BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU CỦ GỪNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU CỦ GỪNG Họ tên sinh viên: ĐỖ THỊ HỒNG ĐÀO Ngành: Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm dinh dưỡng người Niên khóa: 2006 – 2010 Tháng 8/2010 BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU CỦ GỪNG Tác giả ĐỖ THỊ HỒNG ĐÀO Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm Dinh dưỡng người Giáo viên hướng dẫn: TS Phan Thế Đồng Tháng 8/2010 i LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, thành kính khắc ghi cơng ơn Ba Má sinh thành, dưỡng dục, quan tâm, lo lắng, chăm sóc, động viên, dõi theo bước từ lúc bé thơ đến lúc trưởng thành Xin cảm ơn ba mẹ, chị, anh ủng hộ, động viên giúp đỡ Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm hết lòng dạy dỗ, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện cho em hồn tất chương trình học trường Và đặc biệt, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến thầy Phan Thế Đồng, người tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức quý báu, quan tâm, lo lắng cho tơi q trình thực đến hoàn thành luận văn Chân thành cám ơn thầy phòng thí nghiệm Hóa Sinh, phòng thí nghiệm Vi Sinh, phòng Kĩ Thuật Thực Phẩm, khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Nông Lâm, Thủ Đức, Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến bạn sinh viên lớp DH06DD, DH06BQ DH06VT Các bạn nguồn động viên, giúp đỡ chia sẻ buồn vui trình học tập thực đề tài Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Sinh viên Đỗ Thị Hồng Đào ii TÓM TẮT Đề tài: “Bước đầu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng” thực phòng thí nghiệm Hóa Sinh phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, thời gian từ 19/4/2010 đến 20/7/2010 với mục đích đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng vài chủng vi sinh vật gây bệnh Nguyên liệu sử dụng trình nghiên cứu củ gừng ta trồng Tiền Giang Đầu tiên, tinh dầu củ gừng chiết xuất phương pháp chưng cất nước Sau đó, khả kháng khuẩn tinh dầu củ gừng đánh giá định tính theo phương pháp đặt đĩa giấy Cuối cùng, giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tinh dầu củ gừng đánh giá định lượng theo phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng Kết cho thấy, hàm lượng tinh dầu củ gừng 0,24 % tính nguyên liệu tươi Đối với tính kháng khuẩn, tinh dầu củ gừng ức chế chủng vi khuẩn: E coli, Klebsiella, Salmonella typhi, Shigella, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Streptococcus faecalis Giá trị MIC tinh dầu củ gừng chủng vi khuẩn Gram âm thay đổi từ 6,25 mg/ml đến 50 mg/ml chủng vi khuẩn Gram dương 6,25 mg/ml (ngoại trừ Streptococcus faecalis không bị ức chế dãy nồng độ thí nghiệm) Tinh dầu củ gừng khơng có tác dụng chủng Pseudomonas aeruginosa iii MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược lịch sử phát triển tinh dầu 2.2 Giới thiệu chung tinh dầu 2.2.1 Khái niệm tinh dầu 2.2.2 Phân loại tinh dầu 2.2.2.1 Phân loại theo nguyên liệu chứa tinh dầu 2.2.2.2 Phân loại theo thành phần chứa tinh dầu 2.2.3 Tính chất thành phần tinh dầu 2.2.3.1 Tính chất 2.2.3.2 Thành phần 2.2.4 Công dụng tinh dầu 2.2.5 Bảo quản tinh dầu 2.2.6 Bảo quản nguyên liệu chứa tinh dầu 2.2.7 Vai trò tinh dầu đời sống thực vật 2.2.7.1 Vai trò dẫn dụ 2.2.7.2 Vai trò bảo vệ 2.2.7.3 Vai trò hỗ trợ phát triển 2.2.7.4 Vai trò dung mơi hữu 2.2.7.5 Hoạt tính kháng sinh 2.3 Đại cương gừng 2.3.1 Đặc điểm thực vật 2.3.2 Phân loại 2.3.3 Phân bố iv 2.3.4 Thu hoạch sơ chế 10 2.3.5 Công dụng 10 2.4 Giới thiệu tinh dầu củ gừng 10 2.4.1 Thành phần hóa học củ gừng 10 2.4.2 Tinh dầu gừng 11 2.4.3 Sản xuất tinh dầu 12 2.4.3.1 Sơ lược phương pháp sản xuất tinh dầu 12 2.4.3.2 Phương pháp chưng cất nước 12 2.5 Tính kháng khuẩn tinh dầu 13 2.5.