Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm

Samonella typhi có chiều dài 23µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc gồm 2 màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách murein mỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào. Màng trong và màng ngoài đều là các lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với tế bào. Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và ra khỏi tế bào chất 16.Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O. Ở Samonella typhi và Samonella paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân tử của acid N acetylglucosamine uronic nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao phủ kháng nguyên O. Samonella typhi còn mang các roi dài 2 – 5 µm là sự kéo dài của các thể nền bên trong tế bào. Hầu hết Salmonella được bao phủ bởi lớp lông giúp cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ. Những sợi lông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợi roi, cấu trúc từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn văn Duy, ThS Trần ĐìnhQuang - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã hướng dẫntrực tiếp đề tài, các thầy đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiệnthuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài này

Tôi xin được cảm ơn KS Lã Văn Hiền cán bộ phòng thực hành Sinhhọc phân tử và kỹ thuật di truyền khoa CNSH & CNTP cùng học viên cao họcPhạm Văn Phúc cùng các bạn sinh viên khoa CNSH & CNTP làm nghiên cứutại phòng

Tôi xin được cảm ơn TS Lê Quang Hòa, Viện CNSH & CNTP trườngĐại học Bách Khoa Hà Nội, TS Nguyễn Khắc Trung bộ môn cơ sở Đại học

Y Dược Thái Nguyên, KS Đỗ Bích Duệ và các cán bộ Viện Khoa Học SựSống - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cán bộ Trung tâm Y tế Dự PhòngThái Nguyên đã cung cấp các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài này.Tôixin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và CôngNghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ chúng tôi trong suốt thời gian qua, cảm ơn cáccán bộ đang công tác tại phòng thí nghiệm khoa CNSH &CNTP đã tạo môitrường thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ, thầy cô, bạn bè tôi đã ủng hộ về mặtvật chất cũng như tinh thần giúp tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2012

Sinh viên

Trịnh Thị Tuyết

Trang Bảng 2.1: Bảng phân loại Salmonella và vật chủ theo danh pháp

Kauffmann- White 6

Bảng 3.1: Trình tự cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3.2 : Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 29

Bảng 3.3 : Thành phần phản ứng PCR 32

Bảng 4.1 Giá trị đo OD ở 260nm và 280nm 37

Bảng 4.2 Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR 39

Hình 2.1 Cấu trúc của vi khuẩn Salmonella typhi 7

Hình 4.1: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA 35

Hình 4.2: Kết quả khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Salmonella typhi

bằng phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết bằng hóa

chất 36Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các nồng độ

khuôn DNA khác nhau 38Hình 4.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở nhiệt độ gắn mồi và

nồng độ MgCl2 khác nhau 40Hình 4.5 So sánh hiệu quả tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp

sốc nhiệt và hóa chất 43Hình 4.6 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA

tách chiết từ các loài vi khuẩn kiểm định 45

1 BGLS Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar

3 CFU Cell Forming unit – đơn vị đo khuẩn lạc

4 CIAA 24 Chloroform : 1 Isoamylacohol

6 CTAB Hexadecyltrimethylammonium Bromide

8 ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Xét nghiệm

hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

10 MLPA Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification

11 OD Optical Density – Giá trị mật độ quang

12 PBW Buffered Peptone Water

13 PCR Polymerase Chain Rection

14 PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis – Điện di trường

xung

15 RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – Tính đa hình

các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên

16 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình

chiều dài đoạn cắt giới hạn

17 SC Selenite Cystein Broth

18 SSR Inter - Simple sequence repeat

19 TAE Tris Acid acetic EDTA

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi 3

2.1.1 Trên thế giới 3

2.1.2 Ở Việt Nam 4

2.2 Tổng quan về Salmonella typhi 5

2.2.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi 5

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc 7

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

2.2.4 Đặc điểm di truyền 9

2.2.5 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella typhi 9

2.3 Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella typhi 13

2.3.1 Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống 13

2.3.2 Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp hiện đại 16

2.3.3 Tổng quan phương pháp PCR 22

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 27

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 27

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

3.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 27

3.3.1 Vật liệu nghiên cứu 27

3.3.2 Hóa chất 28

3.3.3 Thiết bị 29

3.4 Nội dung nghiên cứu 30

3.4.1 Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30

3.4.2 Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 30

3.4.3 Đánh giá khả năng tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Salmonella typhi bằng phương pháp tách chiết hóa chất và phương pháp sốc nhiệt 30

3.4.4 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 30

3.5 Phương pháp nghiên cứu 30

3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 30

3.5.2 Phản ứng PCR 32

3.5.3 Phương pháp xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR 32

3.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 33

3.5.5 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR 33

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35

4.1 Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi 35

4.1.1 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp sử dụng hóa chất 35

4.1.2 Kết quả kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết bằng phản ứng PCR 36

4.1.3 Xác định nồng độ DNA tách chiết 37

4.2 Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 38

4.2.1 Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi 38

typhi bằng phương pháp tách chiết bằng hóa chất và phương pháp sốc

nhiệt 42

4.4 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR 44

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm lớn củanhiều quốc gia Thực phẩm không đảm bảo yêu cầu sẽ ảnh hưởng trực tiếpđến sức khoẻ và tính mạng của người tiêu dùng và chất lượng cuộc sống củanhân dân cùng với sự phát triển kinh tế xã hội

Phần lớn các vụ ngộ độc đã xảy ra với quy mô nhiều người mắc,nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc là do thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ

lệ cao nhất (43,2%) [18] Đặc biệt là vi khuẩn Salmonella typhi là thủ phạm

gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm Ngày nay người ta đã biết được tới trên

2500 chủng hoặc chủng huyết thanh của Salmonella [18] Bệnh Salmonella trên người do vi khuẩn Salmonella typhi gây nên, chủ yếu lây nhiễm thông

qua sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc động vật bị nhiễm vi khuẩn này(chủ yếu là thịt, gia cầm, trứng và sữa) Trên thế giới, các vụ ngộ độc thực

phẩm do Salmonella là rất phổ biến: tháng 7 năm 2007 tại Rumani có 117

người lớn và trẻ em bị ngộ độc do ăn bánh kem trong thời gian cắm trại, tháng

8 năm 2007, tại Hungary bùng nổ vụ ngộ độc tại nhà hàng Budapes làm 31

du khách ngộ độc Tác nhân gây ngộ độc chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn,

trong đó hàng đầu là Salmonella typhi.

Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm vẫn chủ yếu sử dụng

phương pháp nuôi cấy truyền thống Phương pháp này luôn bao gồm nhiều côngđoạn nuôi cấy kết hợp với các bước kiểm tra sinh hóa, tốn nhiều thời gian (thờigian phát hiện là 4 – 6 ngày), tốn nhiều công sức, gây khó khăn trong việc phântích nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây

ngộ độc được nghi ngờ do Salmonella gây ra Mặt khác quy trình phân tích này không cho phép phân biệt các loài hay loài phụ Salmonella với nhau Sự phát hiện

chậm các vi khuẩn sẽ làm cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lantrong cộng đồng ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Đã có nhiều kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để phát hiện vikhuẩn gây bệnh có trong mẫu phân tích như lai DNA, kỹ thuật PCR, ELISA,

…Trong số các phương pháp trên, PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹthuật đã được sử dụng phổ biến trong phát hiện nhanh nhiều loài vi khuẩn gâybệnh vì kỹ thuật này đơn giản, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian chẩnđoán ngắn và không yêu cầu thiết bị phức tạp Dựa vào việc sử dụng cặp mồiđặc hiệu với vùng DNA đặc hiệu cho từng chủng, kỹ thuật PCR cho phépphát hiện đến mức độ chủng vi khuẩn gây bệnh Do đó, việc ứng dụng kỹ

thuật PCR trong phát hiện nhanh Salmonella typhi là một đề tài có ý nghĩa

thiết thực, góp phần vào việc kiểm soát mức độ an toàn thực phẩm do

Salmonella gây nên, đảm bảo sức khỏe cộng đồng.

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiêncứu của Khoa CNSH và CNTP – Đại học Nông Lâm Thái Nguyên chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng được quy trình phát hiện nhanh Salmonella typhi trong thực

phẩm bằng kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu cao

1.3 Yêu cầu nghiên cứu

- Xây dựng được quy trình tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi phục vụ phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi

- Tối ưu được điều kiện của phản ứng PCR phát hiện Salmonella typhi.

- Xác định được giới hạn phát hiện, độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát

hiện nhanh Salmonella typhi trong thực phẩm.

1.4 Ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Xây dựng thành công quy trình phát hiện nhanh và đặc hiệu

Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm Tạo tiều đề cho việc xây dựng bộ kít chẩn đoán nhanh Salmonella typhi dựa trên kỹ thuật PCR.

- Giúp sinh viên rèn luyện các kỹ năng thí nghiệm, nghiên cứu, tácphong làm việc chủ động, khoa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung các phương pháp chẩn đoán

nhanh và đặc hiệu Salmonella typhi gây bệnh trong thực phẩm.

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do nhiễm Salmonella typhi

2.1.1 Trên thế giới

Bệnh Salmonella là một trong những bệnh ngộ độc thực phẩm phổ biến

và phân bố rộng rãi nhất Mỗi năm thế giới đã ghi nhận hàng triệu ca bệnh

trên người và bệnh đã gây ra hàng nghìn ca tử vong Bệnh Salmonella do vi khuẩn Salmonella gây ra Ngộ độc do nhiễm vi khuẩn Salmonella lần đầu tiên được phát hiện cách đây hơn 100 năm, Salmonella là một trong những tác

nhân gây bệnh cho người và súc vật truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt(heo, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của

trứng Ở Đan Mạch 1995 có 2911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có

19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng

bị nhiễm vi khuẩn này Gần đây ở Mỹ hàng năm có khoảng 4000 trường hợp

bị bệnh do thực phẩm bị nhiễm Salmonella [20] Năm 2000, người ta ước

tính rằng hơn 2,16 triệu người mắc bệnh thương hàn trên toàn thế giới, kếtquả là 216000 người chết và tỷ lệ tử vong cao xảy ra ở châu Á [31] ỞIndonesia, tỷ lệ mắc bệnh thương hàn là 1487 nghìn người mỗi năm Năm

2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26% thịt heo nhiễm

Salmonella Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu là các vi khuẩn thương hàn, trong đó hàng đầu là Salmonella typhi.

