Báo cáo thực tập Hóa Sinh

1ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN 2HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM 3LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY 4XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL, TRANG 17 PROTEIN TRONG MÁU 5XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU c.Kết quả: Ống nghiệm 1:Không có hiện tượng, màu dung dịch không đổi. Ống nghiệm 2: Dung dịch có màu xanh tím. d.Giải thích: Ninhydrin là chất oxy hóa  oxy hóa, acid amin CO2 , NH3,aldehyde ngắn hơn và Ninhydrin bị khử. Sau đó Ninhydrin bị khử lại tác dụng với NH3 vừa được tạo ra kết hợp với 1 phân tử Ninhydrin khác tạo sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím.

MỤC LỤC

1 ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN 02

3 LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY 18

4 XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,

PROTEIN TRONG MÁU

23

5 XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU 30

ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN

12 – Quả bóp cao su Cái 1

II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

1.THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrin

a.Nguyên tắc:

Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng vớiNinhydrin 0.2% sẽ cho màu xanh tím.

Protid t0

Dung dịch : Peptid + Dung dịch Ninhydrin 0,2% Xanh tím

Acide aminNinhydrin là một chất oxy hóa nên có thể tạo nên phản ứngkhử carboxyl oxy hóa của acide amin với H2O, để cuối cùng cho ra

CO2, NH3 và một aldehyd ngắn đi một carbon so với acide amingốc và Ninhydrin bị khử Sau đó, Ninhydrin bị khử, lại tác dụng lạivới NH3 vừa được phóng thích và kết hợp với một phần tửNinhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanhtím

Đây là phản ứng chung cho chác Protid va AA tự do Phảnứng này cho phéo nhận dạng tất cả các AA có nhóm NH2 va COOH

tự do Ngoại trừ Prolin và OH Prolin tác dụng với Ninhydrin chomàu vàng

Ninhydrin là chất oxy hóa  oxy hóa, acid amin CO2 ,

NH3,aldehyde ngắn hơn và Ninhydrin bị khử Sau đó Ninhydrin bị

khử lại tác dụng với NH3 vừa được tạo ra kết hợp với 1 phân tửNinhydrin khác tạo sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím.

2/ THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret ( Xác nhận các liên kết)

a/ Nguyên tắc:

Protein tác dụng với Cu++ trong môi trường kiềm tạo phứcchất màu tím hồng, phản ứng xảy ra do các liên kết peptid

Sở dĩ gọi phản ứng Biuret là do chất Biuret (có nhóm CO –

NH, giống như một liên kết peptid) cũng cho phản ứng tương tự,tạo phức hợp có màu giống như protein

b/ Tiến hành: Cho vào ống nghiệm:

Dung dịch Ống nghiệm 1 Ống nghiệm 2+ DD lòng trắng

trứng

1 ml

+ DD NaOH 40% 0,5 ml 0,5 ml

+ DD CuSO4 1% 3 giọt 3 giọt

Lắc đều,quan sát màu,nhận xét và giải thích:

3/ THÍ NGHIỆM 3: Phản ứng tủa Protein bởi nhiệt với môi

trường acid yếu 1/ Nguyên tắc:

Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trong

đó các tiểu phân protein tích điện cùng dấu và mang lớp áonước( hydrat hóa) Nhờ tích điện cùng dấu nên các tiểu phân

protein đẩy nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cáchnhau, vì vậy dung dịch keo potein bền vững.

Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein dochuyển động sẽ gặp nhau, dính vào nhau thành những hạt to vàkết tủa

a/ Làm mất điện tích của protein bằng cách:

Thêm chất điện giải như NaCl, (NH4)2SO4,

Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pH1 đăng điệncủa protein

Các tiểu phân protein khi đã mất đi điện tích chỉ còn lớp áonước thì dễ bị kết tủa nếu làm mất lớp áo nước thì protein sẽ kếttủa

b/ Làm mất lớp áo nước của protein, bằng cách:

Thêm chất khử nước vào môi trường chứa protein( ví dụ :alcohol, aceton, (NH4)2SO4 )

Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid haykiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng

Ống 3

Ống 4

Ống 5Lòng trắng trứng đã thẩm 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Acid acetic 1 % 2 giọt

Acid acetic 10 % 5 giọt 5 giọt

-Ống 2: Có tủ trắng đục vì khi cho 2 giọt A.acetic 1% vào sẽ tạo môi trường acid yếu  tiểu phân phân tử Protein mất điện tích,

