Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh tụ cầu vàng staphylococcus aureus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN KHOA CNSH-CNTP BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG MÃ SỐ: T2013 – 12 TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN NHANH TỤ CẦU VÀNG Staphylococcus aureus CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trực tiếp nhóm nghiên cứu thực Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Kỹ thuật di truyền, Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Đề tài nghiên cứu thực thiết bị đại, phù hợp với nội dung mục tiêu nghiên cứu đề phù hợp với lĩnh vực nghiên cứu đề tài Do đó, kết nghiên cứu thu hoàn toàn xác, trung thực đủ tin cậy Các kết nghiên cứu công bố báo cáo đồng ý thành viên nhóm nghiên cứu Thái Nguyên, ngày 02 tháng 03 năm 2014 Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Văn Duy LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, trước hết xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Quản lý Khoa học Quan hệ Quốc tế, Ban Chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP tạo điều kiện thuận lợi cho thực hoàn thành nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, TS Nguyễn Đắc Trung, khoa Cơ sở, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, ThS Đỗ Bích Duệ, cán Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cung cấp chủng vi sinh vật để tiến hành nghiên cứu đề tài Tôi xin cám ơn thành viên nhóm nghiên cứu giúp hoàn thành nội dung nghiên cứu đề tài Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 02 tháng 03 năm 2014 Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Văn Duy DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1: Vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình 2.2 Các bước thực chu kỳ phản ứng PCR 11 Hình 4.1 Trình tự nucleotide cặp mồi NucF- NucR 18 Hình 4.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA 19 Hình 4.3 Kết khuếch đại vùng gen đặc hiệu Staphylococcus aureus phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết hóa chất 20 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng 20 nồng độ khuôn DNA khác Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR 21 nhiệt độ gắn mồi nồng độ MgCl2 khác Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách chiết từ loài vi khuẩn kiểm định 23 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ - Tên đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus” - Mã số: T2013 – 12 - Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Văn Duy - Điện thoại: 0915384836 Email: duynguyenvan_1978@yahoo.com.vn - Cơ quan chì đề tài: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Cá nhân phối hợp thực hiện: + SV Đinh Thị Hoa, lớp 41 CNSH; Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên + SV Nguyễn Anh Tuấn, lớp 43 CNSH, Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: Tháng 3/2013-3/2014 Mục tiêu Xây dựng quy trình kỹ thuật PCR phát nhanh Staphylococcus aureus có độ nhạy độ đặc hiệu cao Nội dung - Nội dung Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR - Nội dung Tối ưu điều kiện phản ứng PCR - Nội dung Xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR Kết đạt - Sản phẩm đào tạo: 01 kỹ sư Công nghệ Sinh học - Sản phẩm khoa học: 01 báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học - Sản phẩm ứng dụng: + 01 cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát nhanh vi khuẩn tụ cầu vàng Staphylococcus aureus + 01 Quy trình phát nhanh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus mức độ chủng phòng thí nghiệm SUMMARY - Research Project Title: “Application of PCR technique for rapid detection of Staphylococcus aureus” - Code number: T2013-12 - Coordinator: Nguyen Van Duy - Tel: 0915384836 - Implementing Institution: Thai Nguyen University of Agriculture and Foresrtry - - Cooperating Institution(s): Email: duynguyenvan_1978@yahoo.com.vn + Dinh Kim Hoa, Class of 41st CNSH, Faculty of Biotechnology and Food technology, Thai Nguyen University of Agriculture and forestry + Nguyen Tuan Anh, Class of 43rd CNSH, Faculty of Biotechnology and Food technology, Thai Nguyen University of Agriculture and forestry - Duration: from 3/2013 to 3/2014 Objectives Constructing PCR process for rapid detection of Staphylococcus aureus with high sensitivity and high specificity Main contents - Designing a pair of primer for PCR reaction - Optimizing conditions of PCR reaction - Determining the Specificity of detection of the PCR reaction Obtained Results - Trained Results: 01 engineer on Biotechnology - Scientific Results: 01 Scientific researched Report - Applied Results: + A pair of specific primer for PCR reaction for rapid detection of Staphylococcus aureus + 01 PCR process for rapid detection of Strains of Staphylococcus aureus in laboratory level MỤC LỤC MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa nghiên cứu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình ngộ độc Staphylococcus aureus nước 2.1.1 Tình hình nước 2.1.2 Trên giới 2.2 Tổng quan Staphylococcus aureus 2.2.1 Đặc điểm hình thái 2.2.