Bệnh Salmonella đã trở thành một gánh nặng y tế công cộng lớn và thể

hiện bằng chi phí đáng kể ở nhiều quốc gia Một số quốc gia đã tính toán chiphí kinh tế của bệnh Ở Mỹ hàng năm ước tính có khoảng 1,4 triệu người

nhiễm trùng Salmonella không phải thương hàn đã đưa đến 168000 lượt

khám, 15000 lượt điều trị nội trú và 580 ca tử vong Chi phí ước tính cho mỗi

ca nhiễm Salmonella ở người dao động trong khoảng từ 40 đô la Mỹ đến 4,6

triệu đô la Mỹ tương ứng với từ các ca đơn giản đến các ca phải nhập viện và

tử vong Tổng chi phí liên quan đến Salmonella hàng năm ở Mỹ vào khoảng 3

tỷ đô la [20] Ở Đan Mạch, ước tính chi phí hàng năm cho các bệnh

Salmonella do ngộ độc thực phẩm là khoảng 15,5 triệu đô la Mỹ (2001) tương đương với khoảng 0,009% GDP Một chương trình khống chế Salmonella đã

được thực hiện vài năm ở Đan Mạch với chi phí hàng năm cho chương trìnhkhoảng 14,1 triệu đô la Mỹ, ước tính chương trình này đã tiết kiệm 25,5 triệu

đô la chi phí công cộng của Đan Mạch [18] Các số liệu liên quan đến chi phícủa các bệnh ngộ độc thực phẩm thường không sẵn có ở các nước đang pháttriển

Salmonella typhi chiếm 70% các vụ ngộ độc [ 7].

Theo báo cáo của Bộ y tế về tình hình mắc bệnh thương hàn thì năm

2012 ghi nhận 617 trường hợp, không có tử vong So với cùng kỳ năm 2011(873 trường hợp mắc, không có tử vong), số mắc giảm 29,3% Số mắc giảmdần trong giai đoạn 2007 - 2011 từ 2148 (năm 2007) còn 873 (năm 2011), tửvong duy trì 0 – 2 trường hợp/năm Trung bình giai đoạn 5 năm tỷ lệ mắc trên100.000 dân là 1,806; tỷ lệ chết trên 100.000 dân là 0,001 Khu vực miềnNam chiếm đa số (>60%), tập trung tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, TP

Hồ Chí Minh, Kiên Giang Trong năm 1999 số ca mắc bệnh thương hàn tạicác tỉnh miền Nam tăng khá cao như: Sóc Trăng (205,57/100.000 dân), ĐồngTháp (108,78/100.000 dân), An Giang ( 96,37/100.000 dân) [ 7, 8]

2.2 Tổng quan về Salmonella typhi

2.2.1 Danh pháp và phân loại của Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi

Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Họ vi

khuẩn này có đặc điểm chung là gram âm, hình que, oxidase âm và có thể diđộng được [24,27] Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh

Salmonella trong đó Kauffmann - White là phương pháp định danh được công

nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003 [3] Phương pháp này dựa vào sự

ngưng kết của huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là

kháng nguyên O và kháng nguyên H

Kháng nguyên O có bản chất là một polysaccharide nằm ở ngoài cùngcủa màng tế bào Cấu trúc của kháng nguyên O là cao phân tử gồm nhiều tiểuđơn vị, mỗi tiểu đơn vị gồm từ 4 đến 6 gốc đường Những thay đổi trongthành phần hay liên kết giữa các gốc đường của tiểu đơn vị tạo ra những loạikháng nguyên O khác nhau Kháng nguyên O được chia thành các nhómkháng huyết thanh khác nhau (serogroup) qui ước bằng số như O9, O2, O4…(Ban đầu các nhóm O phổ biến được qui ước bằng chữ cái và đến nay vẫn còn

dùng ở một số nơi) Ví dụ Salmonella typhimurium thuộc nhóm O4 hay còn gọi nhóm B, Salmonella typhi thuộc nhóm O9 (nhóm D1), Salmonell paratyphi thuộc nhóm O2 (nhóm A).

Kháng nguyên H là phần tạo thành cấu trúc roi của vi khuẩn Khángnguyên H có bản chất là protein, hình thành từ các tiểu đơn vị protein

flagellin Salmonella là vi khuẩn đường ruột duy nhất có thể biểu hiện hai loại

kháng nguyên H khác nhau được mã hóa bởi hai gen khác nhau Tuy nhiênhoạt động của 2 gen được phối hợp sao cho chỉ một kháng nguyên H đượcbiểu hiện ở một thời điểm trong một tế bào vi khuẩn Hai kháng nguyên Hnày được xếp vào pha 1 và pha 2 Các chủng “đơn pha” là các chủng chỉ biểuhiện một kiểu kháng nguyên duy nhất do sự bất hoạt của gen mã hóa cho

kháng nguyên pha 1 hoặc pha 2 Ngoài ra một số týp huyết thanh “đơn pha”

do tự nhiên như Salmonella enteriditis, Salmonella typhi [1,4,20]

Theo phương pháp định danh này, Salmonella được chia thành hai loài: Salmonella enterica và Salmonella bongori (trước đây được xếp vào Salmonella enterica phân loài V) Salmonella enterica được chia thành 6 phân loài qui định bằng tên hoặc số La Mã, trong đó Salmonella typhi thuộc

S enterica subsp enterica (I) 1454 Động vật máu nóng

S enterica subsp salamae (II) 489 Động vật máu lạnh và

Tổng cộng: 2463 tuýt huyết thanh

Tên của týp huyết thanh không được viết in nghiêng và chữ cái đầu tiênđược viết hoa để nhấn mạnh các týp huyết thanh này không phải là những loài

khác nhau Tóm lại Salmonella enterica subsp enterica serotype typhi (Salmonella typhi) là chủng vi khuẩn có tên týp huyết thanh (serotype) là typhi thuộc giống Salmonella, loài Salmonella enterica và phân loài enterica [1]

Samonella typhi còn được qui ước bằng công thức kháng nguyên: I

9,12(Vi):d:- để mô tả vi khuẩn này thuộc phân loài I có kháng nguyên O là 9,

12 và mang thêm kháng nguyên vỏ Vi, kháng nguyên H pha I là d và không

có kháng nguyên H pha 2[1,2]

