ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEXPCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ Họ tên sinh viên : LÊ THỊ NGỌC HÒA Ngành : Thú Y Lớp : DH03TY Niên khóa : 2003 – 2008 Tháng 09/2008 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BỊ Tác giả LÊ THỊ NGỌC HỊA Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ ngành Thú Y Giáo viên hướng dẫn PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSTY BÙI THỊ THU TRANG Tháng 09/2008 i LỜI CẢM ƠN  Quả thật tơi cảm thấy thật hạnh phúc học tập dạy dỗ Thầy Cô khoa Chăn Nuôi-Thú Y  Qua đây, cho xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM - Ban Chủ Nhiệm Quý Thầy Cô khoa Chăn Ni Thú Y tận tình giảng dạy dìu dắt tơi q trình học tập trường  Con khắc ghi công ơn Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, người thầy hướng dẫn, dạy dỗ nguồn động viên cho sống suốt thời gian thực hành tốt nghiệp  Em xin gửi lòng chân thành đến BSTY Bùi Thị Thu Trang, người chị tận tình giúp đỡ chia sẻ vui buồn em thời gian thực tập  Tôi gửi lời cảm ơn đến tất anh chị em trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nơng Lâm, Thầy Lê Hữu Ngọc - phụ trách phòng Thực hành Kiểm nghiệm thú sản vật nuôi, em Minh Thành, bạn Bá Tài giúp đỡ tạo điều kiện cho làm việc tốt  Và qn nhiệt tình, vui vẻ mà chú, anh chị trại chăn ni bò đem đến cho thời gian lấy mẫu  Để có ngày hơm nay, xin kính dâng lên ông bà, cha mẹ - người tận tụy, hy sinh suốt đời cho lòng hiếu thảo  Tơi thật hạnh phúc có người chị tốt, dành trọn vẹn tình thương cho tơi  Còn người mà cơng ơn người suốt đời tơi ghi nhớ, Bác Hai Nga, người chăm lo, bảo ban yêu thương gái suốt ba năm qua Quả kỳ diệu mà tơi may mắn có tơi trân trọng điều  Cuối tình cảm thật dễ thương mà bạn lớp Thú y 29 bạn bè thân hữu đem đến cho tháng năm qua Tôi cảm ơn tất xin chúc cho tình cảm thêm đẹp bền chặt! Lê Thị Ngọc Hòa ii TĨM TẮT Sinh viên Lê Thị Ngọc Hòa, Đại học Nơng Lâm Tp HCM, tháng 09/2008 “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ” Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang Đề tài thực nhằm phát gen độc lực stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE fliC vi khuẩn E coli phân lập từ 55 mẫu phân bò, gồm 11 mẫu phân bò ta bình thường, 24 mẫu phân bò sữa bình thường, 20 mẫu phân bò sữa tiêu chảy kỹ thuật multiplex- PCR Quan sát ghi nhận mơi trường CTSMAC có dạng khuẩn lạc E coli, khuẩn lạc trắng khuẩn lạc hồng Mỗi mẫu phân chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ, trắng, hồng Các khuẩn lạc cho vào eppendorf Ly trích DNA nhóm khuẩn lạc phương pháp nhiệt Kết multiplex – PCR ghi nhận sau: (1) 29/55 (52,73%) mẫu phân bò có E coli mang gen độc lực  Tần số phát gen độc lực E coli phân bò sữa tiêu chảy cao (75%)  Kế đến phân bò sữa bình thường (45,8%)  Thấp phân bò ta (27,3%)  Ở phân bò ta bình thường: 3/11 mẫu có mang gen; đó, gen stx2 chiếm tỷ lệ cao (18%); hai gen stx1 hlyA chiếm tỷ lệ ngang (9%) Chưa phát gen eae, rfbE fliC  Ở phân bò sữa bình thường: 11/24 mẫu có E coli mang gen sản sinh độc tố Gen stx1 xuất với tỷ lệ 37,5% Gen hlyA 8,35%, gen stx2 eae 4,3% Chưa phát gen rfbE fliC mã hóa cho O157:H7 số 24 mẫu khảo sát  Ở phân bò sữa tiêu chảy: có 15/20 mẫu (75%) phát mang gen độc lực 12/20 mẫu phát gen stx; 3/20 mẫu phát gen eae; 2/20 mẫu phát gen hlyA Chưa phát gen rfbE fliC (2) Tỷ lệ khuẩn lạc màu trắng mang gen độc lực (54,8%) cao khuẩn lạc màu hồng (45,8%) iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình sơ đồ ix Phần MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU .2 1.3 YÊU CẦU .2 Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn E coli 2.2 Phân loại E coli .3 2.3 Đặc điểm ni cấy sinh hóa .3 2.4 Đặc điểm kháng nguyên độc tố 2.5 Cơ chế chung khả gây tiêu chảy E coli .5 2.6 Shiga toxigenic E coli (STEC) 2.6.1 Danh pháp 2.6.2 Độc tố yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC .6 2.6.2.1 Độc tố Shiga (Stx) 2.6.