typhi bằng phương pháp tách chiết hóa chất và phương pháp sốc nhiệt 3.4.4. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi
3.5.1.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi bằng phương pháp sử dụng hóa chất [11, 22, 23]
- Nuôi tăng sinh: Sau khi mẫu thí nghiệm được cung cấp ta tiến hành nuôi tăng sinh Salmonella typhi: Cân 3,7g Scharlau cho vào bình tam giác có chứa 100ml nước cất. Đun trong lò vi sóng trong 1- 2 phút cho đến khi môi trường tan hoàn toàn, chia 100ml dung dịch trên vào 2 bình tam giác và hấp khử trùng. Sau khi hấp khử trùng ta tiến hành cấy Salmonella typhi, hút 200µl mẫu cho vào mỗi bình, nuôi tăng sinh trong 37oC trong 48 giờ để thu sinh khối phục vụ tách chiết DNA.
- Hút mẫu từ dung dịch nuôi tăng sinh cho vào ống effendoff, tiến hành ly tâm 10.000v/p trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa tan mẫu trong dung dịch CTAB extraction buffer, vontex cho mẫu tan đều trong dung dịch.
- Ủ ở 60oC trong vòng 1 giờ, cứ 10 phút lại lấy ra vontex nhẹ rồi spindow.
- Sau đó bổ sung CIAA, đảo trộn đều bằng cách búng nhẹ ống effendoft, vontex trong 30 giây. Ly tâm 10.000v/p trong 10 phút.
- Sau khi ly tâm ống effendoft chia làm ba lớp: Lớp trên là dung dịch chứa DNA hòa tan, lớp giữa là cặn xác tế bào, lớp dưới cùng là dung dịch có chứa chloroform.
- Chuyển lớp trên cùng sang ống effendoft mới, sau đó bổ sung CH3COOH và Isopropanol. Dùng pipet đảo trộn đều khối dung dịch, spindown nhẹ để khối dung dịch lắng xuống đáy ống.
- Đặt ống eppendoft chứa mẫu vào tủ - 20oC trong 2 giờ - Ly tâm 10.000v/p trong 30 phút. Loại bỏ dịch nổi.
- Rủa tủa bằng cồn 70o, vontex nhẹ, ly tâm 13000v/p trong 5 phút. - Để khô tự nhiên.
- Hòa tan tủa bằng TE 1X.
3.5.1.2. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi bằng phương pháp xử lý sốc nhiệt [5]
- Ly tâm canh khuẩn với tốc độ 10.000v/p trong 5 phút, thu cặn.
- Hòa nguyên cặn trong nước cất vô trùng ( không chứa Dnase hoặc RNase).
- Hỗn hợp được đưa vào trong tủ sấy ở nhiệt độ 95oC trong 10 phút nhằm làm sốc nhiệt để trích ly DNA.
- Đem vontex và spindow mạnh, cần tiến hành nhanh.
- Sau đó hỗn hợp được làm lạnh nhanh bằng cách cho vào tủ đông ở nhiệt độ -20oC trong vòng 10 phút.
- Lặp lại các bước trên ba lần. Cuối cùng ta thu được phần dung dịch còn lại có chứa DNA
Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình cơ bản. Các thành phần của phản ứng PCR 25 µl bao gồm: Bảng 3.3 : Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nước cất khử ion. 14,3 DNA khuôn. 2 Buffer 10X 2,5 MgCl2 (25mM) 1,5
Taq DNA polymerase ( 5U/µl) 0,2
dNTP 10mM (2,5mM) 1,5
Primer BS1 (10mM) 1,5
Primer BS2 (10mM) 1,5
Tổng thể tích 25
Điều kiện chu trình nhiệt được thiết lập trên máy chu trình nhiệt bao gồm: -Biến tính ban đầu ở 95oC: 5 phút
- Biến tính ở 95oC: 30 giây
- Gắn mồi ở 55oC: 30 giây 35 chu kỳ - Kéo dài mồi ở 72oC: 45giây
- Kéo dài cuối cùng ở 72oC: 5 phút - Ủ bảo quản mẫu ở 4oC: ∞
3.5.3. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện của phản ứng PCR [ 5]
- DNA của Salmonella typhi được tách chiết và được pha loãng thành các nồng độ cách nhau 10 lần rồi được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Giới hạn phát hiện của phản ứng PCR được xác định là nồng độ DNA tối thiểu cho phép phản ứng PCR khuếch đại tạo ra sản phẩm điện di có thể quan sát được bằng mắt thường trên gel agarose.