Phần lớn 59% týp huyết thanh của Salmonella thuộc Samonella enterica phân loài I trong đó các nhóm kháng huyết thanh O phổ biến nhất là O2, O4, O9, … gây ra khoảng 99% sự nhiễm trùng do Salmonella ở người và

động vật máu nóng [4]

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc

Hình 2.1 Cấu trúc của vi khuẩn Salmonella typhi

Samonella typhi có chiều dài 2-3µm và đường kính 0.5 µm, cấu trúc

gồm 2 màng: màng trong và màng ngoài ngăn cách nhau bởi vách mureinmỏng nhưng chắc chắn giúp định hình tế bào Màng trong và màng ngoài đều

là các lớp lipoprotein, đóng vai trò là hàng rào có tính thấm chọn lọc đối với

tế bào Trên màng có các kênh chuyên biệt để vận chuyển các phân tử vào và

ra khỏi tế bào chất [16]

Màng ngoài được bao phủ bởi các kháng nguyên O Ở Samonella typhi

và Samonella paratyphi đặc biệt còn mang kháng nguyên vỏ Vi, là cao phân

tử của acid N- acetylglucosamine uronic nằm bên ngoài bề mặt tế bào và bao

phủ kháng nguyên O Samonella typhi còn mang các roi dài 2 – 5 µm là sự kéo dài của các thể nền bên trong tế bào Hầu hết Salmonella được bao phủ

bởi lớp lông giúp cho sự gắn của tế bào vi khuẩn lên tế bào chủ Những sợilông này có đường kính khoảng 10nm, ngắn hơn và thẳng hơn so với các sợiroi, cấu trúc từ các tiểu đơn vị fimbrillin hoặc pilin [2,3]

Cấu trúc bề mặt của Samonella typhi đóng vai trò quan trọng quyết

định các đặc tính sinh lý và sự bám vào các mô của tế bào chủ Nếu

Salmonella mất hoặc không biểu hiện kháng nguyên O sẽ không có khả năng

sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớp lipopolisaccharide bảo vệ

vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể của hệ miễn dịch [16]

2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Salmonella typhi là trực trùng gram âm không tạo bào tử, kị khí tùy ý,

di động được bằng các roi có vành lông rung, phát triển tốt nhất ở 37oC, cókhả năng lên men glucose nhưng không lên men lactose, có thể tạo một ít H2S

từ cơ chất sulphat tan Chúng sinh catalase nhưng không tạo oxidase trongquá tình sống [13]

Salmonella typhi khác so với hầu hết Salmonella ở chỗ chúng không

bao giờ sinh hơi từ glucose, không sử dụng citrate hoặc decarboxylate

orthinine và không lên men rhamnose Samonella typhi không sinh

indole, thử nghiệm Voges - Proskauer âm tính, phenylalanine deaminase vàurease âm tính Các đặc tính sinh hóa này được sử dụng kết hợp với các thử

nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh trong định danh Salmonella typhi [15].

Salmonella typhi là vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người mà không gây bệnh ở bất kỳ sinh vật nào khác Salmonella typhi có khả năng thay đổi

để chống lại các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như nhiệt độ cao, pH thấp vì vậy

rất khó để loại bỏ tận gốc vi khuẩn này khỏi chuỗi thức ăn Salmonella typhi

có thể tồn tại ở thịt chưa được nấu chín và xâm nhập qua hàng rào cản acid dạdày để gây bệnh ở người [6].

2.2.4 Đặc điểm di truyền

Bộ gen Salmonella typhi mang 204 pseudogen chiếm hơn 4% trình tự mang mã [3], tương tự với bộ gen của Salmonella paratyphi (Pseudogen là

những trình tự DNA mang mã nhưng không được dịch mã) Những gen này

có thể bị bất hoạt do đột biến tạo stop codon, đột biến gây lệch khung, mấtđoạn hay tái sắp xếp đoạn Trong khi hầu hết các týp huyết thanh của

Salmonella enterica đều gây bệnh ở nhiều kí chủ khác nhau và giới hạn ở viêm dạ dày ruột thì Salmonella typhi và Salmonella paratyphi chỉ gây bệnh ở người và còn gây nhiễm trùng hệ thống [7] Trình tự DNA bộ gen Salmonella typhi và Salmonella paratyphi có mức độ tương đồng cao nhất so với các týp

huyết thanh còn lại Sự bất hoạt những gen đóng vai trò quan trọng trongtương tác với các tế bào chủ, các gen làm thay đổi chu trình kí sinh nội bào

được xem là cơ chế tiến hóa để Salmonella typhi cũng như Salmonella paratyphi trở thành vi khuẩn gây bệnh chuyên biệt ở người [13].

Một đặc điểm quan trọng khác ở Salmonella typhi là vi khuẩn này

mang rất ít đặc tính đa dạng di truyền Khi giải trình tự vài gen để phân biệt

Salmonella typhi chỉ thu được rất ít vị trí đa hình [14] Việc tìm hiểu những vi khuẩn có tính đa dạng di truyền thấp như Salmonella typhi gặp rất nhiều khó

khăn và đòi hỏi những kỹ thuật phức tạp

2.2.5 Bệnh học sốt thương hàn do Salmonella typhi

2.2.5.1 Nguồn lây bệnh và con đường truyền bệnh

Sốt thương hàn là bệnh nhiễm trùng hệ thống do Salmonella typhi gây

ra, con người là kí chủ duy nhất của Salmonella typhi Người lành mang trùng

có thể thải từ 106 đến 109 vi khuẩn thương hàn trong mỗi gram phân [31] Salmonella typhi có thể tồn tại trong nước ao, hồ, nước ngầm, trong sữa, thịt,

trứng và sò bị nhiễm khuẩn Liều gây bệnh là 103 đến 106 vi khuẩn theođường miệng [18]