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh STEC 2.6.3 Nguồn lây nhiễm 2.7 Serotype O157:H7 2.7.1 Đặc điểm sinh hóa 2.7.2 Nguồn lây nhiễm 2.8 Tình hình ngộ độc thực phẩm nước ta năm gần 10 2.9 Kỹ thuật PCR 11 2.9.1 Nguyên tắc 11 iv 2.9.2 Các giai đoạn phản ứng PCR 11 2.9.3 Số chu kỳ phản ứng PCR 12 2.9.4 Các thành phần phản ứng PCR 12 2.9.5 Phân tích kết PCR .13 Phần NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thực 15 3.1.1 Thời gian 15 3.1.2 Địa điểm .15 3.2 Nội dung nghiên cứu 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Lấy mẫu .15 3.4 Phân lập ly trích DNA vi khuẩn E coli 16 3.4.1 Môi trường nuôi cấy 16 3.4.2 Phân lập vi khuẩn 16 3.5 Ly trích DNA khuẩn lạc 16 3.6 Xác định gen stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE, fliC E coli phân lập kỹ thuật m – PCR 17 3.6.1 Trình tự primer sử dụng multiplex – PCR1 multiplex – PCR2 18 3.6.2 Thành phần phản ứng PCR 18 3.6.3 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 18 3.6.4 Điện di gel agarose đọc kết điện di 19 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .20 4.1 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò ta 21 4.2 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò sữa .22 4.3 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân tiêu chảy bò sữa .24 4.4 Tổng kết kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân bò ta, bò sữa .25 v Phần KẾT LUẬN 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề nghị 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/E Attaching and effacing CT – SMAC Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Eae E coli attaching and effacing EMB Eosin Methylen Blue FDA Food and Drug Administration HC Haemorrhagic colitis HUS Haemolytic uraemic syndrome IMViC Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simmon Citrate MAC MacConkey NA Nutrient agar PCR Polymerase chain reaction PVC Mơi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin cefixime STEC Shiga toxin- producing E coli Stx Shiga toxin TBE Tris borate EDTA UV Ultra violet vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Danh pháp thành viên họ Stx Bảng 4.1 Kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò ta 21 Bảng 4.2 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò sữa 23 Bảng 4.3 Kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân tiêu chảy bò sữa 24 Bảng 4.4 Tổng kết tần suất phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân bò ta, bò sữa 26 Bảng 4.5 Mối liên quan kết phát gen độc lực màu sắc khuẩn lạc E coli môi trường CT-SMAC 28 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm multiplex – PCR1 EDL933: Đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hlyA): giếng 1, 19 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm multiplex – PCR1 EDL933: Đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hlyA) Thang Lad chuẩn; giếng 1, 3: mẫu xét nghiệm 29 Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli phát gen độc lực .17 ix chủ yếu dòng E coli gây xuất huyết ruột (nhóm EHEC / STEC), phân bò nguồn quan trọng gây vấy nhiễm thực phẩm cho người Người ta cho biết E coli O157:H7 ngày diện nhiều thịt chế biến có nguồn gốc từ thịt bò (Zhao ctv, 2003) Kết ghi nhận đề tài ngược với nhận định Nếu không xét nguyên nhân số mẫu khảo sát bỏ qua yếu tố vị trí địa lý, kết phát gen độc lực đề tài thấp có lẽ phần giống bò ta có q trình thích nghi lâu dài, khả chống chịu bệnh tốt hơn, thức ăn yếu tố ảnh hưởng đến diện STEC phân Theo Sata ctv (2003) nhận định bò sữa nguồn chứa tự nhiên mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm tiêu thụ loại sản phẩm sữa tươi, hay thịt bò chưa nấu chín Phân bò sữa chúng tơi khảo sát 4.2 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò sữa Kết bảng 4.2 cho thấy 24 mẫu phân bò sữa bình thường sử dụng phương pháp multiplex-PCR giúp phát 11/24 (45,8%) mẫu phân bò có E coli mang gen sản sinh độc tố Cụ thể, gen độc tố shiga stx1 xuất với tỷ lệ cao (37,5%), gen hlyA (8,3%); gen stx2 eae (4,3%) Khơng có mẫu phân bò xác định tồn gen rfbE fliC mã hóa cho O157:H7 số 24 mẫu khảo sát E coli mang gen độc lực phát với tỉ lệ cao phân bò sữa bình thường (45,8%) Smith (1988) Gyles (1992) cho nhiều loài gia súc mang STEC khơng có biểu triệu chứng Kết luận phù hợp với nhận định Beutin (1993) Caprioli (1993) dòng E coli sản sinh Stx (Shiga toxin) tồn phân bình thường thú nuôi khỏe mạnh, phân thú nhai lại 22 Bảng 4.2 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân bình thường bò sữa Mẫu Dạng khuẩn phân lạc stx1 stx2 eae hlyA rfbE fliC Hồng - - - - - - Hồng - - - - - - Hồng + - - - - Hồng + + - - - - Trắng + - - - - - Trắng - - - - - - Trắng - - + + - - Hồng - - - - - Hồng - - - - - - 10 Trắng + - - - - - 11 Trắng - - - - - - 12 Hồng + - - - - - 13 Trắng - - - - - - 14 Hồng - - - - - - 15 Hồng - - - + - - 16 Trắng + - - - - - 17 Trắng - - - - - - 18 Trắng + - - - - - 19 Trắng - - - - - - 20 Hồng - - - - - - 21 Trắng - - - - - - 22 Trắng + - - - - - 23 Trắng + - - - - - 24 Trắng - - - - - - Tổng 1 0 Tỷ lệ (%) 37,5 4,2 4,2 8,3 0 Gen độc lực 23 4.3 Kết phát số gen độc lực vi khuẩn E coli phân tiêu chảy bò sữa Bảng 4.3 Kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân tiêu chảy bò sữa Mẫu Dạng khuẩn phân lạc Gen độc lực stx1 stx2 eae hlyA rfbE fliC Trắng + + - - - - Trắng - - - - - - Trắng + - - - - - Trắng - - + + - - Hồng + + - - - - Hồng - - - - - - Hồng + - - - Trắng + - - - - - Trắng - - + + - - 10 Trắng + - - - - - 11 Hồng - - - - - - 12 Hồng + - - - - - 13 Trắng + - - - - - 14 Trắng + - - - - - 15 Hồng - - - - - - 16 Trắng - - - - - - 17 Trắng - - + - - - 18 Hồng + - - - - - 19 Hồng + - - - - - 20 Hồng + + - - - - Cộng 12 3 0 Tỷ lệ (%) 60 15 15 10 0 24 - Kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân tiêu chảy bò sữa 15/20 (75%) có gen độc lực, có mẫu xuất gen đồng thời, bao gồm:  12/20 mẫu (60%) phát gen stx (stx1 hoặc/và stx2)  3/20 mẫu (15%) phát gen eae  2/20 mẫu (10%) phát gen hlyA Gen stx phát với tỷ lệ cao (60%) Theo Pradel ctv (2001), dòng E coli thuộc nhóm STEC sản sinh độc tố Shiga thường kết hợp với ca bệnh người, từ ca tiêu chảy đơn giản đến trường hợp viêm kết tràng xuất huyết (HC) hay hội chứng huyết niệu (HUS) Khả gây bệnh STEC có liên quan đến khả sản sinh độc tố Stx1, Stx2; độc tố intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; độc tố enterohemolysin gây dung giải hồng cầu (Cocolin ctv, 2000) Mead ctv (2000) thảo luận dòng STEC mang nhiều gen độc lực khả sinh bệnh chúng nguy hiểm, đặc biệt serotype O157:H7 4.4 Tổng kết kết phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân bò ta, bò sữa Đề tài khảo sát tổng cộng 55 mẫu phân bò (gồm 11 mẫu phân bò ta bình thường, 24 mẫu phân bò sữa bình thường, 20 mẫu phân bò sữa