- Cách tiến hành:
+ Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên hút xuống rồi vontex, spindow 2 lần, đem ủ ở nhiệt độ 70oC trong vòng 5 – 10 phút rồi lại vontex và spindown. Ta có được độ pha loãng 1/10 hay 10 -1.
+ Tiếp tục hút 5ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm chứa 45ml nước cất vô trùng thứ 2.
+ Trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 1/100 hay 10-2.
+ Tiếp tục như vậy từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, từ ống nghiệm 3 sang ống nghiệm 4 ta sẽ có các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4,….
+ Sử dụng các nồng độ pha loãng khác nhau làm khuôn cho phản ứng PCR.
3.5.4. Phương pháp xác định độ đặc hiệu của phản ứng PCR [ 13]
Độ đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi được xác định bằng kết quả thử nghiệm với các chủng Salmonella typhi và các chủng vi khuẩn kiểm định như Escherichia coli, Colifroms, Listeria
monocyntogenes,Clostridium pefringens, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus và Bacillus cereus.
3.5.5. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
* Chuẩn bị gel agarose 1,5%:
- Cân 1,5 gam agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X , cho vào bình tam giác chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng cho agarose tan hết.
- Chờ gel nguội đến 60oC, lắc đều dung dịch rồi đổ vào khung đổ bản gel. Đổ gel ngập không cao quá một nửa chiều cao của thành khung đổ bản gel.
- Cắm lược cân đối và để nguội tự nhiên cho đến khi gel khô thích hợp để cho điện di. Khi gel khô thì nhẹ nhàng rút lược ra tránh làm vỡ giếng điện di.
- Chạy điện di trên thiết bị điện di:
+ Đổ khoảng 150ml TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập bản gel, đặt bản gel vào bể diện di có đầu giếng nằm về phía cựa âm của điện trường, bản gel đặt ngay ngắn.
+ Dùng micropipette hút 15µl mẫu DNA vừa tách chiết trộn với 2µl Dye trên đĩa peptri sạch. Sau đó dùng pipep hút hỗn hợp tra vào giếng điện di.
+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút. Quan sát sự di chuyển của DNA từ cực âm sang cực dương.
- Hiện thị kết quả điện di: ngâm bản gel 5 – 10 phút trong dung dịch ethidium bromide sau đó hiển thị kết quả diện di trên máy soi gel.
- Phân tích kết quả điện di.
+ Kết quả âm tính được xác định bằng sự không có mặt của băng DNA trên bản điện di.
+ Kết quả âm tính được xác đinh bằng sự có mặt của băng DNA sáng, rõ, đúng kích thước trên bản điện di.
Phần 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Tách chiết DNA tổng số của Salmonella typhi
4.1.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA bằng phương pháp sử dụng hóa chất pháp sử dụng hóa chất
Vi khuẩn Salmonella typhi được nuôi tăng sinh ở 37oC trong 48 giờ sau đó ly tâm 10.000 v/p trong 5 phút để thu sinh khối, DNA tổng số của 4 chủng Salmonella typhi ký hiệu là YD1, YD2, NL1, NL2 được tách chiết bằng phương pháp sử dụng hóa chất (phương pháp CTAB). Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số được thể hiện trong hình 4.1.