Vi khuẩn thương hàn lây qua đường tiêu hóa Đa số các trường hợpmắc bệnh là do ăn uống thực phẩm, nước bị nhiễm khuẩn và không được nấuchín Những yếu tố nguy cơ phải kể đến nguồn nước nhiễm bẩn, kem, thựcphẩm và nước uống đường phố, rau quả được tưới bằng nước thải bẩn hoặcđược rửa bằng nước nhiễm khuẩn như nước sông, nước ao hồ, cống rãnh Doliên quan đến những yếu tố điều kiện sống nên bệnh thường lưu hành ở nhữngnơi có mật độ dân số cao cùng với tập quán sinh hoạt kém vệ sinh [6]

2.2.5.2 Triệu chứng lâm sàng.

Sau khi Salmonella typhi xâm nhập vào cơ thể từ 7 – 21 ngày thì bắt

đầu xuất hiện các triệu chứng khó ở, mệt mỏi, nhức đầu, biếng ăn, sốt nhẹ sau

đó sốt cao dần, đặc biệt về đêm (39-40oC) kéo dài hàng tuần nếu không điềutrị cùng với đó là tiêu chảy hoặc táo bón, ho, nôn mửa, đau bụng, cổ cứng.Bệnh nhân còn có thể bị chậm nhịp tim, lách to, mơ sảng Trong tuần thứ hai30% bệnh nhân có những đốm hồng ở bụng, ngực, lưng còn gọi là hồng ban,sau tuần thứ ba bệnh nhân dần hồi phục Tuy nhiên 10% bệnh nhân bị tái pháthay biến chứng nặng hơn, các biến chứng nguy hiểm bao gồm xuất huyết tiêuhóa và thủng ruột [6]

Ngoài ra 1-6% bệnh nhân trở thành nguồn mang Salmonella typhi mãn tính Những người này có thể mang vi khuẩn Salmonella typhi trong tủy

xương hay túi mật từ vài tháng đến cả cuộc đời, đồng thời thải vi khuẩn quaphân và nước tiểu theo định kỳ mà không hề biểu hiện triệu chứng bệnh nào.Đây là vấn đề y tế công cộng quan trọng vì những người này là có thể lànguồn lây nhiễm và làm bùng phát dịch bệnh trong tương lai

2.2.5.3 Sự phát sinh bệnh do Salmonella typhi.

Sau khi vào cơ thể vi khuẩn tấn công vào ruột Tại đây chúng xâm nhậpqua các tế bào M của mảng Peyer hoặc di chuyển qua các tế bào biểu mô hấpthu để xuyên qua lớp dưới niêm mạc ruột non Tiếp đó vi khuẩn kích thíchphản ứng viêm và hoạt động thực bào bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào,đồng thời huy động tế bào bạch huyết B và T Vi khuẩn này có thể tồn tại và

nhân lên trong các bạch cầu đơn nhân, qua đó giúp Salmonella typhi phát tán

theo đường máu và bạch huyết đến các hạch bạch huyết mạng treo ruột và các

mô sâu hơn Sau khi phát tán vi khuẩn sẽ gây nhiễm trùng máu sơ cấp với các

triệu chứng nhẹ như hồng ban, ho tiếp đó Salmonella typhi nhiễm vào lách,

gan và tủy xương gây nhiễm trùng máu thứ cấp Trong tuần thứ hai của bệnh

Salmonella typhi nhiễm vào túi mật sau đó vi khuẩn nhân lên, theo ống mật

vào ruột non và được thải ra ngoài qua phân [4,6]

2.2.5.4 Biện pháp phòng bệnh sốt thương hàn.

Bệnh chủ yếu lây qua đường ăn uống thức ăn hoặc nước bị nhiễmkhuẩn nên biện pháp quan trọng hàng đầu là tạo điều kiện vệ sinh an toànthực phẩm, cải thiện hệ thống xử lý chất thải và nguồn cung cấp nước Ở cácnước phát triển, bệnh chủ yếu xảy ra ở khách du lịch trở về từ các nước códịch nên khách du lịch khi đến những vùng này cần chú ý đến vấn đề an toànthực phẩm

Do Salmonella typhi chỉ gây bệnh ở người nên nguồn gốc lây lan bệnh

luôn liên quan đến những người mắc sốt thương hàn hoặc mang mầm bệnhmãn tính Những người chế biến thực phẩm mang mầm bệnh mãn tính có thể

là nguyên nhân của những đợt dịch sốt thương hàn nghiêm trọng Những

người mang Salmonella typhi mãn tính có thể làm lan tràn bệnh dịch nếu họ

gây nhiễm nguồn cung cấp nước Vì vậy, việc tầm soát và chữa trị cho những

người mang Salmonella typhi mãn tính là hết sức quan trọng trong công tác

phòng chống dịch [6]