PH môi trường đạt gần tới điểm đẵng điện PH1 Protein tủa

-Ống 3: Không có tủa, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 1% vào

 môi trường acid mạnh  nhiều H+  Protein bị khử nước Phân

tử Protein vẫn còn tích điện dương nên không tạo kết tủa

-Ống 4: Có tủa trắng đục, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 10%

và 2 giọt NaCl bão hòa vào sẽ tạo ra môi trường trung hòa về điện

Do đó sẽ tạo tủa

-Ống 5: Không có tủa, vì khi thêm 2 giọt dung dịch NaOH 10% vào sẽ tạo ra môi trường kiềm Nhóm NH3 được trung hòa Khiđun sôi điện tích âm của tiểu phân Protein vẫn còn Do đó sẽ

không tạo tủa

4/ THÍ NGHIỆM 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh và

không đun nóng

a/ Nguyên tắc:

Các acid vô cơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl, ) và các acid hữu

cơ (acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic) có tác dụng làm biến tính

và kết tủa đại đa số Protein

-Ống 1: Không có hiện tượng,dung dịch trong suốt.

-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục

+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic

-Ống 1: 2ml H2O + 1ml A.Sulfosalicylic

-Ống 2: 2ml Lòng trắng trứng + 1ml A.Sulfosalicylic (Lắc)Quan sát hiện tượng:

-Ống 1: Không hiện tượng, dung dịch trong

-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục,lớp dưới ngã mảu vàng

c/Giải thích:

Protein tạo tủa trong môi trường acid yếu tốt hơn môi trường acid mạnh.

5/ THÍ NGHIỆM 5: Tìm protein trong nước tiểu

a/ Nguyên tắc

Các acid vô cơ mạnh ( HNO3, H2SO4, HCl, ) và các acid hữu

cơ (acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic) có tác dụng làm biến tính

và kết tủa đại đa số Protein

b/ Tiến hành:

+ Acid vô cơ: HNO3

-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1 ml HNO3

-Ống 2: 2 ml nước tiểu (phòng thí nghiệm) + 1ml HNO3

Quan sát hiện tượng:

-Ống 1: Bình thường, không chứa Protein

-Ống 2: Có tách lớp, có chứa Protein

+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic 3%

-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1ml A.Sulfosalicylic 3%-Ống 2: 2ml nước tiểu (phòng thí nghiệm) + 1ml A.Sulfosalicylic 3%

Quan sát hiện tượng:

-Ống 1: Không có hiện tượng, không có chứa Protein -Ống 2: Có hiện tượng vẫn đục, có chứa Protein

BÀI 2

HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM

S.G.O.T (Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase) (AST)S.G.P.T (Serum Glutamic Pyruvic Transaminase) (ALT)

Được tổng hợp từ gan và tim, thuộc nhóm phân hóa tố chuyển nhóm amin.

Xét nghiệm GOT và GPT giúp ta chẩn đoán, theo dõi các bệnh về gan, tim

Phương pháp ENZYMMATIC ( U.V Test)

1 Nguyên tắc:

GOT xảy ra theo phản ứng sau đây:

α cetoglutarate + L Aspartate GOT L.Glutamate +

Oxaloacetac

Oxaloacetac + NaDH + H+ MDH L Malate + NAD+

GPT xảy ra theo phản ứng sau đây:

α cetoglutarate + L Alanin GPT L Glutamate +Pyruvate

Pyruvate + NaDH + H+ MDH L Lactate + NAD+

2 Mẫu thử: (Kim Cương)

Huyết thanh hay huyết tương( kháng đông Heparine)

3 Thuốc thử:

Dạng KIT pha sẵn, gồm các hóa chất sau đây:

3.1 Buffer / Substrate (Reagent 1)

Tris buffer pH 7.5

L Aspartate ( GOT) hoặc L Alanin ( GPT)

3.2 Enzym / Coenzym (Reagent 2)

α Oxoglutarate

4 Tiến hành:

Reagent 1 500 l

Reagent 2 100 l

Sample 50 l

Trộn đều – Cho vào máy đo

- Chọn Test  Chọn AST/ALT  Chọn water blank ( Đo nước cất)

 Chọn Sample (Đo mẫu)

Đọc kết quả: GOT (AST) : 7 UI /lit

GPT (ALT) : 4UI /lit

 Chỉ số nằm trong giới hạn bình thường

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘNG AMYLAZ TRONG NƯỚC TIỂU (PP WHOLGEMUTH):

1/ Nguyên tắc:

Dùng phương pháp pha loãng dần nước tiểu để tìm lượng enzymtối thiểu phân hủy hết 2 ml dd hồ tinh bột 1% ở 370C trong 30phút

