2.3.3.1. Khái niệm PCR
PCR là quá tình nhân bản một trình tự DNA xác định từ một số lượng nhỏ ban đầu lên số lượng lớn hơn trong thời gian ngắn [12].
2.3.3.2. Nguyên lý của PCR
Phản ứng PCR cần có hai đoạn oligonucleotide, thường có chiều dài nằm trong khoảng 17- 30 nucleotide, nằm ở hai đầu của trình tự DNA đích cần khuyếch đại số lượng. Đoạn thứ nhất có trình tự giống với trình tự ở đầu 3’ của mạch đơn đối nghĩa được gọi là mồi xuôi. Đoạn thứ hai có trình tự giống với trình tự ở đầu 3’ của mạch đơn có nghĩa và được gọi là mồi ngược. Mồi xuôi sẽ bám vào đầu 5’ của mạch đơn có nghĩa theo nguyên lý liên kết bổ sung và kích hoạt phản ứng tổng hợp mạch đơn đối nghĩa. Tương tự mồi ngược sẽ bám vào đầu 5’ của mạch đơn đối nghĩa và kích hoạt phản ứng tổng hợp sợi có nghĩa mới. Phản ứng PCR được chia làm 3 giai đoạn với 3 nhiệt độ khác nhau. Chu kỳ biến tính – gắn mồi – kéo dài được lặp lại 20- 35 lần nhằm mục đích đạt được lượng sản phẩm mong muốn [11,12]. Ba giai đoạn của phản ứng PCR như sau.
+ Biến tính: Hai mạch đơn của phân tử DNA được tách đôi dưới tách động của nhiệt độ do DNA có thể biến tính – hồi tính theo chu kỳ tăng giảm nhiệt độ. Bước này thường được tiến hành ở 94oC
+ Gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp từ từ. Trong hỗn hợp phản ứng lúc này có mặt hỗn hợp 2 mạch đơn DNA vừa tách khỏi nhau và hai mồi. Mỗi đoạn mồi sẽ nhận biết và bám vào DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung. Cặp mồi được thiết kế ở đầu của trình tự đích và do đó sự tổng hợp DNA mới chỉ
xảy ra với đoạn DNA đích nằm giữa hai mồi. Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc vào độ dài và trình tự mồi, thông thường nằm trong khoảng 45- 60oC.
+ Kéo dài: Enzyme DNA Polymerase sẽ bám vào đầu 3’ OH tự do của các mồi bám trên sợi khuôn và sử dụng nguyên liệu là bốn loại dNTP để tổng hợp sợi DNA theo chiều 5’ – 3’. Thí nghiệm PCR đầu tiên sử dụng đoạn Klenow của DNA Polymerase I làm enzyme tổng hợp, tuy nhiên cứ sau mỗi một chu kỳ lại phải bổ sung enzyme mới vì enzyme cũ đã bị biến tính ở nhiệt độ cao ngay bước ban đầu. Sự bất tiện này được giải quyết bằng Taq DNA Polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus apuaticus. Taq polymerase bền vững với nhiệt, ở nhiệt độ 94oC enzyme này vẫn giữ nguyên khả năng hoạt động. Điều đó có nghĩa là enzyme này không cần bổ sung mới sau mỗi chu kỳ và do đó toàn bộ quá trình PCR có thể được thiết lập hoàn toàn tự động và diễn ra liên tục hơn. Hơn nữa nhiệt độ tối ưu để Taq polymarse bắt đầu tổng hợp là 72oC, nhiệt độ của bước kéo dài cao như vậy càng đảm bảo tính đặc hiệu của mồi.
2.3.3.3. Ưu và nhược điểm của PCR
* Ưu điểm
- Thời gian cho kết quả nhanh.
- Có thể nhận diện những sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi cấy tăng sinh có khi đơn giản hơn và nhiều khi là không cần thiết.
- Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện tại hiện trường.
- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm.
* Nhược điểm
- Sự ức chế của Taq polymerase bởi thành phần của mẫu vật, mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Việc tách chiết và tinh sạch DNA từ thực phẩm và môi trường trước khi thực hiện phản ứng PCR cho
phép loại bỏ những hợp chất ức chế. Tuy nhiên một vài quy trình phát hiện sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh sạch DNA.
- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh để có đủ mật độ cho phát hiện bằng PCR.
- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc.
- Đòi hỏi người thực hiện phải thành thạo về thao tác.