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh hóa 2.3 Phương pháp phát Staphylococcus aureus 2.3.1 Phương pháp truyền thống 2.3.2 Phương pháp đại 2.4 Tổng quan kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 10 2.4.1 Khái niệm PCR 10 2.4.2 Nguyên tắc thử nghiệm PCR 10 2.4.3 Thành phần phản ứng 11 2.4.4 Những ưu điểm hạn chế kỹ thuật PCR 12 2.4.5 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh vi sinh vật gây bệnh 13 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 14 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 3.3 Vật liệu, thiết bị, hóa chất nghiên cứu 14 3.3.1 Vật liệu ngiên cứu 14 3.4 Nội dung nghiên cứu 14 3.4.1 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR 14 3.4.3 Xây dựng qui trình phát nhanh Staphylococcus aureus kỹ thuật PCR 14 3.4.5 Xác định giới hạn phát phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus 14 3.5 Phương pháp nghiên cứu 14 3.5.1 Phương pháp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR từ vi khuẩn Staphylococcus aureus 14 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA 15 3.5.3 Xác định điều kiện tối ưu Phản ứng PCR 16 3.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR 16 3.5.5 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 17 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18 4.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus 18 Trình tự nucleotide cặp mồi lựa chọn thể bảng 4.1 18 4.2 Tối ưu điều kiện phản ứng PCR phát nhanh Stapylococcus aureu 19 4.2.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA phương pháp sử dụng hóa chất 19 4.2.2 Kiểm tra DNA tổng số phương pháp PCR 19 4.2.3 Xác định nồng độ DNA tối thiểu phản ứng PCR phát Staphylococcus aureus 20 4.2.4 Tối ưu phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus 21 4.3 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR 23 Phần KẾT LUẬN 25 5.1 Kết luận 25 5.2 Kiến nghị 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) mối quan tâm đặc biệt quốc gia mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Nguyên nhân hàng đầu ca NĐTP xuất vi sinh vật gây bệnh nhiễm tạp mẫu thực phẩm, tụ cầu vàng Staphyloccocus aureus số tác nhân nguy hiểm [8] Điển vụ ngộ độc tập thể xảy đám cưới ngày 12/4/2012 Hùn, xã Chiềng Cọ, Thành phố Sơn La thực phẩm nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus làm 300 người mắc phải nhập viện cấp cứu Một vụ ngộ độc tập thể khác xảy ngày 16/4/2012 khiến 200 công nhân Công ty Dream MeKong thuộc xã An Cư, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang bị ngộ độc…[4] Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm xảy nhiều nơi, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người kinh tế Vì mà có nhiều phương pháp sử dụng để phát vi khuẩn Staphylococcus aureus, phương pháp nuôi cấy truyền thống luôn bao gồm nhiều công đoạn nuôi cấy kết hợp với bước kiểm tra sinh hóa tốn nhiều thời gian (5- ngày) [13] Sự phát chậm vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm nguyên nhân làm tác nhân gây bệnh có hội lây lan cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe người [8] Ngày với tiến khoa học kỹ thuật, kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát triển phương pháp kiểm tra nhạy nhanh diện dòng vi khuẩn, kỹ thuật PCR áp dụng để chẩn đoán nhanh S aureus thực phẩm có kết thời gian ngắn [10] Kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction PCR) kỹ thuật dùng để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt cách sử dụng cặp mồi chuyên biệt PCR sử dụng để phát lượng nhỏ DNA mục tiêu bị pha lẫn mẫu DNA khác PCR có độ nhạy cao, cho phép phát nhanh tác nhân gây bệnh nên trở thành công cụ phổ biến việc phát nhiều tác nhân gây bệnh người, vật nuôi mẫu thực phẩm [7] Điều giúp người làm công tác xét nghiệm có định hướng sớm chẩn đoán trường hợp ngộ độc thực phẩm [14] Xuất phát từ thực tiễn đời sống, sở vào lực nghiên cứu Khoa CNSH CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học Thái Nguyên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát nhanh tụ cầu vàng Staphylococcus aureus” 1.2 Mục đích yêu cầu nghiên cứu 1.2.1 Mục đích nghiên cứu - Xây dựng qui trình phát nhanh Staphylococcus aureus dựa kỹ thuật PCR 1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus - Xây dựng qui trình tách chiết DNA phù hợp cho phát nhanh Staphylococcus aureus kỹ thuật PCR - Xác định điều kiện tối ưu phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus - So sánh khả tách chiết DNA Staphylococcus aureus phương pháp sốc nhiệt phương pháp hóa chất - Xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus mẫu thực phẩm 1.3 Ý nghĩa nghiên cứu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR phát nhanh S aureus mẫu thực phẩm Tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển kít phát nhanh vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết nghiên cứu tạo sở để phát triển kit phát nhanh S aureus mẫu thực phẩm phục vụ công tác giám sát, quản lý chất lượng sản xuất chế biến thực phẩm Xác định nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm dịch bệnh, giám sát lan truyền vi khuẩn gây bệnh cộng đồng Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Vi khuẩn Staphylococcus aureus: Viện CNSH & CNTP - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Bộ môn Vi sinh thuộc Khoa Y học sở - Trường ĐH Y- Dược Thái Nguyên, Viện Khoa học sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trung tâm y tế dự phòng Thái Nguyên cung cấp - Các chủng vi sinh vật kiểm định: Viện Khoa học sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trung tâm y tế dự phòng Thái Nguyên cung cấp 3.3 Vật liệu, thiết bị, hóa chất nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu ngiên cứu Cặp mồi đặt sản xuất hãng Intergrated DNA Technologies Mỹ (www.IDTDNA.com) Trình tự mồi liệt kê bảng sau: Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi thiết kế Tên Trình tự nucleotide (5’→3’) mồi Tm o ( C) NucF TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA 54 NucR GCCACGTCCATATTTATCAGTTC 54 Kích thước sản phẩm PCR (bp) 439 3.4 Nội dung nghiên cứu 3.4.1 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR 3.4.3 Xây dựng qui trình phát nhanh Staphylococcus aureus kỹ thuật PCR 3.4.5 Xác định giới hạn phát phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Phương pháp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR từ vi khuẩn Staphylococcus aureus - Sưu tập trình tự gen nuc Staphylococcus aureus khác ngân hàng gen NCBI - So sánh 50 trình tự gen nuc sưu tập sử dụng phần mềm CLUSTALW2 để tìm vùng trình tự gen giống 50 trình tự 14 - Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho vùng tương đồng 50 trình tự gen sử dụng phần mềm Vector NTI 11.0 (Invitrogen), FastPCR, Tm oligos Calculator (http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm) - Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế với trình tự gen nuc chủng Staphylococcus aureus công bố ngân hàng gen sử dụng phần mềm BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 3.5.2 Phương pháp tách chiết DNA DNA tổng số Staphylococcus aureus tách chiết theo phương pháp [17] - Tách chiết phương pháp sử dụng hóa chất: + Bước 1: Lấy 1000 µl dung dịch vi khuẩn S aureus + Bước 2: Ly tâm 10.000v/phút phút + Bước 3: Bổ sung 700 µl CTAB + Bước 4: Ủ tủ ấm 60oC 60 phút, sau 10 phút đảo trộn + Bước 5: Bổ sung 700 µl CIAA, đảo trộn Ly tâm 10.000v/phút 10 phút + Bước 6: Chuyển 450 µl dung dịch pha sang eppendorf 1500 µl mới, bổ sung 50 µl muối CH3COONa 3M (pH = 5,5) 500 µl dung dịch isopropanol, đảo trộn + Bước 7: Đặt -20oC + Bước 8: Ly tâm 10.000v/phút 30 phút + Bước 9: Loại bỏ dịch + Bước 10: Rửa tủa 1ml EtOH 70%, đảo trộn đều, ly tâm 13.000v/phút phút + Bước 11: Để khô tự nhiên + Bước 12: Hòa tan kết tủa 50µl TE 1X, đảo trộn đều, ủ tủ ấm 70oC thời gian phút giữ nhiệt độ -20oC - Tách chiết phương pháp xử lý sốc nhiệt + Bước Lấy 1000 µl dung dịch vi khuẩn S aureus, ly tâm 10.000v/phút phút Loại bỏ dịch thu cặn + Bước Hòa nguyên cặn nước cất vô trùng (không chứa DNase RNase) + Bước Hỗn hợp đưa vào nồi tủ sấy 95oC vòng 10 phút nhằm làm sốc nhiệt để trích ly DNA 15 + Bước Sau hỗn hợp làm lạnh nhanh cách cho vào tủ đông nhiệt độ - 20oC vòng 10 phút + Bước Tiến hành ly tâm với tốc độ 10.000v/p phút để loại tạp chất Phần cặn bã chất hữu bị lắng xuống + Bước Lặp lại bước ba lần Cuối ta thu phần dung dịch lại có chứa DNA 3.5.3 Xác định điều kiện tối ưu Phản ứng PCR Phản ứng PCR thực theo quy trình Các thành phần phản ứng PCR bao gồm: - 10X PCR buffer : 2,5 µl - MgCl2 (25 mM) : 1,5 µl - dNTPs (2.5 mM) : 1,5 µl - Mồi xuôi (10 µM) : 1,5 µl - Mồi ngược (10 µM) : 1,5 µl - Taq DNA polymerase (5U/µl) : 0,2 µl - DNA khuôn : 2,0 µl - H2O khử ion : 14,3 µl Điều kiện chu trình nhiệt thiết lập máy chu trình nhiệt bao gồm: - Biến tính ban đầu 95oC: phút - Biến tính 95oC: 30 giây - Gắn mồi 55oC: 45 giây - Kéo dài mồi 72oC: phút - Kéo dài cuối 72oC: phút - Ủ bảo quản mẫu 4oC: 35 chu kì ∞ 3.