E coli sinh độc tố ruột Sổ tay xét nghiệm về nhiễm khuẩn đờng ruột cấp tính.Tài liệu dịch từ CDD/83.3 của OMS: tr: 40-60 3 Black,R.E.M.H Brown, S Becker, and M.H.Merson... Enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoer: acquired imnunity and transmission in an endemic area Bull WHO1981; 59: 263-68 5 Hà Thị Anh Đào, Phạm Thanh Yến, Nguyễn Lan Phơng Thực trạng ATTP thức ăn chế biến sẵn trên địa bàn Hà Nội năm 2002; Hội nghị khoa học ATVSTP 2003 tr: 99-104 6 Yolken RH, greenberg HB, Merson MH, Sack RB, Kapikian AZ Enzyme linked immunosorbent assay for detection of Escherichia coli heat-labile...Đĩa ELISA sau khi đã dừng phản ứng đợc cho vào máy đọc ở bớc sóng 405 nm và có kết quả nh bảng sau (xem bảng 2: Bảng 2: Kết qủa Elisa 1 2 3 4 5 A 1.825 0.052 0.049 0.160 0.165 F 1.877 1.540 1.566 1.61 G 0.164 0.058 0.135 0.008 0.005 H 10 11 12 0.053 0.056 0.170 0.167 . thuật ELISA phát hiện đọc tố LT của các chủng Escheria coli phân lập trong thực phẩm. 12 Tài liệu tham khảo 1. Hoàng Thu Thuỷ. Phơng pháp kỹ thuật phát hiện độc tố ruột của Escherichia. tài áp dụng phơng pháp Elisa phát hiện độc tố LT của các chủng Escherichia coli phân lâp trong thực phẩm Chủ nhiệm đề tài: BS. Phạm Thị Thanh Yến Cán bộ thực hiện: Phạm. 2005 3. Kỹ thuật áp dụng: - Kỹ thuật xác định E .coli trong thực phẩm theo TCVN5159 1990 để phân lập các chủng E .coli. - Kỹ thuật ELISA xác định độc tố LT của các chủng E .coli (1). IV. Nội