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 13 2.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 14 2.5.2.1 Phương pháp định tính 14 2.5.2.2 Phương pháp định lượng 15 2.6 Sơ lược chủng vi khuẩn dùng nghiên cứu 17 2.6.1 Bacillus cereus 17 2.6.2 Escherichia coli 17 2.6.3 Klebsiella 18 2.6.4 Listeria monocytogenes 18 2.6.5 Pseudomonas aeruginosa 19 2.6.6 Salmonella 19 2.6.7 Shigella 20 2.6.8 Staphylococcus aureus 20 2.6.9 Streptococcus faecalis 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm 22 3.2 Nguyên liệu thiết bị sử dụng 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Xử lý nguyên liệu 23 3.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng nước nguyên liệu 23 3.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu 23 3.3.4 Phương pháp thử nghiệm tính kháng khuẩn 25 v 3.3.4.1 Vi sinh vật thử nghiệm 25 3.3.4.2 Chuẩn bị thử nghiệm 25 3.3.4.3 Phương pháp định tính 26 3.3.4.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC – Minimum Inhibitory Concentration) 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết xác định hàm lượng nước nguyên liệu 30 4.2 Kết xác định hàm lượng tinh dầu 30 4.3 Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng 30 4.4 Kết xác định giá trị MIC tinh dầu củ gừng 34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 38 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1: Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng nguyên chất vi khuẩn gram âm .31 Bảng 4.2: Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng nguyên chất vi khuẩn gram dương .31 Bảng 4.3: Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn dung dịch tinh dầu củ gừng 5% vi khuẩn gram âm .32 Bảng 4.4: Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn dung dịch tinh dầu củ gừng 5% vi khuẩn gram dương 33 Bảng 4.5: Kết xác định giá trị MIC tinh dầu củ gừng vi khuẩn gram âm 34 Bảng 4.6: Kết xác định giá trị MIC tinh dầu củ gừng vi khuẩn gram dương 35 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Củ gừng .11 Hình 2.2: Tinh dầu củ gừng 11 Hình 2.3: Tế bào tiết tinh dầu (màu vàng) thân rễ củ gừng .11 Hình 3.1: Mơ hình thử nghiệm định tính khả kháng khuẩn 26 Hình 3.2: Cách đo đường kính vòng vơ khuẩn 27 Hình 3.3: Mơ hình thử nghiệm tìm giá trị MIC 28 Hình 3.4: Cách đọc kết xác định giá trị MIC 29 viii Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Tinh dầu xem nguyên liệu nhiều ngành công nghiệp giới, đóng vai trò quan trọng đời sống người Tinh dầu nguyên liệu quan trọng ngành hương liệu mỹ phẩm, thực phẩm y dược Hơn nữa, ngành công nghiệp ngày phát triển nhu cầu tinh dầu ngày gia tăng Chính ly trích tinh dầu trở thành lĩnh vực quan trọng số quốc gia Tinh dầu có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật, phong phú đa dạng chủng loại, dễ phân hủy nên vô hại với môi trường sống Ngày nay, mức sống nâng cao người tiêu dùng quan tâm đến chất lượng thực phẩm để đảm bảo sức khỏe Chính mà sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên lựa chọn ưu tiên Hơn nữa, năm gần đây, tinh dầu trở thành đối tượng nhiều nhà nghiên cứu Tuy nhiên, việc khai thác chế biến tinh dầu nước ta chưa phát triển Các sản phẩm tinh dầu chủ yếu phải nhập từ nước để làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp Việt Nam Trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm dược phẩm, việc tạo hương cho sản phẩm, tinh dầu thành phần dược liệu Đặc biệt, gừng chữa rối loạn tiêu hóa, cảm cúm, ho, đau