Kiểm soát độ phân hủy của hồ tinh bột bằng iode Tính hoạt độcủa Amylaz theo đơn vị Wholgemuth

Định nghĩa 1 đơn vị Wholgemuth: là lượng Amylaz có khả năngthủy phân 1 ml dd hồ tinh bột 1% ở nhiệt đô 370C trong 30 phút

3/ Tiến hành:

Lấy 8 ống nghiệm đánh số từ 1 -8

Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dd NaCl 9%

Cho vào ống 1: 1 ml nước tiểu Tráng ống hút bằng cách hút lênhút xuống 1-2 lần Trộn đều

Hút 1 ml của ống 1 cho sang ống 2 Cũng tráng và trộn như ốngtrên

Hút 1 ml ống 2 sang ống 3 Tiếp tục như vậy đến ống 7 Đến ống

7 hút ra 1 ml bỏ đi Như vậy nước tiểu ở các ông theo thứ tự đãđược pha loãng theo tỉ lệ:

1ml của ống 2

1ml của ống 3

1ml của ống 4

1ml của ống 5

1ml của ống 6

Tỉ lệ 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Lấy

ra 1ml bỏ-Thêm nhanh vào mỗi ống đúng 2 ml hồ tinh bọt 1%, lắc đều Đểcách thủy 370C trong 30 phút

-Lấy ra cho nhanh vào mỗi ống 2-3 giọt dd iode N/50 Lắc đều

-Từ ống 1 đên ống 5 không có màu, Ống 6 có màu xanh nhạt,ống 7 màu xanh, ống 8 có màu xanh đậm nhất.

-Chọn Ống 5 là ống trung gian để biểu diễn kết quả Hay 1/32ml nước tiểu sẽ có khả năng thủy phân 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%

-Vậy 1ml nước tiểu sẽ thủy phân 32 x 2 = 64 ml hồ tinh bột

 Hoạt động Amylaze theo đơn vị Wohlgemuth là 64

sau khi xuất hiện nhũng triệu chứng đầu và trở lại bình thường sau2- 3 ngày Vì trị số Amylaz trong nước tiểu rất hay thay đổi , nênnếu chỉ định lượng trong mẫu nước tiểu thì kết quả sẽ ít chính xáchơn khi kết hợp với Amylaz huyết thanh.

Trường hợp có suy thận, định lượng Amylaz ( huyết thanh và nướctiểu) đều không có giá trị chuẩn đoán

Amylaz giảm chỉ có ý nghĩa rất ít

Nhũ tương dầu trong nước là một nhũ tương không bền, khicho thêm một chất nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật,protein, sẽ được nhũ tương bền.

Thủy phân chất béo trong môi trường kiềm mạnh như: NaOH,KOH, đun nóng cho xà phòng và glycerol ( gọi là sự xà phòng hóa)

Lipid đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia cấu tạo các

mô động vật, cung cấp năng lượng cho cơ thể

Lipid thức ăn đưa vào cơ thể ( chủ yếu là Triglycerid) nhờcác men tiêu hóa: Lipaz và các men khác được thủy phân để tạothành những chất: acid béo, glycerol, sphingozin, cholesterol cùngmột số sản phẩm thủy phân không hoàn thành như mono vàdiglycerid Những sản phẩm trên lại được tổng hợp lại thành Lipidtại tế bào ruột vào hệ tuần hoàn, phần lớn đi theo đường bạchhuyết dưới dạng kết hợp Lipoprotein – chất này ở máu, dưới tácdụng của men Lipoprotein lipaz lại được phân hủy thành các sảnphẩm glycerol, acid béo,…… Acid béo được thoái hóa theo con

đường β oxy hóa tạo thành những mẫu acetyl coenzym A Quá

trình này xảy ra chủ yếu ở gan Một phần acetyl coenzyme A vàochu trình Krebs tạo thành CO2 và H2O Trong điều kiện rối loạnchuyển hóa, acetyl coenzym A cũng có thể tích tụ lại đẻ tạo thành

những sản phẩm acid aceto acetic, acid β hydroxyl butyric và

eceton; 3 chất này có tên chung là Cetonic ( thể Ceton) Sự giatăng của các chất Ceton trong máu gây hiện tượng nhiễm acidđồng thời kéo theo sự bài xuất các chất này qua nước tiểu

B/ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:

Thí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tan

Thí nghiệm 3: Sự nhũ tương hóa

Thí nghiệm 4: Tìm thể ceton trong nước tiểu

Thí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tan

Cho vào 2 ống nhiệm:

Thí nghiệm 2: Sự nhũ tương hóa

Nhũ tương dầu/ nước là 1 nhũ tương không bền, khi cho thêm

1 chất làm nhũ tương bền hơn như: xà phòng, muối mật, protein,

Na2CO3, lecithin gọi là chất nhũ hóa

Ống 1 Ống 2 Ống 3Nước cất 10 ml 10 ml 10 ml

Dầu ăn 10% 1 giọt 1 giọt 1 giọt

-Ống 1 và ống 2: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau khi để yên cả

2 ống 1 và 2 đều đục nhưng ống 1 đục nhiều hơn ống 2

-Ống 3: đầu tiên hỗn hợp đục, sau khi để yên bị tách lớp

*Kết luận: Dầu ăn không tan trong nước, Na2CO3 là xà phòng là chất nhũ hóa và xà phòng có tác dụng nhũ hóa mạnh hơn Na2CO3.

Thí nghiệm 3: Tìm thể ceton trong nước tiểu

- Acid acetic kết tinh

- NH4OH đậm đắc

*Tiến hành:

Cho vào 2 ống nghiệm :

Ống 1 Ống 2Nước tiểu 20 giọt

Nước tiểu PTN 20 giọt

Acid acetic đâm đặc 2 giọt 2 giọt

Sodium nitroprussia

10%

2 giọt 2 giọt

NH4OH đậm đặc 1ml 1ml

450 ;nhỏ cẩn thận theo thành ống Quan sát sau vài phút.)

*Kết quả:

-Cả 2 ống đều có hiện tượng tách lớp

-Ống 1: Không có vòng tím ở mặt phân cách  trong mẫu không có ceton

-Ống 2: Có vòng tím xuất hiện ở mặt phân cách của 2 dung dịch  trong mẫu có ceton

*Giải thích:

Ống 2 có màu tím ở mặt phân cách do trong mẫu có ceton và ceton sẽ tạo phức có màu tím với Sodium nitroprussia 10% trong môi trường kiềm ( vai trò của NH4OH)

BÀI 4:

XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,

PROTEIN TRONG MÁU

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ:

Dụng cụ Số

lượngỐng nghiệm nhỏ 6 ống

Giá ống nghiệm 1 cái

NỘI DUNG TIẾN HÀNH:

+ Định lượng glucose trong máu

+ Đinh lượng cholesterol trong máu

+ Định lượng protein trong máu

A/ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU

-Glucose có nguồn gốc từ thức ăn hoặc được tân tạo từ các acidamin và các sản phẩm thoái hóa của Lipid do gan đảm nhiệm tổnghợp

-Mục đích của xét nghiệm Glucose giúp ta chẩn đoán và theo dõibệnh tiểu đường.

PeroxidasePhenol + 4 – aminoantipyrin Red quinone + 4 H2O

II/ Mẫu thử:

1/ Huyết thanh không tiêu huyết – Mới lấy

2/ Có thể dùng Huyết tương( lấy với kháng đông Heparin Fluoride).3/ Dịch não tủy

Ủ 10 phút sau đó đo và đọc kết quả

Kết quả của ống U 5.00 mmol/L

*Biện luận:

Lượng glucose của người bình thường là 4.2 – 6.4 mmol/L

Kết luận: Ống nghiệm U bình thường, chưa xuất hiện dấu hiệu

bệnh lý

Nếu trị số gia tăng thì nằm trong một số bệnh lý sau đây:

Tiểu đường tụy;

Rối loạn nội tiết trong trường hợp: Cường tuyến giáp

U tủy thượng thân

Cường tiền não thùy

Nếu trị số giảm thì nằm trong một số bệnh lý sau đây:

- Sơ gan; Thiểu năng gan

- Cường tuyến tụy ( ung thư tế bào β tụy tạng)

- Giảm kích thích tố làm tăng đường huyết

- Khả năng ngưỡng thận của Glucose máu là 1,7 – 1,8 g/L

B/ ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG MÁU

Cholesterol có nguồn gốc từ thức ăn và được tổng hợp ở gan

Quá trình chuyển hóa Cholesterol dẫn đến sự tạo thành một

số chất quan trọng nhứ các acid mật, muối mật, vitamin D và cáckích thích tố nhóm Steriod

Xét nghiệm Cholesterol giúp ta theo dõi và chẩn đoán một sốbệnh về tim mạch, gan và thận