Vacxin là một biện pháp hiệu quả trong phòng bệnh sốt thương hàn

Vacxin đầu tiên là chủng Salmonella typhi bị bất hoạt do nhiệt, phenol,…Tuy

nhiên vacxin này gây nhiều phản ứng phụ Tiếp theo là Vacxin Ty21a có nguồn

gốc từ chủng Salmonella typhi Ty2 được làm yếu và không mang vỏ Vi Đây là

vacxin dạng uống, uống 3 lần, mỗi lần cách nhau 2 ngày Vacxin này tương đối

an toàn cho hiệu quả bảo vệ trong 5 năm và ít có tác dụng phụ, tuy nhiên lạikhông được sử dụng cho trẻ em dưới 6 tuổi Vacxin thứ 3 có bản chất là

polysaccharide Vi tinh chế, được dùng ở dạng tiêm một lần duy nhất Do vacxinnày ít tác dụng phụ nên được sử dụng rộng rãi và có thể dùng cho trẻ em trên 2tuổi, tuy nhiên hiệu quả bảo vệ cũng chỉ khoảng 2-3 năm Sau 3 năm phải tiêmnhắc lại Vacxin này thường được tiêm cùng với một số vacxin khác cho nhữngngười đi du lịch đến các vùng lưu hành dịch Ngoài ra còn có vacxin tái tổ hợp

Vi cho trẻ em từ 2-5 tuổi ở Việt Nam Vacxin này cho hiệu quả bảo vệ 91.1%trong 27 tháng, có thể dùng cho trẻ em dưới 2 tuổi và đã được đưa vào chươngtrình tiêm chủng quốc gia mở rộng [18]

2.2.5.5 Biện pháp điều trị sốt thương hàn

Ở các vùng dịch tễ sốt thương hàn, hơn 60-90% trường hợp bệnh đượcđiều trị tại nhà bằng kháng sinh và nghỉ ngơi hợp lý Đối với bệnh nhân nhậpviện sẽ được điều trị bằng kháng sinh, dinh dưỡng, chăm sóc hợp lý, cân bằngđiện giải, bù nước [15]

Trong các kháng sinh sử dụng điều trị sốt thương hàn hiện nay thìfluoroquinolone (oxfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin) đượcxem là họ kháng sinh hiệu quả nhất Hiệu quả của các kháng sinh này đã đượcchứng minh qua các thử nghiệm lâm sàng

Tuy nhiên việc vi khuẩn kháng quinolone ở những vùng lưu hành dịch

đã làm giảm hiệu quả của fluoroquinolone Ở những nơi vi khuẩn vẫn nhạyvới quinolone thì fluoroquinolone là lựa chọn tốt nhất để điều trị sốt thươnghàn Ngược lại, nếu vi khuẩn kháng quinolone thì hiệu quả điều trị vớifluoroquinolone giảm, thời gian điều trị kéo dài, liều dùng phải cao và tăngnguy cơ thất bại

Ngoài fluoroquinolone thì azithromycin và cephalosporin thế hệ thứ 3(ceftriaxone, cefixime, cefotaxime và cefoperazone) cũng là những khángsinh hiệu quả trong điều trị sốt thương hàn Chloramphenicol, amoxicillin vàcotrimoxazole vẫn là lựa chọn thích hợp trong điều trị sốt thương hàn ở nhữngnơi vi khuẩn vẫn còn nhạy với các kháng sinh này [1,6,7]

2.3 Các phương pháp phân loại di truyền Salmonella typhi

2.3.1 Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

Đây là phương pháp định tính và kết quả là có hay không phát hiện

Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm Do quy định không cho phép

có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, nên mẫu lấy tối thiểu phải 25

g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong

mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng trong quá trình bảo quản chế biến và

sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh

chọn lọc, phân lập và khẳng định Việc khẳng định dựa trên các kết quả thửnghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp [3,17]

Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment): Đây là khâu quan trọng

không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm khôngphải là mẫu bệnh phẩm Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinhkhông chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạođiều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiệndiện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thựcphẩm Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môitrường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra

nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae [15] Tùy theo

đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phùhợp, thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuynhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi [29]

Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment): Giai đoạn này

làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế hoặc

ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi choviệc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập.

Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng

là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT),Selenite Cystein Broth (SC) [32]…Thông thường môi trường TT được dùng đểphân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, cácmẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thựcphẩm khác Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi

trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella Mỗi loại môi trường tăng

sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của

Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này

nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác [2] Ví dụ:

Salmonella typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT, Salmonella dublin không phát triển được trong môi trường RV Ngoài ra, mỗi

môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường

RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 – 24 giờ [18]

Giai đoạn phân lập (isolation): Đây là bước tách biệt Salmonella

trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng Một số môi trường phân lậpnhư Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA),Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen EntricAgar (HEP) Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái

khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau [16,18]

Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu

khuẩn lạc đặc trưng khác nhau Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng

tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen Một số dòng Salmonella có khả

năng sinh H2S, trừ Salmonella typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có tâm đen [2] Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay

đen, có hay không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xungquanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho

việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục

trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra

vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh, dưới 1% Salmonella không điển hình,

chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục.Trên

môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục,

có hay không có tâm đen Một số loài Salmonella có thể phát triển thành

khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn

toàn có màu đen Có một số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có

hoặc không có tâm đen [2,3,15,18]

Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa: Đây là bước xác nhận các

dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử

nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng Các biểu hiện sinh hóa của

Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase

(+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+) [16] Nếucác biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng cácthử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá Vi khuẩnsau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa

nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella [24]

- Phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn đang được áp dụng tại Việt

Nam cũng như các nước khác trên thế giới để phát hiện Salmonella trong thực

phẩm, đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi Tuynhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho cáccông việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình, thời gian

để có kết quả phân tích phải mất từ 4 – 6 ngày Với thời gian này đã khôngđáp ứng được các yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chươngtrình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay

hoặc gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho đểchờ kết quả phân tích [29,13].