Hình 4.1: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA
Đường chạy 1: Mẫu YD1;Đường chạy 2: Mẫu YD2 Đường chạy 3:Mẫu NL1;Đường chạy 4: Mẫu NL2.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số ở hình 4.1 cho thấy, các bằng đều xuất hiện tương ứng ở cả 4 đường chạy, băng hiện rõ nét, gọn, không bị đứt gãy, các băng nằm gần với vị trí của giếng điện di
chứng tỏ đây là băng DNA tổng số. Tuy nhiên vẫn có sự xuất hiện của các băng mờ phía cuối các đường chạy là sản phẩm RNA lẫn tạp trong mẫu phân tích. Các băng DNA tổng số không bị đứt gãy nên đủ điều kiện thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.2. Xác định nồng độ DNA tách chiết
Để khảo sát nồng độ DNA là ngưỡng phát hiện cho phản ứng PCR, DNA vi khuẩn Salmonella typhi được tách chiết bằng phương pháp hóa chất. Nồng độ DNA hệ gen tách chiết được xác định bằng phương pháp đo giá trị OD ( Optical density) ở bước sóng 260nm và 280nm. Cứ 1 đơn vị OD ở bước sóng 260nm tương đương với hàm lượng DNA mạch kép trong dung dịch là 50µg DNA/ml và tỷ lệ OD260 / OD280 = 1,8 - 2 là đảm bảo đủ độ tinh sạch cho nghiên cứu [5]. Kết quả xác định tỷ số OD260, OD280 và nồng độ DNA tổng số của 4 chủng nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Giá trị đo OD ở 260nm và 280nm Chủng Giá trị OD Tỷ lệ OD260/OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) OD260 OD280 YD1 0.023 0.012 1,91 11,5 YD2 0,027 0,015 1,8 13,5 NL1 0,017 0,009 1,89 8,5 NL2 0,029 0,016 1,82 14,5
Kết quả xác định các giá trị OD260 và OD280 cho thấy tỷ số OD260/OD280
đều nằm trong khoảng 1.8 – 2 chứng tỏ sản phẩm tách chiết DNA tổng số của cả 4 chủng Salmonella typhi trong nghiên cứu đều đủ độ tinh sạch cho các nghiên cứu về sinh học phân tử. Từ kết quả OD260/OD280 theo công thức tính nồng độ DNA là [DNA] = OD260 × 50 × X (ng/l) thì suy ra nồng độ DNA tổng số của các chủng YD1, YD2, NL1, NL2 lần lượt là 11,5 ng/µl; 13,5ng/µl; 8,5ng/µl và 14,5ng/µl.
Để kiểm tra khả năng sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR, 4 mẫu DNA tổng số của 4 chủng Salmonella typhi sau khi được tách chiết được pha loãng để hạn chế sản phẩm phụ phục vụ cho mục đích khuếch đại vùng gen
rfbE đặc hiệu của vi khuẩn Salmonella typhi sử dụng với cặp mồi BS1 -
BS2. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%, kết quả điện di được thể hiện trong hình 4.2.
Hình 4.2: Kết quả khuếch đại vùng gen đặc hiệu của Salmonella typhi bằng phản ứng PCR sử dụng sản phẩm DNA tách chiết bằng hóa chất
Đường chạy M: Maker 1kb ( Fasmetas); Đường chạy số 1: đối chứng âm; Đường chạy số 2,3,4,5: mẫu DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella typhi
Kết quả điện di phản ứng PCR khuếch đại vùng gen đặc hiệu của
Salmonella typhi được thể hiện trên hình 4.2 cho thấy đoạn gen rfbE đã được
nhân lên có kích thước phù hợp với lý thuyết là 615bp. Ở tất cả các vị trí tương ứng với các đường chạy đều xuất hiện băng DNA khá rõ ràng, mỗi đường chạy chỉ xuất hiện một băng duy nhất, rõ nét chứng tỏ sản phẩm của phản ứng PCR được hình thành đặc hiệu. Do đó có thể kết luận các mẫu DNA tổng số đã tách chiết hoàn toàn phù hợp cho các thí nghiệm về xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR.
4.2. Xây dựng quy trình phát hiện Salmonella typhi bằng kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi
4.2.1 Xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi Salmonella typhi
Mẫu DNA tổng số của chủng YD1 được lựa chọn để tiến hành thí nghiệm tối ưu phản ứng PCR. Mẫu DNA được pha loãng ở các nồng độ khác nhau và cách nhau 10 lần sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi BS1 và BS2 . Kết quả điện di sản phẩm PCR ở các nồng độ pha loãng khác nhau được thể hiện trong hình 4.3.
Hình 4.3. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng các nồng độ khuôn DNA khác nhau.
Đường chạy M: DNA Maker 1kb ( Fermantas); Đường chạy 1: Mẫu âm tính; Đường chạy 2,3 4, 5: Tương ứng là DNA ở các nồng độ là 1,15ng/µl.10-1;
1,15ng/µl.10-2; 1,15ng/µl.10-3; 1,15ng/µl.10-4; 1,15ng/µl.10-5.