tiêu chảy), kết bảng 4.4 cho thấy 29/55 (52,73%) mẫu phân bò có E coli mang gen độc lực Tần số phát gen độc lực E coli phân bò sữa tiêu chảy cao (75%), phân bò sữa khỏe mạnh (45,8%), thấp phân bò ta bình thường (27,3%) Đối với mẫu phân bò ta bình thường, phát gen stx1, stx2 hlyA; phân bò sữa khỏe mạnh phân bò sữa tiêu chảy tồn bốn gen stx1, stx2, eae, hlyA Đặc biệt, 55 mẫu phân bò khảo sát, chưa có mẫu tầm soát gen rfbE fliC 25 Bảng 4.4 Tổng kết tần suất phát gen độc lực vi khuẩn E coli phân bò ta, bò sữa Số mẫu Mẫu phân khảo sát Bò ta Bò sữa bình thường Bò sữa tiêu 11 24 dương stx1 stx2 (27,3%) (9%) (18,2%) 11 (45,8%) (37,5%) 20 chảy Tổng cộng Gen độc lực Số mẫu 55 eae - hlyA (9%) rfbE fliC - - - - - - - - (4,2%) (4,2%) (8,4%) 15 12 3 (75%) (60%) (15%) (15%) (10%) 29 22 (52,73%) (40%) (10,9%) (7,3%) (9,1%) ( Số mẫu khảo sát số mẫu thử IMViC dương tính với E coli) Trong nhóm bò khảo sát, tỷ lệ gen độc lực phân bò sữa bình thường phát cao (45,8%) Qua nhận định bò bình thường (khơng tiêu chảy) đối tượng mang gen độc lực E coli Điều hoàn toàn phù hợp với nhận định Beutin ctv (1993) đề cập phần 4.2, dòng E coli sản sinh độc tố Stx tồn phân bình thường thú ni khỏe mạnh, phân thú nhai lại Đây nguồn vấy nhiễm cho thịt bò q trình giết mổ, vận chuyển, bày bán không tuân thủ điều kiện vệ sinh Thật vậy, liều gây nhiễm O157:H7 thấp 10 – 100 CFU gây bệnh qua đường thực phẩm cho người (Griffin ctv, 1995) Trẻ em tiêu chảy cấp nhiễm STEC có mang gen hlyA, eae làm tăng rắc rối bệnh lý thận (HUS) (Fratamico ctv, 1995) Kết 4.4 phát gen stx với tỷ lệ cao phân bò 28/55 (50,9%), hai gen stx1 stx2 phát với tỷ lệ là: 40% 10,9%; phân bò 26 sữa tiêu chảy tỷ lệ cao 60% 15% Theo Wang ctv (2002), Stx1, Stx2 hai độc tố kết hợp gây bệnh nguy hiểm cho người Tuy nhiên, độc tố Stx2 có tính gây bệnh cao Stx1 (Paton Paton, 1998) Những dòng E coli sản sinh Stx1 Stx2 nguy hiểm dòng sản sinh độc tố Stx1 E coli mang gen độc lực stx làm tăng nguy gây độc cho người sử dụng thực phẩm vấy nhiễm nhóm E coli Theo Levin (1987), STEC tác nhân gây bệnh cho người Và theo Renwick ctv, 1993) người trở nên cảm nhiễm ăn phải thức ăn bị nhiễm STEC tiếp xúc trực tiếp với STEC từ động vật Người bị nhiễm STEC tiêu chảy trầm trọng viêm kết tràng xuất huyết (HC) hội chứng huyết niệu (HUS), (Karmali, 1989) Ngồi độc tố shiga, có nhiều yếu tố độc lực khác góp phần tăng tính gây bệnh vi khuẩn Đó intimin haemolysin Trong khảo sát phát gen độc lực với tỷ lệ 7,3% 9,1% Các nhà nghiên cứu biết dòng STEC có khả gây bệnh thường liên quan đến tổn thương A/E gen eae mã hóa giúp vi khuẩn bám chặt vào biểu mơ ruột bào mòn lớp niêm mạc ruột (Sherman ctv, 1988) Một số dòng STEC có độc tính cao người, có khả tạo bệnh tích gắn chặt vào màng nhày ruột Sự diện dòng STEC mang gen eae gia súc thường liên quan đến dòng vi khuẩn E coli người mà khoa học biết serotype O157, O26, O111 (Sandhu & ctv, 1996) Nếu gen eae mã hóa độc tố intimin tác động lên tế bào niêm mạc, làm chết tế bào gen hlyA mã hóa cho độc tố haemolysin (enterohaemolysin) gây dung huyết, cung cấp Fe giúp kích thích phát triển STEC ống tiêu hóa (Law & Kelly, 1995) Hai gen eae, hlyA khơng hồn tồn kết hợp với độc tố Stx gây bệnh cho gia súc có 23/55 mẫu mang gen stx khơng chứa gen eae, hlyA Theo Vila ctv (1997), số E coli STEC phân lập từ ca bệnh nặng hội chứng huyết niệu không mang gen eae Trong đó, số dòng E coli mang gen eae lại không sản sinh độc tố Stx Như vậy, độc tố Stx điều kiện cần chưa đủ để gây bệnh (Barret & ctv, 1992) Vì thế, xuất đồng thời gen hlyA, stx, eae góp phần