phát hiện nhanh Salmonella typhi
4.2.1 Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi Salmonella typhi
Mẫu DNA tổng số của chủng YD1 được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tối ưu phản ứng PCR. Mẫu DNA được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và cách nhau 10 lần sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi BS1 và BS2 . Kết quả điện di sản phẩm PCR ở các nồng độ pha loãng khác nhau được thể hiện trong hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các nồng độ khuôn DNA khác nhau.
Đường chạy M: DNA Maker 1kb ( Fermantas); Đường chạy 1: Mẫu âm tính; Đường chạy 2,3 4, 5: Tương ứng là DNA ở các nồng độ là 1,15ng/µl.10-1;
1,15ng/µl.10-2; 1,15ng/µl.10-3; 1,15ng/µl.10-4; 1,15ng/µl.10-5.
Từ hình ảnh điện di trong hình 4.3 được tóm tắt kết quả PCR trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR
Nồng độ DNA khuôn
(ng/ul)
1,15. 1,0 1,15. 10-1 1,15. 10-2 1,15.10-3 1,15.10-4 1,15.10-5
Kết quả PCR + + + + − −
Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR cho thấy khi nồng độ DNA khuôn giảm thì cường độ băng DNA càng giảm. Khi nồng độ DNA khuôn giảm đến 1,15. 10-4 ng/µl thì sản phẩm PCR không xuất hiện trên hình ảnh điện di. Điều đó chứng tỏ nồng độ DNA khuôn ở mức 1,15.10-4
ng/µl quá thấp không cho phép hình thành sản phẩm PCR có thể nhận thấy được bằng mắt thường trên bản điện di. Kết quả thí nghiệm có thể khẳng định nồng độ DNA khuôn tối thiểu cho phản ứng PCR là 1,15.10-3 ng/µl.
Theo các công bố đã nghiên cứu về nồng độ DNA khuôn tối thiểu cho phản ứng PCR như nghiên cứu của Mousavi S. L và cs (2006) [26] trong việc phát hiện Salmonella typhi thì nồng độ khuôn DNA tối thiểu là 2,5.10-3 ng/µl, của Kumar S. và cs ( 2005) [25] có nồng độ DNA khuôn tối thiểu là 3.10- 3ng/µl. Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đương với kết quả của Mousavi S. L và Kumar S.
Do đó để tối ưu các điều kiện cho phản ứng PCR phát hiện nhanh
Salmonella typhi chúng tôi lựa chọn nồng độ DNA khuôn tương đương là
1,15. 10-2ng/µl trong mỗi phản ứng 25µl được sử dụng để tối ưu các điều kiện cho phản ứng PCR.