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR DNA Staphylococcus aureus tách chiết pha loãng thành nồng độ cách 10 lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Giới hạn phát phản ứng PCR xác định nồng độ DNA tối thiểu cho phản ứng PCR khuếch đại tạo sản phẩm điện di quan sát mắt thường gel agarose [17] Pha loãng mẫu: Mẫu tách chiết Staphylococcus aureus pha loãng đến 10-5 lần để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Hút 45ml nước khử ion vào ống eppendorf, sau ủ 70oC 10 phút Hút 5ml mẫu DNA nồng độ 10o vào ống eppendorf, tiến hành vontex, spindown lần liên tiếp 16 sau đặt tủ 70oC 10 phút Tiếp tục thực ta thu mẫu pha loãng 10-5 lần Độ đặc hiệu phương pháp PCR phát nhanh Staphylococcus aureus xác định kết thử nghiệm với chủng Staphylococcus aureus chủng vi khuẩn kiểm định: E.coli, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogons Clostridium perfringens 3.5.5 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR - Hòa tan hoàn toàn agarose nồng độ 1,5% đệm TE 0,5X sau đun lò vi sóng agarose tan hết - Chuẩn bị gel agarose: Tùy vào số lượng mẫu để chọn khay điện di, cắm lược lên phía khay theo thiết kế Agarose sau đun xong để nguội khoảng 60oC đổ dung dịch vào khay Khoảng 45 phút sau gel đặc lại, dùng tay rút lược, tránh bị bể gel, đặt khay vào bể điện di, tra mẫu dung dịch điện di có bổ sung thêm loading dye - Chạy điện di thiết bị điện di với hiệu điện 100V thời gian 30 phút - Hiện thị kết điện di: ngâm gel 5-10 phút dung dịch ethidium bromide sau hiển thị kết diện di máy soi gel - Phân tích kết điện di + Kết dương tính xác định có mặt băng DNA sáng, rõ kích thước đường chạy điện di + Kết âm tính xác định vắng mặt băng DNA đường chạy điện di [17] 17 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus Để thiết kế cặp mồi phát S aureus, 50 trình tự gen nuc mã hóa nuclease chịu nhiệt chủng S aureus khác công bố ngân hàng gen (GeneBank) Sau đó, 50 trình tự so sánh để tìm vùng tương đồng sử dụng phần mềm ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) (phụ lục 1) Các vùng tương đồng lựa chọn để thiết kế cặp mồi Các cặp mồi thiết tục kiểm tra đặc tính giá trị Tm, tỷ lệ %GC, khả bắt cặp chéo mồi, khả tự bắt cặp sử dụng phần mềm vector NTI phần mềm Tm Caculator (http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm) Vị trí cặp mồi lựa chọn thể hình 4.1 Hình 4.1 Trình tự nucleotide cặp mồi NucF- NucR Trình tự nucleotide cặp mồi lựa chọn thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Trình tự cặp mồi thiết kế Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3’) Tm (oC) NucF TTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCA 54 NucR GCCACGTCCATATTTATCAGTTC 54 Kích thước sản phẩm PCR (bp) 439 Theo công bố Brakstad OG., Aasbakk K and Maeland J A.,(1992) [21] phát S aureus sử dụng gen nuc (mã hóa nuclease chịu nhiệt) làm gen đích Kết nghiên cứu cho thấy gen nuc hoàn toàn sử dụng để phát [15] Do nghiên cứu gen nuc lựa chọn làm gen mục tiêu cho phản ứng PCR phát S aureus Yêu cầu cặp mồi đặc hiệu cho loài vi sinh vật phải cho phép khuếch đại tất chủng thuộc loài không cho phép khuếch đại sản phẩm PCR từ trình tự khác thuộc loài trình tự gen loài khác Trong nghiên cứu cặp mồi lựa chọn so sánh với trình tự gen công bố ngân hàng gen phần mềm BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết so sánh phần mềm BLAST thể bảng phụ lục 18 Kết so sánh cho thấy cặp mồi nucF- nucR bắt cặp hoàn toàn 100% với trình tự gen chủng S aureus không tương đồng với loài khác Điều khẳng định cặp mồi thiết kế hoàn toàn phù hợp cho phát S aureus 4.2 Tối ưu điều kiện phản ứng PCR phát nhanh Stapylococcus aureu 4.2.1 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA phương pháp sử dụng hóa chất DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus BK1, YD1, DP1, DP2 tách chiết phương pháp hóa chất sử dụng CTAB ( Cetryl Ammonium Bromide ) Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số chủng thể hình 4.2 Hình 4.2 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA Đường chạy 1, 2, tương ứng với mẫu tách chiết DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus: BK1, YD1, DP1 