**PHƯƠNG PHÁP ENZYMATIC AND POINT 1/ NGUYÊN TẮC:

Cholesterol ester + H2O Cho Esterase

Cholesterol + Acid béo

Cholesterol + O2 Cho Oxidase Cholesterol-3 – one + H2O2

2H2O2 + Phenol + 4-aminoantipyrin Peroxidase

quinoneimin + 4H2O

2/ THUỐC THỬ:

Dạng KIT pha sẵn bao gồm:

a/ Reagent ( bền 6 tuần ở 20C - 80C, 2 tuần ở 150C - 250C)

*Trị số mẫu U tăng so với chỉ số bình thường (Trị sô bình thường là

140 – 250 mg/dl) Vậy có thể mắc một trong số các bệnh lý sau:+Tiểu đường tụy

+Rối loạn nội tiết trong các trường hợp :

-Cường tuyến giáp

-U tủy thượng thận

-Cường tiền não thùy

**ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TRONG MÁU XÉT NGHIỆM PROTEIN TRONG MÁU

Protein có nguồn gốc ngoại sinh là từ thức ăn và nguồn gốcnội sinh là từ gan và hệ thống nội mạc võng mô

Trong cơ thể Protein giữ 4 nhiệm vụ chính là nhiệm vụ:

Dinh dưỡng – Chuyên chở - Đặc biệt – Sinh lý

Xét nghiệm Protein toal và tỉ số A/G giúp ta trong việc chẩnđoán và theo dõi các trường hợp mất nước, các bệnh về gan và

I/ Nguyên tắc:

Là phương pháp đo điểm cuối

Là phép đo mật độ quang (DA) của dung dịch chất thử màtrong quá trình thực hiện phản ứng xảy ra hoàn toàn sau một thờigian nhất định Tại thời điểm đó phản ứng kết thúc và tạo ra phứchợp màu đặc trưng và bền vững

Một số nguyên nhân làm thay đổi trị số protein:

Tăng trong : HC mất nuốc liên tục ( nôn, tiêu chảy)

Sốt kéo dàiBệnh u tủyGiảm trong: Suy dinh dưỡng

Xơ gan, viêm gan

Thận nhiễm mỡMất máu

Tăng nhu cầu protein ( thai nghén, cho con bú)

**ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN I/ Nguyên tắc:

BÀI 5

XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU

Nước tiểu là một dịch bải tiết quan trọng của cơ thể, có nhiệm

vụ đào thải những chất độc, những cặn bã trong quá trình chuyểnhoá các chất của cơ thể ra ngoài

Sự thay đổi tính chất lý hoá vả những thảnh phần hoá học cúanước tiều phản ảnh rõ sự rối loạn chuyển hoá các chất và các hoạt

động của các cơ quan nội tạng như GAN - THẬN.

Xét nghiệm nước tiếu giúp ta chẩn đoán và theo dõi các bệnhcúa GAN — THẬN - TUYẾN NỘI TIÉT, các trưởng hợp nhícm trùng,thai nghén

Lượng nước tiểu bài tiết ra ngoài tuỳ thuộc vào yếu tố:

• Huyết (nước tiểu nhiều, nước tiều ít)

(Thay đổi theo khí hậu, hoạt động và ăn uống).

1.2 Trị số tăng trong bệnh tiểu đường, đái tháo nhạt (do di truyền)

1.3 Trị số giảm trong tiêu chảy ói mửa, mất máu, sốt xuấthuyết, viêm thận do

ngộ độc cấp Hg, suy tim nặng

2 MÀU SẮC

2.1 Bình thường có màu vàng nhọt (vàng rơm hay vàng chanh).2.2 Bệnh lý:

• Màu đỏ trong tiểu máu, tiểu ra Hb, sạn

• Vàng đậm trong viêm gan, vàng da tắc mật

• Đỏ nước rửa thịt trong viêm cầu thận cấp

• Trắng đục, lợn cợn trong nhiễm trùng tiểu

• Trắng sữa đo tiểu ra dưỡng chấp

3 pH NƯỚC TIỂU

3.1 Bình thường 4.7 đến 8 (Trung bình 6)

Thay đổí theo chế độ ăn: nhiều thịt acid

nhiều rau kiềm

3.2 Bệnh lý:

• pH acid trong bệnh tiểu đường nặng vì có nhiều Ketone

• pH kiềm trong nhiễm trùng tiểu, viêm bàng quang

4 TỈ TRỌNG

4.1 Bình thường 1.003 đến 1.030

(Thay đổi tùy thuộc vào chất hoà tan)

4.2 Tăng trong bệnh tiểu dường hoặc các trường hợp mất nước