gây nên bệnh biểu bệnh động vật Tuy nhiên, người cảm nhiễm có thật trở thành nạn nhân ngộ độc thực phẩm hay khơng tùy thuộc vào số lượng độc lực vi khuẩn, điều kiện môi trường, địa vật chủ,… 27 Khảo sát chưa phát gen rfbE, fliC E coli O157:H7 Ngun nhân âm tính mẫu xét nghiệm ít, phần ăn, mật độ chăn nuôi thưa ảnh hưởng đến diện O157 quần thể E coli Tỷ lệ diện O157:H7 tùy thuộc nhiều vào vùng dịch tễ, dòng O157:H7 nguyên nhân phổ biến hầu hết ca bệnh nghiêm trọng châu Âu bắc Mỹ dòng STEC O111:H- lại nguyên nhân gây bệnh phổ biến Australia thường gây HUS (Nataro & Kaper, 1998) Mùa vụ tuổi bò có ý nghĩa lớn việc thải dòng STEC, hay serotype O157:H7 qua phân Phân có chứa O157:H7 thường thải vào mùa xuân mùa hè (Mechie & ctv, 1997) Tóm lại, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình tồn phát triển E coli nhóm STEC O157:H7 phân đường dày ruột gia súc: loài, mùa vụ lứa tuổi, phần cách cho ăn, vị trí khoảng thời gian lên men, pH dày, dịch tễ, … Những điều làm tăng giảm tồn E coli STEC phân bò, góp phần định tỷ lệ phát gen độc lực E coli STEC phân bò Những STEC mang gen độc lực tồn với tỷ lệ khác vùng địa lý khác Bảng 4.5 Mối liên quan kết phát gen độc lực màu sắc khuẩn lạc E coli môi trường CT-SMAC Số Nhóm dạng mẫu khuẩn lạc Có gen Khơng gen 11 13 (45,8%) (54,2%) 17 14 (54,8%) (45,2%) 24 Hồng 55 31 Trắng Trong suốt thời gian thực hiện, phân lập 55 mẫu phân môi trường CT – SMAC, gồm 24 nhóm khuẩn lạc màu hồng 31 nhóm khuẩn lạc màu trắng định danh vi khuẩn E coli Bảng 4.5 cho thấy số nhóm khuẩn lạc hồng có E coli mang gen độc lực chiếm 45,8% (11/14 mẫu), tỷ lệ phát gen độc lực nhóm khuẩn lạc trắng 54,8% (17/31 mẫu) Như vậy, chọn khuẩn lạc trắng, khuẩn lạc hồng để PCR xác định gen độc lực bỏ sót nhiều hội 28 phát Theo FDA (2002), STEC bao gồm serotype O157:H7 serotype O157:H7 (được ký hiệu non – O157:H7) Trên môi trường CT – SMAC, serotype O157:H7 cho khuẩn lạc trắng khoảng 90% serotype non – O157:H7 cho khuẩn lạc màu hồng Như vậy, kết ghi nhận đề tài tỷ lệ phát gen loại khuẩn lạc trắng hồng phù hợp Điều có nghĩa việc chọn lựa hai dạng khuẩn lạc trắng hồng mơi trường CT-SMAC để tầm sốt gen độc lực nhóm STEC hồn tồn hợp lý Tóm lại, CT-SMAC mơi trường chọn lọc nhóm STEC, đặc biệt E coli O157:H7 (nhờ khả không lên men đường sorbitol serotype này) Tuy nhiên, mơi trường cho kết xác hồn tồn mà mang tính chất hỗ trợ ban đầu, phục vụ cho việc tầm soát gen độc lực kỹ thuật PCR việc thử phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính sau hlyA (534 bp) eae (384 bp) stx2 (255 bp) stx1 (180 bp) Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm multiplex – PCR1 EDL933: giếng 8: đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hlyA); – 7: mẫu xét nghiệm 29 Phần KẾT LUẬN 5.1 Kết luận Qua thời gian thí nghiệm, chúng tơi rút kết luận sau:  Tần số phát gen độc lực E coli nhóm STEC 55 mẫu phân bò 52,73%, phân bò sữa tiêu chảy có tần số cao nhất, phân bò sữa bình thường thấp phân bò ta  Tần số phát gen stx1, stx2, eae hlyA là: 40%, 10,9%, 7,3% 9,1%  Chưa phát gen rfbE fliC E coli O157:H7 5.2 Đề nghị Ứng dụng kỹ thuật multiplex- PCR để phát gen độc lực stx1, stx2, eae, hlyA nhóm STEC rfbE fliC O157:H7 với số mẫu nhiều 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Ngọc Tuân, Bùi Thị Thu Trang Trần Thị Dân, 2004 Phát gen eae, hly, stx1 stx2 Escherichia coli quày thịt heo, phân heo phân bò Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp Số 2/2004 Tơ Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2006 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Tp