khớp, đau nhức cảm lạnh,… Trong sản xuất thực phẩm, tinh dầu việc giúp tăng hương vị cho sản phẩm đóng vai trò chất bảo quản, chất chống oxy hóa nhằm ức chế phát triển vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm Tuy nhiên việc sử dụng loại tinh dầu cơng nghệ thực phẩm hạn chế hoạt tính sinh học chúng biết đến Chính lý đó, Chương TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược lịch sử phát triển tinh dầu Tinh dầu xuất phát triển với văn minh nhân loại, từ thời thượng cổ người sử dụng loại có tinh dầu dạng tươi hay phơi khô Vào khoảng kỷ XV, người ta biết dùng loại rễ có tinh dầu để thờ cúng Từ kỷ XV đến kỷ XVII, tinh dầu dùng nhiều để làm thơm cho tóc, da mặt, dùng chữa bệnh dùng tăng hương vị cho thực phẩm chế biến Từ kỷ XVII đến kỷ XIX, tinh dầu dùng làm thuốc, trang điểm dùng công nghiệp rộng rãi Đến kỷ XX, tinh dầu trở nên phổ biến, ngành công nghiệp tinh dầu phát triển tinh dầu coi nguyên liệu hóa học để dùng công nghiệp lương thực thực phẩm, dệt…(Nguyễn Đăng Vinh, 1977) Đầu kỷ XVI, nhà khoa học nghiên cứu 14 lồi có tinh dầu như: cánh kiến, hồng, thông, quế, mù tạt,… đến cuối kỷ XVI, phát thêm 62 lồi có tinh dầu khác Từ kỷ XIX đến nay, loại có tinh dầu nghiên cứu lại cách có hệ thống ứng dụng vào sản xuất Hiện có khoảng 2000 lồi có tinh dầu, giới nghiên cứu khai thác khoảng 200 lồi có giá trị cơng nghiệp (Nguyễn Đăng Vinh, 1977) Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi, châu Á khu vực sản xuất lượng tinh dầu nhiều chủ yếu tinh dầu sả, bạc hà, thông, cam,…ở nước Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật, Indonexia,…Châu Âu sản xuất phần lớn tinh dầu nhài, hồng, thủy tiên, huệ,…Còn châu Mỹ sản xuất phần lớn tinh dầu bạc hà, cam,…(Nguyễn Đăng Vinh, 1977) Hàng năm, Trung Quốc sản xuất 1000 tinh dầu sả 200 tinh dầu màng tang Ấn Độ năm sản xuất 750 tinh dầu sả, 90 tinh dầu xantan, 12 - 20 tinh dầu bạch đàn, số loại tinh dầu khác hoắc hương, là,… Nhật tiếng với tinh dầu bạc hà, sản lượng 270 năm Indonexia Xrilanca chủ yếu sản xuất tinh dầu sả, số loại tinh dầu khác cánh kiến, quế,… (Nguyễn Đăng Vinh, 1977) Riêng Việt Nam, số lượng có tinh dầu phong phú số loại nghiên cứu sử dụng Ngày với phát triển khoa học công nghệ, sản xuất loại tinh dầu thiên nhiên với phẩm chất ngày cao mà tinh chế đơn chất từ tinh dầu thiên nhiên nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Ngồi tổng hợp hợp chất nhân tạo có mùi thơm giống với tinh dầu thiên nhiên từ chất hóa học 2.2 Giới thiệu chung tinh dầu 2.2.1 Khái niệm tinh dầu Tinh dầu chất hay hỗn hợp nhiều chất dễ bay có mùi đặc biệt, có nguồn gốc từ động vật (cánh kiến, chồn hôi, cầy hương,…) hay thực vật (quế, bạc hà, sả, ) Tinh dầu hỗn hợp phức tạp, thành phần chủ yếu chứa hợp chất terpen (Nguyễn Đăng Vinh, 1977) 2.2.2 Phân loại tinh dầu Nguồn nguyên liệu có tinh dầu phong phú Tuy nhiên, để tiện cho việc nghiên cứu sử dụng, nhà khoa học phân loại dựa nhiều tiêu chí khác chủ yếu phân loại dựa theo nguồn gốc nguyên liệu chứa thành phần tinh dầu 2.2.2.1 Phân loại theo nguyên liệu chứa tinh dầu Nguyên liệu chứa tinh dầu có nguồn gốc chủ yếu từ động vật (cà cuống, xạ hương, cánh kiến,…) thực vật Đối với nguyên liệu thực vật, phân loại dựa theo phận chứa tinh dầu:  Hoa: huệ, ngọc lan, hồng, nhài, thủy tiên…  Vỏ quả: cam, chanh, bưởi, …  Củ, rể: xá xị, gừng,…  Thân lá: sả, tràm, bạc hà,…  Quả hạt: hồi, màng tang, thảo quả,…  Nhựa: thông, trám, bồ đề,… (Nguyễn Đăng Vinh, 1977) 2.2.2.2 Phân loại theo thành phần chứa tinh dầu  Tinh dầu chứa linalol: hoa cam, mùi,  Tinh dầu chứa ceton: bạch đàn, khuynh diệp,…  Tinh dầu chứa rượu: hồng, sả,…  