2.3.3.4. Ứng dụng của PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh
Bằng các khuếch đại đoạn nucleic acid đặc trưng của vi sinh vật gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm, thử nghiệm PCR có thể phát hiện vi sinh vật gây bệnh với độ nhạy cao mà không có một thử nghiệm nào trước đây có thể so sánh được. Vì chỉ cần 1 vi sinh vật gây bệnh có mặt trong mẫu thử là có hiện diện nucleic acid đích và được PCR khuếch đại. Chính những ưu điểm đó đã khiến PCR trở thành một công cụ hữu hiệu trong phân tích vi sinh vật và được nhiều nhà khoa học trên thế giới áp dụng để phát hiện ra các tác nhân gây bệnh như Cloak B. et al (2001) đã áp dụng PCR để phát hiện ra vi khuẩn
Campylobacter là nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm dạ dày. Berthier và
Ehrlich (1998) xét nghiệm PCR cho phép xác định Lactobacillus curvatus,
Lactobacillus graminis, Lactobacillus sake. Brooks et al. (1992) sử dụng PCR
để khuyếch đại trình tự rDNA đặc hiệu của Carnobacterium spp [19].
2.3.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR phát hiện nhanh Salmonella typhi
* Ngoài nước:
Về khía cạnh vệ sinh an toàn thực phẩm, Salmonella typhi là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm vì khả năng gây bệnh thương hàn cho người qua con đường thực phẩm. Có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện ra
nghiên cứu của các nhà khoa học tiến xa hơn. Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu như Radji M .(2010) đã nghiên cứu về quy tình phát hiện nhanh Salmonella typhi trong mẫu thực phẩm và đồ uống bằng PCR sử dụng đoạn mồi thích hợp được thiết kế dựa trên vùng gen đặc hiệu invA, đoạn
mồi này có kích thước là 244bp [31]. Abdul Hapue P. H. D. (1999) đã đưa ra các phương pháp phát hiện sớm bệnh thương hàn do vi khuẩn Salmonella
typhi gây nên như phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy trong môi trường
máu, thử nghiệm Widal. Nhà nghiên cứu đã có sự so sánh giữa các phương pháp và đưa ra kết luận là PCR có khả năng phát hiện là 71,95%, phương pháp nuôi cấy trong môi trường máu là 34,1% và thử nghiệm Widal là 36,5%. Luciana Ruschel dos Santos (2001) nghiên cứu quy trình phát hiện nhanh
Salmonella trong thịt gà [32]. Mục đích của nghiên cứu này là nhằm tìm ra
giới hạn phát hiện Salmonella, thời gian ủ bệnh ( 0h, 6h, 8h, 24h,48h trước khi làm giàu trong môi trường PBW 1%) và 3 phương pháp tách chiết DNA đó là Phenol- Chloroform, xử lý nhiệt, Sephaglass. Kết quả cho thấy giới hạn phát hiện vi khuẩn Salmonella là 10-9 CFU/ml, cho phép phát hiện trong vòng 48 giờ và sử dụng phương pháp tách chiết Phenol – Chloroform là tốt hơn cả. Chais Amarantini, Langkah Sembiring (2011) nghiên cứu định danh và đặc tính của Salmonella typhi dựa trên trình tự gen 16S rRNA. Pathmanathan S. G. và Castro N. C (2003) đã đưa ra phương pháp phát hiện nhanh chóng và đơn giản chủng Salmonella bởi PCR bằng các khyếch đại gen hilA [28].
*Trong nước
Tại Việt Nam kỹ thuật PCR đã được ứng dụng nhiều để phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm như TS Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Xuân Liên và cs nhằm phát hiện ra Salmonella spp trong thực phẩm bằng phương pháp PCR [13]. Nội dung của nghiên cứu này nhằm xác định giới hạn phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật PCR. Th.S Nguyễn Thị Nga (2005) khảo sát đột biến gen mã hoá cho kháng nguyên của chủng Salmonella
tỷ lệ chủng Salmonella typhi đột biến mất gen mã hoá cho kháng nguyên Vi tại 3 miền Bắc – Trung - Nam Việt nam từ 1995 đến 2005, đánh giá sự phân bố và mức độ đột biến theo từng năm và từng vùng miền, đánh giá yếu tố nguy cơ gây dịch sốt thương hàn do Salmonella typhi đột biến mất gen mã hoá cho kháng nguyên Vi tại Việt nam trước và sau khi sử dụng vacxin Typhi Vi.A. Nguyễn Tiến Dũng (2002) Phát hiện phân biệt Salmonella spp và
Salmonella enterica bằng phương pháp PCR và khảo sát tần số xuất hiện
Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn Salmonella typhi do Bộ môn Vi sinh thuộc Khoa Y học cơ sở, trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên, Viện CNSH & CNTP, Trường Đại học Bách Khoa HN, Trung tâm Y tế Dự phòng - Tỉnh Thái Nguyên, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên cung cấp.
Các chủng vi sinh vật kiểm định do: Viện khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên, Trung tâm Y tế Dự phòng - Tỉnh Thái Nguyên cung cấp.