DP2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số hình 4.2 cho thấy, băng DNA rõ nét nằm gần với vị trí giếng điện di chứng tỏ băng DNA tổng số, băng DNA không đứt gãy đủ điều kiện thực nghiên cứu 4.2.2 Kiểm tra DNA tổng số phương pháp PCR Để kiểm tra khả sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, mẫu DNA tổng số chủng nghiên cứu sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi nucF – nucR Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5% Kết điện di thể hình 4.3 19 439bp Hình 4.3 Kết khuếch đại vùng gen đặc hiệu Staphylococcus aureus phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết hóa chất Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), đường chạy 1: Sản phẩm PCR mẫu tách chiết BK1, Đường chạy 2: Sản phẩm PCR mẫu tách chiết YD1, đường chạy 3: Sản phẩm PCR mẫu tách chiết DP1, đường chạy 4: Sản phẩm PCR mẫu tách chiết DP2, đường chạy 5: mẫu kiểm chứng âm tính Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR hình 4.3 cho thấy băng DNA rõ nét, không xuất băng phụ Mỗi đường chạy xuất băng DNA chứng tỏ sản phẩm phản ứng PCR hình thành đặc hiệu Do kết luận mẫu DNA tổng số tách chiết hoàn toàn phù hợp cho thí nghiệm xây dựng qui trình phát S aureus kĩ thuật PCR 4.2.3 Xác định nồng độ DNA tối thiểu phản ứng PCR phát Staphylococcus aureus Nồng độ DNA khuôn chủng Staphylococcus aureus YD1 pha loãng nồng độ khác cách 10 lần nước khử ion Các nồng độ DNA pha loãng sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi nucF- nucR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 4.4 500bp 439bp Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng nồng độ khuôn DNA khác 20 Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), đường chạy 1: Mẫu kiểm chứng âm tính, đường chạy 2,3,4,5 tương ứng DNA khuôn nồng độ 0,35.10-1ng/µl, 0,35.10 -2ng/µl, 0,35.10-3ng/µl, 0,35.10-4ng/µl 0,35.10-5ng/µl Từ hình ảnh điện di hình 4.4, kết kiểm tra sản phẩm PCR tóm tắt bảng 4.3 đây: Kết thí nghiệm xác định nồng độ DNA tối thiểu phản ứng PCR cho thấy, nồng độ DNA khuôn giảm dần cường độ băng DNA giảm dần Khi nồng độ DNA khuôn giảm đến 0,35.10-4 ng/µl sản phẩm PCR không xuất hình ảnh điện di Điều chứng tỏ nồng độ DNA khuôn mức 0,35.10-4 ng/µl thấp không hình thành sản phẩm PCR nhận thấy mắt thường hình ảnh điện di Kết thí nghiệm khẳng định, nồng độ DNA khuôn tối thiểu phản ứng PCR 0,35.10-2 ng/µl Do để tối ưu điều kiện phản ứng PCR phát S aureus nồng độ DNA khuôn tương đương 0,35.10-2 ng/µl sử dụng tối ưu điều kiện phản ứng PCR 4.2.4 Tối ưu phản ứng PCR phát nhanh Staphylococcus aureus Trong phản ứng PCR nhiệt độ nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR Theo nghiên cứu Brakstad OG., Aasbakk K and Maeland J A.,(1992) [21], TS Lê Hữu Song, CN Đào Thanh Quyên (2013) [15] để có kết PCR tốt cần phải thiết kế mồi đặc hiệu, tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi tối ưu thành phần phản ứng Để tối ưu điều kiện phản ứng PCR phát S aureus, hàm lượng MgCl2 hỗn hợp phản ứng PCR thay đổi từ 1,5 - 3,0mM nhiệt độ gắn mồi điều kiện chu trình nhiệt phản ứng PCR thay đổi từ 53oC - 57oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5% Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện khác thể hình 4.5 439bp Hình 4.5 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhiệt độ gắn mồi nồng độ MgCl2 khác Đường chạy M: Thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas), đường chạy 1, 9: Mẫu kiểm chứng âm tính 21 Các đường chạy hình 4.5 giải bảng sau: Nhiệt độ gắn mồi Hàm lượng 53oC 55oC MgCl2 1,5mM Đường chạy Đường chạy 2,25mM Đường chạy Đường chạy 3mM Đường chạy Đường chạy 57oC Đường chạy 10 Đường chạy 11 Đường chạy 12 Kết điện di hình 4.5 cho thấy đường chạy 2, 3, 4, 6, 7, 8, 11 12 hình thành sản phẩm PCR tương ứng với kích thước 439 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại từ gen nuc S aureus theo lý thuyết Đường chạy số 10 không hình thành sản phẩm PCR Nồng độ ion Mg2+ cần thiết cho hoạt động DNA polymerase Tính đặc hiệu phản ứng PCR phụ thuộc nhiều vào nồng độ ion Mg2+ Ở nồng độ Mg2+ thấp, phản ứng thất bại DNA polymerase hoạt động Ở nồng độ Mg2+ cao, phản ứng tính đặc hiệu tạo nhiều sản phẩm phụ Do vậy, nồng độ thích hợp Mg2+ lựa chọn cho thí nghiệm khác Nồng độ Mg2+ đề xuất từ 1,5 – 3,0 mM với điều kiện PCR chuẩn [15] Trong thí nghiệm này, khảo sát nồng độ Mg2+ sử dụng từ 1,5 – 3,0 mM Qua hình ảnh điện di kết tối ưu nồng độ Mg2+ phản ứng PCR nhận thấy: dải thử nghiệm nồng độ Mg2+ cho thấy băng có đậm độ kích thước tăng dần tăng nồng độ Mg2+ từ 1,5 mM, 2,25 mM, 