2.3.2 Phát hiện Salmonella typhi bằng phương pháp hiện đại

* Phương pháp Phage Typing

Phage typing là phương pháp đầu tiên nhằm phân biệt Salmonella typhi

trong các nghiên cứu về dịch tễ thương hàn và cho hiệu quả khá tốt

Nguyên tắc của phương pháp này là mỗi loại phage chỉ ly giải mộtchủng vi khuẩn mà không thể ly giải chủng vi khuẩn khác trong cùng mộtloài Do đó các chủng của một loài vi khuẩn có thể được phân biệt dựa trêntính nhạy khác nhau của chúng với một hỗn hợp nhiều loại phage khác nhau[20]

Ưu điểm của phương pháp này là so với phương pháp kiểu gen, phươngpháp huyết thanh là có giá thành rẻ hơn, không tốn công lao động Nhượcđiểm là nặng về kỹ thuật và chỉ được thực hiện ở một số phòng thí nghiệmchuẩn Hiệu quả phân biệt của phương pháp còn hạn chế do độ đa dạng củahỗn hợp phage không cao, đặc biệt khi chủng phân lập trong một vùng địa

phương Ngoài ra nhiều chủng Salmonella typhi không thể xác định được kiểu

Vi do chúng kháng với hoạt động của các Vi-phage hoặc phản ứng chéo vớinhiều loại Vi-phage khác nhau [24]

Trong nhiều năm qua phương pháp Phage typing đã được sử dụng như

một công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu sự bùng phát của Salmonella typhi Điển hình như Ward L R et al (1987) đã mô tả phương pháp Phage typing nhằm phát hiện ra vi khuẩn Salmonella enterica [20].

* Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

Là phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại ngẫu nhiên, kỹthuật này được phát hiện vào năm 1990 bởi Welsh và McClelland, được sửdụng lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) để kiểm tra mẫu ADN củacon người chưa rõ danh tính [19] Random amplified polymorphic DNA (tính

đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là phương pháp phân biệt dựa trên

sự khuếch đại ngẫu nhiên các đoạn DNA trên nhiễm sắc thể, dùng nghiên cứu

sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau Mồi được sử dụng trong kỹ

thuật RAPD là những sợi oligonucleotide có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên, cácsản phẩm RAPD được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose Hệ gencủa hai loài khác nhau sẽ cho những đoạn băng trên gel khác nhau, từ đó cóthể so sánh sự đa dạng sinh học của các giống cây [15, 19].

Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sửdụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước bắt cặp

và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự củacác primer Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả haimạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đạiđược (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau saukhi khuếch đại Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã cómột sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi Cácmồi dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tươngđồng trên mạch đơn DNA bộ gen Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD làđáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cảnviệc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc

sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làmthay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại [11]

Dùng nhiều primer khác nhau sẽ khuếch đại nhiều đoạn gen với kíchthước khác nhau, kết quả này được thể hiện trên gel với nhiều băng ở những

vị trí khác nhau, các băng đa hình được ghi nhận và từ đó có thể vẽ được bản

đồ trên một quần thể đang phân ly

Sinh vật cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, khuyếch đạicác đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiênnào để chạy PCR Sinh vật khác nhau ít nhiều sẽ khác nhau về kiểu gen thìmột số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kíchthước khác nhau.r

Phương pháp này có ưu điểm là phát hiện nhanh tính đa dạng di truyền,thao tác đơn giản không đòi hỏi kỹ thuật cao, tương đối rẻ tiền hơn so với các

phương pháp RFLP, SSR, không dùng đồng vị phóng xạ nên tránh được độc

hại cho người thao tác [15], thường được áp dụng để phân loại Salmonella typhi và cho hiệu quả phân biệt khá cao Nhược điểm là có sự xuất hiện các

băng tính trội điều đó sẽ không phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dịhợp tử, tính lặp lại không cao do mồi là ngẫu nhiên và phụ thuộc vào điềukiện phản ứng PCR, trở ngại trong việc giải thích các băng có cùng tốc độ dichuyển Việc sử dụng mồi, các loại enzyme polymerase khác nhau, qui trìnhchuẩn bị DNA khác nhau hay thực hiện ở các phòng thí nghiệm khác nhauđều có thể ảnh hưởng đến kết quả [3]

Các công trình nghiên cứu trên thế giới ứng dụng kỹ thuật RAPD đãđược công bố như Bianca R Q.và cs (2004) Tối ưu hóa của phản ứng RAPD

đặc trưng cho Salmonella enterica serovar Typhi để đảm bảo khả năng tái

sinh và khả năng phân biệt của kỹ thuật này, trong nghiên cứu này để tối ưuphản ứng RAPD các nhà khoa học đã sử dụng nồng độ khác nhau của DNAkhuôn, mồi, MgCl2 và Taq polymerase để kiểm tra 8 chủng Salmonella typhi

được phân lập ở các khu vực khác nhau của Brazil [30],

đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông quacường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát

hiện [27] Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: khángnguyên, kháng thể và chất tạo màu thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giảiphóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làmthay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Phương pháp này có ưu điểm là có thể sử dụng cho hầu hết các loạikháng nguyên với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Kĩ thuật khá đơn giản và cóhiệu quả, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độrất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- RadioImmuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độchính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnhnhư virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Kỹ thuật ELISA đã được nghiên cứu ứng dụng nhằm phát hiện Salmonella

ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới phần lớn sử dụng các kháng thể khángnguyên roi hay còn gọi là kháng nguyên H như Lee H A et al.(1990), Wyatt G

M et al (1993), Brigmon R L et al.(1995) Còn tại Việt Nam cũng có các

nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát hiện nhanh Salmonella như công

trình của Nguyễn Trí Nhân, Nguyễn Hồng Nhã Trân, Đặng Thị Phương Thảo,

Trần Linh Thước (2005) tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên H:g,m của Salmonella enterica trong tế bào Ecoli Trong nghiên cứu này với mục đích xây dựng quy trình ELISA phát hiện Salmonella trong thực phẩm thì các nhà

khoa học đã lựa chọn kháng nguyên H toàn phần, nhằm ứng dụng tính phản ứng

chéo giữa kháng nguyên và kháng thể của các serotype của các Salmonella để phát hiện ra Salmonella bất kỳ [10].