Tinh dầu chứa cacbua hydro: thông, chanh,…  Tinh dầu chứa aldehyde: chanh, màng tang,…  Tinh dầu chứa menthol: bạc hà,…(Nguyễn Đăng Vinh, 1977) 2.2.3 Tính chất thành phần tinh dầu 2.2.3.1 Tính chất Ở nhiệt độ thường đa số tinh dầu thể lỏng, suốt màu vàng nhạt, vàng đậm hay phớt xanh, có mùi thơm vị cay đặc trưng Phần lớn tỷ trọng tinh dầu nhẹ nước, trừ số nặng nước quế, đinh hương Tỷ trọng tinh dầu 20 0C khoảng 0,85 đến 1,18 Tinh dầu tan nước tan nhiều cồn dung môi hữu như: ester, chloroform, benzen… Tinh dầu có tính khuyếch tán sát trùng mạnh (Phùng Thị Bạch Yến, 2000) Tinh dầu có thành phần phức tạp nên coi chất có nhiệt độ sơi định mà nói đến nhiệt độ sơi thành phần tinh dầu Hơn với loại tinh dầu nhiệt độ sơi khơng ổn định tùy vào nguồn gốc nguyên liệu chứa tinh dầu Tinh dầu trung tính với giấy quỳ, để tiếp xúc thường xun với ánh sáng khơng khí tinh dầu dễ bị oxy hóa làm màu sắc biến đổi hương vị thay đổi (Phùng Thị Bạch Yến, 2000) 2.2.3.2 Thành phần Tinh dầu phần lớn hỗn hợp nhiều chất thơm, với tỉ lệ thay đổi thành phần quan trọng tinh dầu có chiếm tỉ lệ thấp Thành phần tinh dầu bao gồm: hydro cacbua, rượu tự do, acid, phenol, ether, aldehyde hay dạng ester, ngồi có hợp chất chứa nitơ, hợp chất chứa sulfur, hợp chất chứa halogen,… (Phùng Thị Bạch Yến, 2000) 2.2.4 Công dụng tinh dầu Từ xưa, người biết dùng quế, hồ tiêu, đinh hương, nhục đậu khấu để làm gia vị cho ăn Ngày với phát triển công nghệ, tinh dầu chiết xuất nhiều cách khác cho thu lượng tinh dầu nguyên liệu với hiệu suất cao chi phí thấp Tinh dầu dùng làm hương liệu ngành công nghiệp nước giải khát, rượu mùi, bánh kẹo,…làm hương vị thức ăn, nước uống thêm thơm ngon hấp dẫn Ngồi tinh dầu sử dụng ngành công nghiệp khác mỹ phẩm, y dược,…Trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm, tinh dầu nguyên liệu sản phẩm nước hoa, son mơi, phấn, dầu gội,…Còn lĩnh vực y dược, tinh dầu dùng làm thuốc sát trùng, chữa bệnh đường hô hấp, nôn mửa, giảm đau,… (Nguyễn Đăng Vinh, 1977; Lê Ngọc Thạch, 2003) 2.2.5 Bảo quản tinh dầu Sự biến tính tinh dầu phần lớn oxy hóa, thủy phân ester Ở điều kiện có ánh sáng nhiệt độ cao, biến tính tinh dầu xảy nhanh Vì trình bảo quản phải hạn chế q trình xảy mức tối thiểu Tinh dầu bảo quản nơi mát, hạn chế ánh sáng chiếu vào Tinh dầu đem bảo quản nước, cặn chứa chai lọ khơ, kín, đóng đầy Tùy theo loại tinh dầu mà có dụng cụ chứa thích hợp, tốt nên chứa lọ thủy tinh màu không gây phản ứng hóa học làm cho tinh dầu biến màu phẩm chất (Nguyễn Đăng Vinh, 1977; Phùng Thị Bạch Yến, 2000) 2.2.6 Bảo quản nguyên liệu chứa tinh dầu Phẩm chất nguyên liệu chứa tinh dầu ảnh hưởng trực tiếp đến tỉ lệ phẩm chất tinh dầu sau chưng cất Nguyên liệu xấu, giập nát cho tinh dầu với tỉ lệ cao phẩm chất tốt Do việc bảo quản nguyên liệu chứa tinh dầu quan trọng, đặc biệt nước nhiệt đới, thời tiết nóng ẩm nên việc bảo quản nguyên liệu chứa tinh dầu phải thận trọng Mỗi loại nguyên liệu chứa tinh dầu có cách bảo quản riêng biệt nhằm hạn chế hao hụt tinh dầu:  Loại nguyên liệu thân gỗ, rễ cây, vỏ: bảo quản nơi mát, xếp cho thoáng hơi, dễ kiểm soát nhiệt độ độ ẩm, cách xa nơi ẩm ướt  Loại nguyên liệu lá, hoa, quả: bảo quản bóng râm, thống khí, tránh chất đống sinh nhiệt dễ làm thối nát giập úng 2.2.7 Vai trò tinh dầu đời sống thực vật Theo Lê Ngọc Thạch (2003), tinh dầu thực vật tổng hợp trình sinh sống phát triển phải có vai trò định đời sống thực vật tạo Tuy nhiên, vai trò tinh dầu quy tụ nội dung là:  Bảo vệ khỏi tác hại côn trùng sâu bệnh  Hỗ trợ phát triển  Che phủ vết thương  Ức chế phát triển loài khác 2.2.7.1 Vai trò dẫn dụ Thơng thường thụ phấn loại hoa