3,0 mM Ở nghiên cứu này, lựa chọn nồng độ Mg2+ tối ưu cho phản ứng PCR 1,5 mM cho kết tốt, điều phù hợp với nghiên cứu khác giới Trong nghiên cứu phản ứng PCR lựa chọn với nồng độ DNA 3,5.10-2 ng/µl Kết nghiên cứu giải thích sau: Khi nồng độ DNA khuôn lớn, sai khác hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR điều kiện khác khác biệt lớn với nồng độ DNA nhỏ, nằm vùng cho phép hình thành sản phẩm PCR sai khác điều kiện thành phần phản ứng PCR điều kiện chu trình nhiệt dẫn đến hình thành sản phẩm PCR dễ dàng nhận biết hình ảnh điện di Do đó, nồng độ DNA khuôn 3,5.10-2 ng/µl lựa chọn cho mục đích nghiên cứu Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện nhiệt độ gắn mồi 55oC hàm lượng MgCl2 1,5 mM (đường chạy số 6) cho hình ảnh PCR rõ nét nhất, chứng tỏ phản ứng PCR phát S aureus phù hợp với hàm lượng lượng MgCl2 1,5 mM nhiệt độ gắn mồi 55oC Kết cho phép khẳng định thành phần phản ứng PCR phát S aureus tối ưu sau: Thành phần phản ứng PCR: - 10x PCR buffer : 2,5 µl 22 - MgCl2 (25 mM) : 1,5 µl - dNTPs (2.5 mM) : 1,5 µl - Mồi xuôi (10 µM) : 1,5 µl - Mồi ngược (10 µM) : 1,5 µl - Taq DNA polymerase (5U/µl) : 0,2 µl - DNA khuôn : 2,0 µl - H2O khử ion : 14,3 µl Điều kiện chu trình nhiệt phản ứng: - Biến tính ban đầu 95oC: phút - Biến tính 95oC: 30 giây - Gắn mồi 55oC: 45 giây - Kéo dài mồi 72oC: phút - Kéo dài cuối 72oC: phút - Ủ bảo quản mẫu 4oC: 35 chu kì ∞ 4.3 Kết xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR Để xác định độ đặc hiệu kĩ thuật PCR sử dụng để phát S aureus tiến hành phản ứng PCR khuếch đại gen nuc dùng cặp mồi thiết kế DNA khuôn từ chủng kiểm định, DNA khuôn từ vi khuẩn khác như: E.coli, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis , Listeria monocytogons Clos Perfringens Sản phẩm phản ứng phân tích điện di gel agarose 1,5% (hình 4.6) 439bp Hình 4.6 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách chiết từ loài vi khuẩn kiểm định Đường chạy 1: Staphylococcus aureus; Đường chạy 2: mẫu âm tính Đường chạy 3, 4, 5, 7: Sản phẩm PCR chủng kiểm định là: E.coli, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogons Clostridium perfringens 23 Kết hình cho thấy, sản phẩm PCR DNA khuôn từ vi khuẩn Staphylococcus aureus (đường chạy số 1) xuất băng DNA rõ nét, có kích thước 439 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR theo lý thuyết Đối với mẫu lại (đường chạy số 3, 4, 5, 7), DNA sử dụng loại Staphylococcus aureus đường chạy kiểm chứng âm tính (đường chạy số 2) không xuất sản phẩm PCR Kết thử nghiệm cho phép khằng định kỹ thuật PCR phát nhanh Staphylococcus aureus phát triển nghiên cứu có độ đặc hiệu đạt 100% Một số nghiên cứu phát nhanh vi sinh vật gây bệnh sử dụng kỹ thuật PCR thể độ đặc hiệu cao Theo TS Lê Hữu Song cs (2013) [15] ứng dụng kỹ thuật PCR phát Moraxella catarrhalis, cho độ đặc hiệu 100% Nguyễn Thị Kê cs (2006) [10] ứng dụng PCR để phát nhanh E coli cho độ đặc hiệu 95% Như qui trình phát nhanh S aureus kỹ thuật PCR nghiên cứu có độ đặc hiệu tương đương với nghiên cứu trước 24 Phần KẾT LUẬN 5.1 Kết luận Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho gen nuc, cặp mồi cho phép khuếch đại phản ứng PCR có kích thước 439 bp để phát Staphyloccocus aureus 2.Đã xây dựng quy trình phát nhanh Staphyloccocus aureus kỹ thuật PCR Thành phần phản ứng PCR tối ưu gồm 2,5 µl 10X PCR buffer; 1,5 µl 25mM MgCl2; 1,5 µl dNTPs; 1,5 µl mồi; 0,2 µl 5U/l DNA taq polymerase; µl DNA khuôn 14,3 µl H2O, điều kiện chu trình nhiệt phản ứng giai đoạn biến tính ban đầu 95oC phút; 35 chu kỳ khuếch đại gồm biến tính 95oC 30 giây, gắn mồi 55oC 45 giây, kéo dài mồi 72oC phút; pha kéo dài cuối 72oC phút Đã thử nghiệm kỹ thuật PCR phát nhanh Staphyloccocus aureus chủng kiểm định Kết cho thấy độ đặc hiệu phương pháp đạt 100% 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm quy trình tập hợp nhiều chủng Staphylococcus aureus tập hợp lớn chủng vi sinh vật kiểm định để kiểm tra độ nhạy độ đặc hiệu tương đối quy trình xây dựng 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Huy Chính (2001), Vi sinh y học, NXB Y học, Hà Nội Nguyễn Văn Duy (2011), “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật DNA macroarray nhằm phát nhanh tính kháng rifampicin izoniazid vi khuẩn Lao” Luận án Tiến sĩ, Đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Văn Hải Lê Trung Hải (2005) “Nhận xét 173 trường hợp ngộ độc thực phẩm Khánh Hòa 2001-2004” Trung tâm Y Tế Dự Phòng Tỉnh Khánh Hòa, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm Bùi Thế Hiển, Tô Thị Thu Cs (2005), “Tình hình ô