HCM Võ Thành Thìn, Nguyễn Thị Ánh Hưng, Đặng Văn Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa, 2008 Tỷ lệ nhiễm phân tích độc tố shiga vi khuẩn E coli từ thịt bò TP Nha Trang Tạp chí KHKT thú y, tập XV, số 3: 26-31 Nguyễn Vũ Trung, Lê Huy Chính, Lê Văn Phùng, 2007 Phát triển ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi chẩn đoán E coli gây tiêu chảy từ phân Báo cáo tóm tắt chuyên ngành y học sở, Hội nghị KHCN tuổi trẻ trường Đại học y dược Việt Nam lần thứ 11 Bùi Thị Thu Trang, 2005 Phát số gen độc lực E coli phân heo, bò phương pháp single – PCR multiplex – PCR Kỷ yếu Hội nghị khoa học trẻ Đại học Nông Lâm Tp HCM lần 5: 16-22 Tô Minh Châu, 2005 Kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm Tủ sách trường Đại học mở bán công Tp HCM Bộ môn vi sinh – Khoa Y – Đại học Y Dược Tp HCM, 1996 Vi khuẩn học: 123130 10 Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gen độc lực Escherichia coli phân lập từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex – PCR Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp trường Đại học Nông Lâm Tp HCM TIẾNG NƯỚC NGOÀI 11 Beutin L., Geier D., Steinrck H., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993 Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga like toxin) producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals J Clin Microbiol 31, pp 2483 – 2488 31 12 Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995 Virulence markers of Shiga like toxin producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species J Clin Microbiol 33, pp 631 – 635 13 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Hermen L., 2003 Detection and characterization of verotoxigenic E coli by a VTEC/ EHEC multiplex-PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154, pp 97 – 104 14 Butler D., 1996 Novel pathogens beat food safety check Nature, pp 384 – 397 15 Bergamini A M M, 2007 Prevalence and characteristics of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strain in ground beef in Sao Paulo, Brazil, Brazilian Journal of Microbiology, 1517-1522 16 Buchko S J., R A Holley, W O Olson, V P J Gannon, and D M Veira,2000 The effect of different grain diets on fecal shedding of E coli O157:H7 by steers Journal of food protection 63 p.1467-1474 17 Barret T J., Kaper L B., Jerse A E., and Wachsmuth I K., 1992 Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from human and cattle J Infect Dis 165:970-980 18 Bell, B P., Goldoft, P M Griffin, M A., et al, 1984 Amultisttate outbreak of E coli O157:H7 – associated bloody diarrhea and hemolytic uraemic syndrome from hamburger: the Washington experience JAMA 272 p 1349-1353 19 Caldervood S B., Acheson D W K., Keusch G T., Barrett T J., Griffin P M., Strockbine N A et al, 1997 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 62, pp 118 – 119 20 Cebula T A., Payne W L., and Fegn P., 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR J Clin Microbiol 33, pp 248 – 250 21 Chalmers R M., Salmon R L., Willshaw G A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997 Verocytotoxin producing Escherichia coli O157 in a farmer handing horses Lancet 349, pp 1816 22 Chapman P A., Siddons C A., Cerdan Malo A T., and Harkin M A., 1997 A year study of Escherichia coli in cattle, pig and poultry Epidemiol Infect 119, pp 245 – 250 32 23 Cocolin L., Manzano M., Cantoni C., Comi G., 2000.A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in artificially contaminated foods Int J Hyg Environ Heath 203:159164 24 Caprioli A., Nigrelli