thực chủ yếu côn trùng (ong, bướm,…) Cơn trùng tìm đến hoa hương thơm hoa tỏa Tinh dầu số lồi hoa có khả dẫn dụ trùng để giúp hoa thụ phấn 2.2.7.2 Vai trò bảo vệ Người ta nhận thấy số loài cây, tinh dầu chúng góp phần bảo vệ chống lại lồi vật ăn cỏ Thí dụ juvabion, tìm thấy tinh dầu Ocimum basilicum, có khả ngăn chặn chu kì sinh trưởng số trùng chuyên phá hoại loại Một số loại tinh dầu khác bảo vệ khả xua đuổi lồi vật 2.2.7.3 Vai trò hỗ trợ phát triển Tại vùng có hệ sinh thái bán khô cằn vùng Viễn Tây nước Mỹ, thuộc họ Lamiaceae Asteraceae chứa nhiều tinh dầu Dưới điều kiện nóng khơ, tinh dầu bay hơi, số tinh dầu bị đất hấp thu giữ lại tạo thành vùng ngăn chặn phát triển loại Ở Australia, Eucalyptus pilularis ngăn chặn nảy mầm hạt vùng chung quanh Ngồi ra, Eucalyptus delegatensis làm cho mọc quanh cao độ m khoảng 40 năm, phát triển mãnh liệt chết ngã xuống 2.2.7.4 Vai trò dung mơi hữu Carlton (1990) cho số monoterpene không đảm nhiệm chức riêng rẻ mà chúng đóng vai trò dung mơi hữu cho số hợp chất hữu khác có hoạt tính sinh học Thí dụ, tinh dầu sim đầm lầy (Myrica gale) chứa hỗn hợp monoterpene dễ bay sesquiterpene bay có hoạt tính chống nấm mạnh germacron Khi tuyến tinh dầu bị vỡ ra, monoterpene mau chóng tỏa bao phủ vết thương mang theo germacron Sau chúng bay để lại germacron trải rộng vết thương (trích dẫn Lê Ngọc Thạch, 2003) 2.2.7.5 Hoạt tính kháng sinh Khi quan bị tổn thương, tinh dầu từ mơ bảo vệ khơng cho bị nhiễm trùng thứ cấp Những hợp chất có nhiệm vụ thực vật gọi chung chất phytoalexin Các phytoalexin khơng phải có mặt tinh dầu mà dường tạo từ mô gần vết thương 2.3 Đại cương gừng 2.3.1 Đặc điểm thực vật Theo Đơng y, gừng gọi sinh khương hay can khương Sinh khương củ gừng tươi, can khương củ gừng khô Tên khoa học Zingiber officinale roscoe Thuộc họ gừng: Zingiberaceae Gừng thuộc loại thân cỏ, mọc thành bụi, cao khoảng 60 – 80 cm Thân rễ mềm, lâu dần thành xơ, mọc so le, khơng cuốn, có bẹ hình mốc dài 15 – 20 cm, rộng khoảng cm, mặt bóng nhẵn màu xanh, gân trắng nhạt, mép cánh nhị hoa màu tím Củ gừng có vị cay, thân nhiều mắt 2.3.2 Phân loại Gừng trồng khắp nơi, củ gừng dùng làm gia vị trị bệnh chủ yếu Hiện nay, giới có giống gừng sau:  Giống Jamaica: chiều dài củ thay đổi từ – 10 cm, mầm, màu vàng hay xanh Giống màu xanh màu vàng thối hóa Củ giống màu xanh cứng nhiều xơ Giá trị thương mại giống màu vàng  Giống Phi Châu: củ ngắn giống Jamaica, màu vàng sẫm  Giống Ấn Độ: củ ốm, dài trung bình 12 cm (Ravindran Babu, 2003) Theo Đỗ Tất Lợi (1991), Việt Nam việc điều tra giống gừng hạn chế, chủ yếu tạm phân gừng thành giống theo cách gọi tên dân gian:  Gừng hương (gừng sẻ): gừng củ nhỏ, xơ nhỏ, suất thấp củ có vị cay, thơm, ấm giống gừng trâu  Gừng trâu (gừng tàu): xơ, nhiều bột, củ to, chiều dài củ trung bình – 10 cm, trọng lượng 0,7 – kg/1 bụi Tương đối ổn định suất, củ có vị cay, thơm giống gừng sẻ, hàm lượng tinh dầu thấp giống gừng sẻ 2.3.3 Phân bố Gừng có nguồn gốc Đơng Nam châu Á Gừng loại gia vị trồng nhiều nước vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, từ Đông Á đến Đông Nam Á Nam Á Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản nước trồng nhiều gừng giới (Ravindran Babu, 2003) 2.3.4 Thu hoạch sơ chế Tùy theo giống, tùy theo yêu cầu sử dụng xuất khẩu, gia vị hàng ngày, dược liệu,… mà thời gian thu hoạch khác nhau, thường thu hoạch thấy khô lại, hay có màu vàng khơ, rũ xuống Thường thu hoạch theo kiểu truyền thống cách đào cuốc Năng suất trung bình 20 – 25 tấn/năm Thu hoạch cẩn thận, tránh làm trầy vỏ bể nát củ Để bảo quản gừng lâu, sau thu hoạch xong cắt bỏ rể, làm đất, phơi nắng