nhiễm thực phẩm vi sinh vật hai xã huyện Kiến Xương tỉnh Thái Bình năm 2001”, Trung tâm y tế dự phòng Thái Bình, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2005 Vương Thị Việt Hoa (2002), Giáo trình thực tập Vi sinh thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM 74 trang Đỗ Thị Hòa, (2006), Phòng chống tụ cầu trùng vàng Khoa học phổ thông, số 30/06 Nguyễn Phú Hùng, Nguyễn Đắc Trung (2008), “Bước đầu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá lưu hành số chủng Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus gây nhiễm trùng bệnh viện bệnh viện Đa Khoa TW Thái Nguyên”, Tạp chí Khoa học & Công Nghệ 64 (02), 91 – 96 Nguyễn Lý Hương, Nguyễn Thị Phấn Bùi Thị Kim Dung (2005), “Khảo sát tình hình ô nhiễm vi sinh vật số mặt hàng thực phẩm ăn liền bán chợ Tp Hồ Chí Minh năm 2002- 2004” Trung tâm y tế dự phòng Tp Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, 2005 Trần Văn Hưng, Ngô Viết Quỳnh Trâm (1996), “Tính đề kháng kháng sinh chủng Staphylococcus aureus phân lập từ người bệnh từ người khỏe mạnh Huế năm 1995” Nghiên cứu thông tin y học Trường ĐH Y Khoa Huế, 70- 73 10 Nguyễn Thị Kê, Cao Minh Nga (2006), “Áp dụng kỹ thuật ELISA, PCR để xác định vi khuẩn E coli gây bệnh truyền qua đường thực phẩm” Đề tài sở Khoa Học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga (2006), “Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa” Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10 (số 4), 406 – 411 26 12 Lê Bá Nhàn (1991), “Tìm hiểu giá trị tiêu chuẩn chẩn đoán tụ cầu gây bệnh” Tập san NCKH Trường Đại Học Y Học Huế, 229- 34 13 Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn Thị Kê, Trần Linh Thước (2006), “Mối tương quan đậm độ khả sinh độc tố ruột (enterotoxin) S.aureus hai môi trường nuôi cấy TSGM BHI”, Y học Tp Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10 (số 4), tr 412 – 417 14 Lê Văn Phủng (2001), “Một số ứng dụng PCR vi sinh vật” Tạp chí Y học thực hành, 53 – 58 15 TS Lê Hữu Song, CN Đào Thanh Quyên (2013), “Nghiên cứu xây dựng quy trình PCR phát Moraxella catarrhalis” Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 16 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục 17 Nguyễn Vũ Trung, Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2008), “Phát triển hoàn thiện quy trình tách chiết AND xác định trực tiếp Escherichia coli gây tiêu chảy PCR” Nghiên cứu y học 56(4): 92-97 18 Phạm Hùng Vân (1996), “Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), đại cách mạng sinh học phân tử” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Số đặc biệt năm 1996, tr 27 - 35 Tiếng Anh 19 Bergdoll M.S (2000), “Staphylococcus aureus In: Foodborne bacterial Pathogens” Marcell Dekker, Inc., New york, USA, pp.463- 523 20 Braga L.C., Shupp J.W., Cummings C., Jett M., Takahashi J.A., Carmo L.S., Chartone-Souza E and Nascimento, M.A., (2004), “Pomegranate extract inhibits Staphylococcus aureus grow than dsubse quententero toxin production” J Ethnopharmacol 96, pp.335-339 21 Brakstad OG., Aasbakk K and Maeland J A.,(1992), “Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene” J Clin Microbiol, July; 30(7), pp 1654- 1660 22 Cardoso H.F., Silva N., Sena M.J., and Carmo L.S (1999), “Production enterotoxins and toxic shock syndrome toxin by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Brazil” Lett Appl Microbiol 29, pp.347-349 23 Fang T.J., Chen C.Y and Kuo W Y (1999), “Microbiological quality and incidence of S aureus and B.cereus in vegetaraian food products” Food Microbiol 16, pp 385- 391 27 24 H.- L Wei C.- S Chiou (2001), “Molecular subtyping of S aureus from an outbreak associated with a food handler” Epidemiol Infect 128, pp.15-20 Cambridge University Press 25 Jogensen H.J., Mork T., Hogasen H.R and Rorvik L.M (2004), “Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in bulk in Norway” J Appl Microbiol 99, pp 158-166 26 Mary K Sandel and John L McKillip (2002), “Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches” Food control 15, pp 5-10 27 Miwa N., Kawamura A (2000), “An outbreak of food poisoning due to egg yolk reaction- negative S aureus” Int J Food Microbiol 64, pp.361- 366 28 Muson S.H., Tremaine M.T., Betley M.J., Welch R.A (1998), “Identification and characterization of Staphylococcal enterotoxin types G and i from Staphylococcus aureus” Infect Immun 66, pp.3337- 3348 29 Normanno G., Firinu A., S V irgilio (2004), “Coagulase - positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy” Int J Food Microbiol 98, pp.73- 79 30 Su - Hua Huang and Tsung - Chain Chang (2004), “Detection of S aureus by a Sensitive Im - muno - PCR Assay” Clinical Chemistry, 50(9), pp 21-28 28 [...]