A, Gatti R., Zavanella M., Blando A M., Minelli F and Donelli G., 1993 Characterization of verotoxin -producing Escherichia coli from pigs and cattle in Northen A multistate outbreak of E coli O157:H7associated bloody diarrhea and hemolytic uraemic syndrome from hamburger Jama 272: 1349-1355 25 Donnenberg M S., Tzipori S., Mc Kee M L., O’Brien A D., Alroy J., And Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro a porcine model J Clin Invest 92 p 1418-1424 26 Elder, R O., J E Keen, G R Siragusa, G A Barkocy-Gallagher, M Koomaraie, and W W Lagreid 2000 Correlation of enterohemorrhagic E Coli O157 prevalence in feces, hides and carcasses of beef cattle during processing Proc Natl Acad Sci USA 97:2999-3003 27 Fode-Vaughan K.A et al, 2003 Direct detection of E coli O157:H7 Letters in Applied Microbiology 37:239-243 28 FDA, 2002 “Diarrheagenic E coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN September 2002 http://vm.cfsan.fda.gov/~ebam-4a.html 29 Feng P., Lum R., and Chang G W., 1991 Identification of uidA gene sequences in β- D-glucuronidase – negative E coli Appl Environ Microbiol 57, pp 320 – 323 30 Foster T W., 2004 E coli acid resistance tales of an amateur acidophile http:// www.suothalabama.edu/microbiologytrongfoster.html 31 Fukushima, H., K Hoshina, and M Gomyoda 1999 Long-term survival of Shiga toxin producing E coli O26, O111, and O157 in bovine feces Appl Environ Microbiol 65:5177-5181 32 Fratamico P M., Buchanan R L., Cooke P K., 1993 Virulence of an Escherichia coli O157:H7 sorbitol-positive mutant Appl Environ Microbiol 59, pp 4245 4252 33 Griffin P M., 1995 Escherichia coli O157:H7 and other enterohemorrhagic Escherichia coli In infections of the gastrointestinal tract Eds New York NY:Raven Press P 739-761 33 34 Gyles C L., 1992 Escherichia coli cytotoxin and enterotoxin Can J Microbiol 38:734-746 35 http://www.tuoitre.com.vn/Tianyon/Index.aspx?ArticleID=101662&ChannelID=12 36 http://www.arserrc.gov/techtrans/technologies/food%20safety/ecolidetect.htm 37 http://www.google.com.vn/search?hl=vi&q=ngo+doc+do+E.coli&start=80&sa=N 38 http://www.southalabama.edu/microbiologytrongfoster.html 39 Jay J M., 2000 Modern food microbiology An aspen pulication, Maryland pp 531 – 543 40 Karmali M A., 1989 Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli J Clin., Microbiol Rev 2: 15-38 41 Konowalchuk J., Speirs J I., and Stavric S., 1977 Verorespone to a cytotoxin of Escherichia coli Infec Immun 18 p 778-779 42 Karmali M A., 1993 Evidence of diect trains misson of Escherichia coli O157:H7 infection between calves and human J Infect Dis 168 p 792-793 43 Keskimaki M., 2001 Shiga toxin producing and other diarrheagenic Escherichia coli in Finland: pheno and genotypic epidemiology Academic dissertation The Faculty of Agriculture and Forestry of the University of Helsinky, Finland 44 Law D., and Kelly J I., 1995 Use of heme and hemoglobin by Escherichia coli O157 and other Shiga-like toxin producing Escherichia coli serogroups Infect Immun 63 p 700-702 45 Levin M M., Xu J., Kaper J B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J., 1987 A DNA probe to identify enterohemorhaggic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that cause hemorrhagic Escherichia coli colitis and hemolytic uraemic syndrome J Infect Dis 156 p 175-182 46 Makino S., Koberi H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al, 2000 Detection and characterization of Shiga toxin-producing E coli from seagulls Epidemiol Infect 125, pp 55-61 47 Mcevoy J.M., Doherty