để độ ẩm đạt khoảng – 12 % (Đỗ Tất Lợi, 1991) 2.3.5 Công dụng Ravindran Babu (2003) cho gừng loại gia vị dược liệu có giá trị giới Ở Châu Âu gừng trồng chủ yếu để làm gia vị Đặc biệt phụ nữ ốm nghén, buồn nơn nhai tươi hít tinh dầu gừng Ở Việt Nam, gừng dùng làm mứt vào dịp tết Gừng giúp tiêu hóa dễ dàng, thường dùng trường hợp ăn, ăn uống không tiêu, nôn mửa, cảm mạo, phong hàn, chữa ho tiếng Tinh dầu củ gừng dùng công nghiệp chế biến hương liệu làm rượu gừng, kẹo gừng, trà gừng,… 2.4 Giới thiệu tinh dầu củ gừng 2.4.1 Thành phần hóa học củ gừng Trong gừng có từ 1,5 – % tinh dầu, chất béo 3,7 %, tinh bột chất cay zingeron, zingerol shogaol… Zingerol chất lỏng sánh, màu vàng không mùi, vị cay, độ sôi khoảng 235 – 240 0C Khi đun sôi với Ba(OH)2 bị phân giải cho chất aldehyde bay hơi, chất cay dạng tinh thể (zingeron) số chất thể dầu gọi shogaol 10 Hình 2.1 Củ gừng Hình 2.2 Tinh dầu củ gừng Hình 2.3 Tế bào tiết tinh dầu (màu vàng) thân rễ củ gừng 2.4.2 Tinh dầu gừng Tinh dầu gừng chất lỏng suốt, màu vàng nhạt, có mùi đặc trưng, vị cay Theo kết nghiên cứu tác giả Vũ Ngọc Lộ (1996):  Tỷ trọng 0,878 g/ml  Năng suất quay cực tả triền – 25  Thành phần chủ yếu tinh dầu: β – phelandien 10,67 %; α – zingiberen 44,26 %; β – santalol 16,20 %; β – bisabolen 10,31 %; α – curcumen 1,94 % 11 2.4.3 Sản xuất tinh dầu 2.4.3.1 Sơ lược phương pháp sản xuất tinh dầu Theo Lê Ngọc Thạch (2003), sản xuất tinh dầu chia thành phương pháp: học, tẩm trích, hấp thụ chưng cất nước Các phương pháp sản xuất đáp ứng yêu cầu chung sau:  Tinh dầu thu có mùi thơm tự nhiên ban đầu nguyên liệu  Quy trình khai thác phù hợp với nguyên liệu  Tinh dầu lấy triệt để khỏi nguyên liệu với chi phí thấp Nguyên tắc ly trích phương pháp dựa đặc tính tinh dầu như:  Dễ bay  Lôi theo nước nhiệt độ 100 0C  Hòa tan dễ dàng dung môi hữu  Dễ bị hấp thu thể khí Ngày có phương pháp để ly trích tinh dầu sử dụng dung mơi dioxide carbon, sử dụng vi sóng, sử dụng siêu âm 2.4.3.2 Phương pháp chưng cất nước Nguyên tắc: dựa khả hòa tan, khuyếch tán lơi theo nước hợp chất hữu tinh dầu chứa mô tiếp xúc với nước nhiệt độ cao Sự khuyếch tán dễ dàng tế bào chứa tinh dầu trương phồng nguyên liệu tiếp xúc với nước bão hòa thời gian định Trong cơng nghiệp, dựa cách tiến hành người ta chia làm phương pháp chưng cất nước chính:  Chưng cất nước  Chưng cất nước nước  Chưng cất nước 12 Về phương pháp có nguyên lý giống Ưu điểm: o Quy trình kỹ thuật đơn giản Thiết bị gọn, dễ chế tạo o Khơng đòi hỏi sử dụng dung mơi ly trích tinh dầu phương pháp tẩm trích, hấp thụ Thời gian tương đối nhanh Khuyết điểm: o Khơng thích hợp ngun liệu có hàm lượng tinh dầu thấp o Chất lượng tinh dầu bị ảnh hưởng tinh dầu có cấu phần dễ bị phân hủy Khơng lấy nhựa sáp có nguyên liệu (là chất định hương thiên nhiên có giá trị) o Trong nước chưng ln có lượng tinh dầu tương đối lớn Những tinh dầu có độ sơi cao thường cho hiệu suất 2.5 Tính kháng khuẩn tinh dầu 2.5.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu điều kiện phòng thí nghiệm khả ức chế phát triển vi khuẩn thơng qua việc đo đường kính vòng vơ khuẩn (Lê Ngọc Thạch, 2003) Rao (1989) nhận thấy tinh dầu Limnophila gratissima có khả kháng khuẩn mạnh tương tự Streptomicine Chloramphenicol vi khuẩn gây bệnh cho người Bacillus cereus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Tinh dầu nhục đậu khấu (Elattaria cardimomum) có chứa limonene ức chế hiệu vi khuẩn Propionbacterium acne Vi khuẩn gây bệnh viêm cơ, vết phát ban màu xanh lợt đỏ thấy mặt da đầu, bàn tay dẫn đến sưng nặng thương kết hợp ung thư bên Nếu tinh dầu có tính kháng khuẩn, kháng vi khuẩn Gram âm lẫn vi khuẩn Gram dương ví dụ tinh dầu Cistus creticus Phương thức tác động lên vi khuẩn 13 tinh dầu thường giống nhau, tác động lên tế bào chất lên vách tế bào (trích dẫn Lê Ngọc Thạch, 2003) Ngoài tinh dầu có hoạt tính kháng nấm, hoạt tính đơi nghiên cứu chung với hoạt tính kháng khuẩn gọi chung hoạt tính kháng vi sinh vật Cơ chế kháng khuẩn cấu phần tinh dầu tiếp tục nghiên cứu (Lê Ngọc Thạch, 2003) 2.