* Phương pháp PFGE (Pulsed- Field Gel Electrophoresis) - Điện di trường xung

Điện di trường xung được xem là phương pháp phân tử hiệu quả trongnghiên cứu về dịch tễ học PFGE có hiệu quả phân biệt cao hơn các phương

pháp có sử dụng mẫu dò như Ribotyping hay RFLP Do đó phương pháp nàyđược xem là một tiêu chuẩn vàng trong các phương pháp phân biệt bằng sinhhọc phân tử [24].

Nguyên tắc: Trước tiên các mẫu đưa vào phân tích phải được xử lýtrước bằng loại enzym cắt hạn chế mà có rất ít điểm cắt Kết quả phải tạo rađược các mảnh có kích thước lớn (50 kb – 12 Mb), với kích thước này khôngthể điện di theo phương pháp thông thường mà chỉ có thể tách ra bằng kỹthuật PFGE Kỹ thuật PFGE lần đầu tiên được Schwartz va Cantor (1984)giới thiệu Tuy nhiên sau đó đã có nhiều tác giả mô tả lại kỹ thuật này, tuy cósai khác ít nhiều nhưng cơ sở lý thuyết của các phương pháp này là như nhau.Mục đích của kỹ thuật này là tăng khả năng di động của các mảnh ADN cókích thước lớn trong điện trường, do đó các thành phần gel và đệm hầu nhưkhông thay đổi theo các phương pháp điện di thông thường Tuy nhiên theophương pháp thông thường thì sự điện di liên quan đến sự di động của cácmảnh ADN có kích thước khác nhau trên gel agarose trong một trường điệnkhông đổi Kết quả ở đây là phân tử lớn khó di động hơn phân tử nhỏ qua mắtxích agarose, tạo ra sự tách biệt trong trường điện di Trong trường hợp PFGElực làm thay đổi khả năng di động lại là trường điện tích thay đổi liên tục dẫnđến các mảnh ADN có kích thước khác nhau thay đổi hướng di động Nhưvậy kết quả là các mảnh có kích thước khác nhau sẽ có khả năng di động khácnhau Kích thước càng lớn thì mức độ di động càng chậm Sự di động khácnhau của ADN chủ yếu phụ thuộc vào kích thước chứ không phải do gelagarose như ở phương pháp điện di thông thường [22,24]

Điểm hạn chế của phương pháp này là thời gian thực hiện kéo dài 2 - 3ngày, đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng đápứng được Phương pháp điện di trường xung chỉ giới hạn ở nghiên cứu dịch tễchứ không thể cung cấp thông tin về cấu trúc di truyền của quần thể vi khuẩnnày [24]

Trong một nghiên cứu trên 158 chủng Salmonella typhi phân lập từ các

đợt dịch và các ca riêng rẻ bằng PFGE cho thấy các chủng phân lập riêng rẻ

có độ đa dạng về kiểu điện di trường xung cao hơn các chủng phân lập từ các

đợt dịch Trong 18 chủng Salmonella typhi phân lập riêng rẻ thu được đến 13

kiểu điện di trường xung, mẫu phân lập từ các đợt dịch chỉ thu được rất ít kiểuđiện di trường xung Kết quả này cho thấy PFGE là phương pháp phù hợp để

phân biệt Salmonella typhi trong nghiên cứu về dịch tễ [22].

* Phương pháp MLPA ( Multiplex ligation – Dependent probe amplification)

MLPA là một phương pháp dựa vào PCR giúp phát hiện đồng thời cáckhác biệt trên trình tự DNA hay RNA

Nguyên tắc của phương pháp MLPA là sử dụng các các mẫu dò đểnhận biết các trình tự mục tiêu Mỗi mẫu dò là hai đoạn oligonucleotide có thểnối lại với nhau khi chúng gắn hoàn toàn vào trình tự đích Tất cả các mẫu dòđều có trình tự giống nhau ở đầu 5’và đầu 3’ để sau khi nối lại chúng có thểđược khuếch đại đồng thời trong một phản ứng PCR duy nhất sử dụng chỉmột cặp mồi Với MLPA không phải DNA mục tiêu được khuếch đại mà cácmẫu dò nhận biết trình tự đích được khuếch đại Chỉ những mẫu dò nào gắnđược vào trình tự đích mới được nối lại và sau đó được khuếch đại bằng PCR.Mỗi mẫu dò được gắn với một trình tự có chiều dài khác nhau giúp cho cácsản phẩm khuếch đại sẽ có một chiều dài duy nhất và đặc trưng cho trình tựđích Sau khi điện di, các sản phẩm khuếch đại được phân tích và các đoạnDNA mất đi hoặc được thêm vào sẽ dễ dàng xác định được [24]

Phương pháp MLPA có ưu điểm là rất nhanh, rẻ, tính lặp lại rất cao,

độ phân biệt tốt, rõ ràng và rất dễ dàng thực hiện Thiết bị thực hiện phản ứngMLPA có ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử là một máy chạyPCR và một thiết bị điện di mao quản hoặc điện di thông thường Phươngpháp MLPA có thể phân biệt được đến 45 trình tự đích cùng lúc trong mộtphản ứng duy nhất [24]