Từ hình ảnh điện di trong hình 4.3 được tóm tắt kết quả PCR trong bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR
Nồng độ DNA khuôn
(ng/ul)
1,15. 1,0 1,15. 10-1 1,15. 10-2 1,15.10-3 1,15.10-4 1,15.10-5
Kết quả PCR + + + + − −
Kết quả xác định nồng độ DNA tối thiểu của phản ứng PCR cho thấy khi nồng độ DNA khuôn giảm thì cường độ băng DNA càng giảm. Khi nồng độ DNA khuôn giảm đến 1,15. 10-4 ng/µl thì sản phẩm PCR không xuất hiện trên hình ảnh điện di. Điều đó chứng tỏ nồng độ DNA khuôn ở mức 1,15.10-4
ng/µl quá thấp không cho phép hình thành sản phẩm PCR có thể nhận thấy được bằng mắt thường trên bản điện di. Kết quả thí nghiệm có thể khẳng định nồng độ DNA khuôn tối thiểu cho phản ứng PCR là 1,15.10-3 ng/µl.
Theo các công bố đã nghiên cứu về nồng độ DNA khuôn tối thiểu cho phản ứng PCR như nghiên cứu của Mousavi S. L và cs (2006) [26] trong việc phát hiện Salmonella typhi thì nồng độ khuôn DNA tối thiểu là 2,5.10-3 ng/µl, của Kumar S. và cs ( 2005) [25] có nồng độ DNA khuôn tối thiểu là 3.10- 3ng/µl. Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đương với kết quả của Mousavi S. L và Kumar S.
Do đó để tối ưu các điều kiện cho phản ứng PCR phát hiện nhanh
Salmonella typhi chúng tôi lựa chọn nồng độ DNA khuôn tương đương là
1,15. 10-2ng/µl trong mỗi phản ứng 25µl được sử dụng để tối ưu các điều kiện cho phản ứng PCR.
4.2.2. Tối ưu phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi
Trong phản ứng PCR, hàm lượng MgCl2 và nhiệt độ gắn mồi ảnh hưởng đến khả năng khuếch đại của sản phẩm PCR, do đó những yếu tố này sẽ được thay đổi trong quy trình tối ưu phản ứng PCR để tìm ra điều kiện phù hợp nhất cho phản ứng PCR. Để tối ưu các điều kiện của phản ứng PCR phát
hiện nhanh Salmonella typhi các điều kiện về hàm lượng MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng PCR thay đổi từ 1,5 – 3,0 mM và nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng PCR được thay đổi từ 53oC, 55oC, 57oC. Sản phẩm của các phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR được thể hiện trong hình 4.4
Hình 4.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở nhiệt độ gắn mồi và nồng độ MgCl2 khác nhau
Đường chạy M: Maker 1kb ( Fermetas); Đường chạy 1, 5, 9: Mẫu đối chứng âm tính. Các đường chạy trên hình 4.4 được chú giải trong bảng sau:
Nồng độ MgCl2 (mM)
Nhiệt độ gắn mồi (oC)
53 55 57
1,5 Đường chạy số 2 Đường chạy số 6 Đường chạy số 10 2.25 Đường chạy số 3 Đường chạy số 7 Đường chạy số 11 3 Đường chạy số 4 Đường chạy số 8 Đường chạy số12 Kết quả điện di trên hình 4.4 cho thấy các đường chạy số 3, 4, 6, 7, 8, 11 và 12 hình thành sản phẩm PCR tương ứng với kích thước 615 bp phù hợp với kích thước sản phẩm PCR khuếch đại từ gen rfbE theo lý thuyết. Các đường chạy số 2 và 10 không hình thành sản phẩm PCR. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 55oC và hàm lượng MgCl2 là 2,25mM ( đường chạy số 7) cho hình ảnh PCR rõ nét nhất chứng tỏ phản ứng PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi phù hợp nhất khi sử dụng với hàm lượng MgCl2 2,25mM và nhiệt độ gắn mồi là 55oC.
Trong nghiên cứu này phản ứng PCR được lựa chọn với nồng độ DNA là 1,15.10-2 ng/µl. Lựa chọn này được giải thích như sau: Khi nồng độ DNA khuôn quá lớn sự sai khác trong hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các điều kiện khác nhau không có sự khác biệt lớn với nồng độ DNA càng nhỏ và nằm trong vùng cho phép hình thành sản phẩm PCR. Sự sai khác về các điều kiện của thành phần phản ứng PCR dễ dàng nhận biết được trên hình ảnh điện di. Do đó nồng độ DNA khuôn 1,15.10-2ng/µl được lựa chọ cho mục đích nghiên cứu này.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cả nhiệt độ và nồng độ MgCl2 đều ảnh hưởng đến kết quả PCR. Thực tế cho thấy để có một kết quả PCR tốt thì