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.5.2.1 Phương pháp định tính Phương pháp trộn chất thử vào môi trường thạch: chất thử pha lỗng với dung dịch đệm có nồng độ xác định trộn vào môi trường nuôi cấy Cấy vi sinh vật thạch, ủ ấm nhiệt độ 37 0C Sau 18 – 20 đọc kết việc quan sát vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc hay không so với mẫu đối chứng làm điều kiện không trộn lẫn chất thử vào môi trường nuôi cấy Phương pháp đục lỗ môi trường thạch: dùng đĩa thạch cấy vi khuẩn khắp mặt thạch Đục lỗ tròn đường kính mm đến đáy hộp Đổ dung dịch chất thử vào lỗ tròn ủ ấm 37 0C sau 18 Phương pháp cho kết rõ ràng, chất thử ngấm trực tiếp vào môi trường Kết tính cách đo đường kính vòng vơ khuẩn Phương pháp đặt đĩa giấy: dùng giấy thấm có đường kính mm, sấy vơ trùng Cho giấy thấm vào dung dịch chất thử đặt giấy lên môi trường thạch cấy vi khuẩn, ủ ấm 37 0C sau 18 – 20 Đọc kết cách đo đường kính vòng vơ khuẩn Phương pháp đào rãnh Fleming: dùng dao nhỏ vô trùng cắt đường song song đáy hộp (khoảng mm), bỏ thỏi thạch giữa, đổ dung dịch chất thử vào rãnh Cấy vi khuẩn thành đường thẳng góc với rãnh, ủ ấm 37 0C sau 18 Đọc kết cách đo vùng vô khuẩn từ chân rãnh trở Phương pháp thử chất kháng khuẩn bay hơi: dùng nửa hộp lồng có đường kính nhau, đổ mơi trường thạch nóng chảy vào nửa hộp lồng phía đáy, mơi trường đơng lại, cấy vi khuẩn thành đường thẳng Nửa hộp lồng để 14 chất thử Gắn khe hở băng dính parafin, ủ 37 0C sau 12 – 18 đọc kết quả, so sánh với đối chứng Chất bay có tác dụng ức chế tiêu diệt vi sinh vật đem thử Phương pháp cho phép phát chất bay mang tính kháng khuẩn mà phương pháp khơng thể phát (Nguyễn Đức Minh, 1985) Nhược điểm phương pháp chất thử khó khuyếch tán vào thạch làm kết không ổn định Mặt khác, chưa có tiêu chuẩn đánh giá thống đường kính vòng vơ khuẩn nên kết nhận mang tính tương đối Tuy nhiên phương pháp có ưu điểm dễ làm nhanh chóng (Phan Trần Thúy Loan, 2007) 2.5.2.2 Phương pháp định lượng Phương pháp hệ nồng độ ứng dụng rộng rãi vi khuẩn học để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC), chất thử pha lỗng thành dãy nồng độ khác Có phương pháp xác định tiến hành môi trường đặc môi trường lỏng  Phương pháp pha lỗng mơi trường rắn: pha loãng chất thử vi khuẩn thạch, ủ thời gian quy định, đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn phát triển hộp thạch, so sánh với hộp đối chứng làm điều kiện không cho chất thử vào Hoặc chấm lượng vi khuẩn xác định môi trường thạch có sẵn chất thử với dãy nồng độ khác nhau, sau thời gian ủ ấm, xác định nồng độ vi khuẩn không mọc thạch  Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng: pha lỗng chất thử thành dãy nồng độ khác nhau, ml dung dịch chất thử nồng độ trộn với lượng môi trường lỏng cấy giọt huyền dịch vi khuẩn có tỷ lệ xác định Nếu chất thử có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn mơi trường ngược lại mơi trường đục Xác định nồng độ thấp mà vi sinh vật không mọc (Nguyễn Đức Minh, 1985) 15  Phương pháp xác định độ đục: pha loãng dung dịch chất thử nồng độ khác nhau, dung dịch trộn với mơi trường lỏng có cấy vi khuẩn, ủ ấm 37 0C – giờ, dùng máy đo quang phổ xác định độ đục môi trường Nồng độ tác dụng dung dịch thí nghiệm tính theo mức độ tác dụng dung dịch chuẩn biết trước nồng độ (Nguyễn Đức Minh, 1985) Khả ức chế vi khuẩn chất thử nghiệm xác định qua nồng độ tối thiểu ức chế phát triển vi khuẩn (MIC) Trị số MIC thấp, chất thử có tác dụng mạnh (The National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1993) (NCCLS) Các yếu tố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm:  Mật độ tế bào: lượng tế bào thay đổi, giá trị MIC thay đổi theo Để kết ổn định, NCCLS (1993) quy định điều chỉnh độ đục dịch huyền phù vi khuẩn với dung dịch chuẩn Mc Farland 0,5 quang phổ kế, bước sóng 625 nm Ở điều kiện dịch huyền phù vi khuẩn tương đương – x 108 CFU/ml  Môi trường dùng thử pH môi trường: sử dụng môi trường khác dẫn đến thay đổi kết thành phần mơi trường tương tác với chất thử, môi trường phức hợp pH môi trường thử ảnh hưởng nhiều đến kết thử  Nhiệt độ thời gian ủ: thời gian nhiệt độ ủ ảnh hưởng rõ rệt lên giá trị MIC Thường MIC có khuynh hướng gia tăng kéo dài thời gian ủ Khó dự đốn thay đổi kết theo biến đổi nhiệt độ ủ thay đổi kết cho thấp 35 0C NCCLS (1993) đề nghị nhiệt độ ủ 37 0C khoảng 16 – 18 Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Shigella, Klebsiella, Salmonella typhi 24 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis 16  Điểm dừng đọc kết quả: sau thời gian ủ, tùy theo loại vi khuẩn nồng độ thấp chất thử mà vi khuẩn không mọc (không mọc thành khuẩn lạc hay không làm đục mơi trường) MIC chất thử 2.6 Sơ lược chủng vi khuẩn dùng nghiên cứu Những chủng vi sinh vật dùng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đảm bảo yêu cầu sau: ni cấy dễ dàng phòng thí nghiệm, nhạy cảm đại diện cho số đông vi khuẩn nhóm (Nguyễn Đức Minh, 1985) 2.6.1 Bacillus cereus Bacillus cereus trực khuẩn gram dương, hiếu khí kị khí tùy ý, di động, tạo bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng Voges Proskauer (+), có khả sử dụng nitrate Bacillus cereus tăng trưởng khoảng nhiệt độ – 50 0C, nhiệt độ tối ưu 35 – 40 0C, pH dao động từ 4,5 đến 9,3 Trên môi trường chọn lọc Bacillus cereus tạo khuẩn lạc to, mọc lan rìa nhăn Bacillus cereus diện nhiều đất, bụi, thực phẩm (thịt, sữa, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khơ,…) Vi khuẩn tiết hai loại độc tố diarrhoeal toxin gây tiêu chảy emetic toxic gây nôn (Trần Linh Phước, 2006) 2.6.2 Escherichia coli Được phát vào năm 1885 với tên gọi Bacterium coli commune từ chủng vi khuẩn đường ruột Sau nhiều tên gọi, đến năm 1991, vi khuẩn thống với tên gọi Escherichia coli (viết tắt E coli) E coli thường xuất sớm đường ruột người động vật sơ sinh (sau sinh giờ) Từ ruột, E coli theo phân đất nước Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteraceae, gram âm, hình que, đường kính khoảng mm Phần lớn di động không sinh bào tử, hiếu khí hay kị khí tùy nghi Nhiệt độ phát triển thích hợp 37 – 38 0C (Trần Đáng, 2008) E coli có cấu trúc kháng nguyên với tên gọi O (kháng nguyên thân), K (kháng nguyên bề mặt) H (kháng ngun lơng) E coli có loại độc tố: 17 ... thực đề tài: Bước đầu khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng Chúng thực đề tài với mục đích:  Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng phát triển số chủng vi khuẩn  Xác định... Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu củ gừng nguyên chất vi khuẩn gram dương .31 Bảng 4.3: Kết định tính sơ hoạt tính kháng khuẩn dung dịch tinh dầu củ gừng 5% vi khuẩn gram... ln có lượng tinh dầu tương đối lớn Những tinh dầu có độ sơi cao thường cho hiệu suất 2.5 Tính kháng khuẩn tinh dầu 2.5.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn tinh dầu điều kiện