... 54 Kích thước sản phẩm PCR (bp) 439 3.4 Nội dung nghiên cứu 3.4.1 Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR 3.4.3 Xây dựng qui trình phát hiện nhanh Staphylococcus aureus bằng kỹ thuật PCR 3.4.5 Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR trong phát hiện nhanh Staphylococcus aureus 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Phương pháp thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR từ vi khuẩn Staphylococcus aureus - Sưu tập các... dụng là các loại không phải là Staphylococcus aureus và đường chạy kiểm chứng âm tính (đường chạy số 2) không xuất hiện sản phẩm PCR Kết quả thử nghiệm này cho phép khằng định kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Staphylococcus aureus được phát triển trong nghiên cứu này có độ đặc hiệu đạt 100% Một số nghiên cứu phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh cũng sử dụng kỹ thuật PCR và thể hiện độ đặc hiệu cao Theo TS... dụng kỹ thuật PCR và thể hiện độ đặc hiệu cao Theo TS Lê Hữu Song và cs (2013) [15] đã ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện Moraxella catarrhalis, cho độ đặc hiệu là 100% Nguyễn Thị Kê và cs (2006) [10] đã ứng dụng PCR để phát hiện nhanh E coli cho độ đặc hiệu 95% Như vậy qui trình phát hiện nhanh S aureus bằng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu của chúng tôi cũng có độ đặc hiệu tương đương với các nghiên cứu... thế giới hiện nay có rất nhiều phương pháp để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm nhưng PCR có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác nên được ứng dụng rộng rãi Các nghiên cứu của Fang T.J và cs (1999) [23], H.- L Wei, C.- S Chiou (2001) [24] và Jogensen H.J và cs (2004) [25] cũng đã ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện Staphylococcus aureus nhiễm trong thực phẩm chủ yếu trong thịt, trứng và... cho phép khuếch đại phản ứng PCR có kích thước 439 bp để phát hiện Staphyloccocus aureus 2.Đã xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Staphyloccocus aureus bằng kỹ thuật PCR Thành phần phản ứng PCR tối ưu gồm 2,5 µl 10X PCR buffer; 1,5 µl 25mM MgCl2; 1,5 µl dNTPs; 1,5 µl mỗi mồi; 0,2 µl 5U/l DNA taq polymerase; 2 µl DNA khuôn và 14,3 µl H2O, điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng là giai đoạn biến tính... đương 0,35.10-2 ng/µl được sử dụng đã tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR 4.2.4 Tối ưu phản ứng PCR phát hiện nhanh Staphylococcus aureus Trong phản ứng PCR nhiệt độ và nồng độ MgCl2 đều có ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR Theo nghiên cứu của Brakstad OG., Aasbakk K and Maeland J A.,(1992) [21], TS Lê Hữu Song, CN Đào Thanh Quyên (2013) [15] để có một kết quả PCR tốt thì cần phải thiết kế được... sao chép) [18] 2.4.5 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong phát hiện nhanh vi sinh vật gây bệnh Bằng các khuếch đại đoạn acid nucleic đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cao Vì PCR chỉ cần một vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện acid nucleic đích và được PCR khuếch đại [14] Một ưu điểm khác của PCR trong chẩn đoán... hiệu của phản ứng PCR DNA của Staphylococcus aureus được tách chiết và pha loãng thành các nồng độ cách nhau 10 lần rồi được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Giới hạn phát hiện của phản ứng PCR được xác định là nồng độ DNA tối thiểu cho phản ứng PCR khuếch đại tạo ra sản phẩm điện di có thể quan sát được bằng mắt thường trên gel agarose [17] Pha loãng mẫu: Mẫu tách chiết Staphylococcus aureus được... phản ứng PCR phát hiện Staphylococcus aureus Nồng độ DNA khuôn của chủng Staphylococcus aureus YD1 được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và cách nhau 10 lần trong nước khử ion Các nồng độ DNA pha loãng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi nucF- nucR Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 4.4 500bp 439bp Hình 4.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các... Kích thước sản phẩm PCR (bp) 439 Theo công bố của Brakstad OG., Aasbakk K and Maeland J A.,(1992) [21] về phát hiện S aureus đã sử dụng gen nuc (mã hóa nuclease chịu nhiệt) làm gen đích Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy gen nuc hoàn toàn có thể sử dụng để phát hiện [15] Do đó trong nghiên cứu này gen nuc cũng được lựa chọn làm gen mục tiêu cho phản ứng PCR phát hiện S aureus Yêu cầu của một cặp mồi