A.M., Sheridan J.J., Thomson-Carter F.M., Garvey P., McGuire L., Blair I.S and McDowell D.A., 2003 The prevalence and spread of Escherichia coli O157:H7 at a commercial beef abattoir Journal of Applied Microbiology 95, pp 256–266 34 48 Mechie S C., P A Chapman, and C A Siddon, 1997 A fifteen month study of E coli O157:H7 in a dairy herd Epidemiol Infect 118 p 17-25 49 Mead, p S., L Slutsker, V Dietz, L F McCraig, J S Bresee, C Shapiro, P M Griffin, and R V Tauxe 2000 Food-related illness and death in the United States Emerging Infect Dis 5:607-625 50.Nataro J P and Kaper J B., 1998 Diarrheagenic Escherichia coli J Clin Microbiol Rev 11(1), pp 142 - 201 51 O’Brien, A D., J W Newland, S F Miller, R K Holmes, H W Smith, and S B Formal 1984 Shiga-like toxin- converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhaggic colitis or isnantile diarhea Science 226:694-696 52 Paton A W., and Paton J C., 1998 Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assay for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E coli hlyA, rfbO111, rfbO157 J Clin Microbiol 36(2), pp 598 – 602 53 Pradel N., Boukhors K., Bertin Y., Forestier C., Martin C., Livrelli V., 2001 Heterogeneity of Shiga toxin producing E coli strains isolated from hemolytic uremic syndrome patients, cattle, and food samples in central France Appl Environ Microbiol 67(6), pp 2460 – 2468 54 Rice E W., Sowers E G., Johnson C H., Dunnigan M E., Strockbine N A., and Edberg S C., 1992 Serological cross-reactions between E coli O157 and other species of the genus E coli J Clin Microbiol 30, pp 1315 – 1316 55 Renwick S A., Wilson J B., Clarke R C., Lior H., Borcyk A A., Spica J., Rahn K., Mc Fadden K., Brouer A., Coopps A., Anderson N G., Alves D., and 41 Sherman P., and Karmali M., 1988 E coli torabbit intestinal epithelium in vivo Infect Immu 56 p 756-761 56 Smith H R., and Scotland S M., 1998 Verocytotoxin producing strains of Escherichia coli J Med Microbiol 26, pp 77 – 85 57 Sata, S., R Osaw, T Fujisawa, A Iguchi, S Yamai and T Shimada 2003 An Improved Enrichment Broth for Isolation of Escherichia coli O157, with Specific Reference to Starved Cells, from Radish Sprouts Applied and Environmental Microbiology P 1858-1860 58 USA Department of Agriculture’s Food Safety and Inspection Service, 2004 35 59 Sandhu K S., Clarke R C., Mc Fadden K., Brouwer A., Louie M., WilsonJ., Lior H., and Gyles C L., 1996 Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario Epidemiol Infect 116 p 1-7 60 Vila, J et al, 1997 Isolation of Verotoxin- Producing Escherichia coli O-rough: K1:H7 from patients with traveler’s diarhea Journal of Clinical Microbiology 35:2279-2282 61 Wang G., Clark C G., and Rodgerst F G., 2002 Detection in Escherichia coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type shiga toxin family by multiplex-PCR J Clin Microbiol 40:3613-3619 62 Zhao, T., M P Doyle, J Shere, and L Garber 1995 Prevalence of enterohemorrhagic E coli O157:H7 in a survey of dairy herds Appl Environ Microbiol 61:1290-1293 36 ... dụng kỹ thuật multiplex-PCR phát số gen vi khuẩn Escherichia coli nhóm STEC phân lập từ phân bò 1.2 MỤC TIÊU Phát số gen stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE, fliC E coli nhóm STEC phân lập từ phân bò. .. TẮT Sinh vi n Lê Thị Ngọc Hòa, Đại học Nơng Lâm Tp HCM, tháng 09/2008 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ” Người.. .ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BỊ Tác giả LÊ THỊ NGỌC HỊA Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu