So sánh hiệu quả sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu với dung dịch NaClO 3% trên các vi khuẩn E. faecalis phân lập từ lâm sàng. So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch bơm rửa với dung dịch NaClO 3% trên mô hình viêm ống tủy răng do E. faecalis.
Trang 1KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG KHUẨN CỦA NHŨ DỊCH
CHỨA TINH DẦU TRÀM TRÀ ÚC VÀ HƯƠNG NHU TRẮNG TRÊN VI
KHUẨN ENTEROCOCCUS FAECALIS GÂY VIÊM ỐNG TUỶ RĂNG
Hà Đan Phương * , Lê Tuấn Anh *
TÓM TẮT
Mở đầu: Enterococcus faecalis là nguyên nhân hàng đầu gây thất bại trong điều trị nội nha Dung dịch
bơm rửa ống tuỷ được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là dung dịch NaClO 3% cho hiệu quả tốt nhưng lại
có nhiều nhược điểm như có mùi khó chịu, gây kích ứng nơi tiếp xúc, gây mòn men răng cũng như khả năng diệt vi khuẩn không hoàn toàn Các nghiên cứu trước đó tại Bộ môn Vi ký sinh, khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh đã bào chế nhũ tương bơm rửa chứa phối hợp tinh dầu tràm trà Úc (TTO) và hương nhu trắng (OG) để ứng dụng làm dung dịch bơm rửa ống tủy điều trị viêm ống tủy răng cho hiệu quả sát khuẩn trên nhiều vi khuẩn gây bệnh răng miệng tương đương với dung dịch NaClO 3% trên mô hình in vitro Để tiếp tục mở rộng đề tài, tác dụng sát khuẩn in vitro trên các chủng E faecalis lâm sàng cũng như tác dụng sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch tinh dầu được so sánh với dung dịch NaClO 3%
Mục tiêu: So sánh hiệu quả sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu với dung dịch
NaClO 3% trên các vi khuẩn E faecalis phân lập từ lâm sàng So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch bơm rửa với dung dịch NaClO 3% trên mô hình viêm ống tuỷ răng do E faecalis
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Vi khuẩn thử nghiệm: Enterococcus faecalis ATCC 29212
Mẫu bệnh phẩm là các mẫu răng nhổ bỏ thu thập từ Răng Hàm Mặt Trung ương TP Hồ Chí Minh Chất thử nghiệm: tinh dầu TTO và OG, dung dịch NaOCl 3% Phương pháp nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn từ các mẫu răng bệnh phẩm bằng phương pháp nuôi cấy Các chủng E faecalis được định danh bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Khảo sát tác động sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp TTO và
OG trên các chủng E faecalis phân lập được So sánh hiệu quả của nhũ tương với dung dịch natri hypoclorid 3% Khảo sát tác động sát khuẩn ex vivo của nhũ tương trên mô hình nhiễm khuẩn ống tủy răng
do E faecalis So sánh hiệu quả của nhũ tương với dung dịch natri hydroclorid 3%
Kết quả: Đã phân lập và định danh được 15 chủng E faecalis từ 80 mẫu răng bệnh phẩm Thử nghiệm
khả năng sát khuẩn in vitro trên các chủng E faecalis phân lập từ lâm sàng cho thấy hiệu quả tương đương giữa nhũ dịch bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu và dung dịch đối chiếu natri hypochlorite 3% Thử nghiệm ex vivo trên mô hình viêm ống tủy răng do E faecalis cho thấy nhũ dịch nghiên cứu cho hiệu quả sát khuẩn chậm hơn nhưng cho tác dụng kéo dài hơn, giảm thiểu được nguy cơ tái nhiễm trùng so với dung dịch NaClO 3%
Kết luận: Kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy tiềm năng của nhũ tương bơm rửa ống tủy chứa
hỗn hợp tinh dầu TTO và OG, có khả năng thay thế các dung dịch bơm rửa ống tủy cổ điển
Từ khóa: Tinh dầu tràm trà Úc, tinh dầu hương nhu trắng, NaOCl, nhiễm trùng ống tủy, sâu răng,
Enterococcus faecalis
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS Lê Tuấn Anh ĐT: 0779784030 Email: letuananh@ump.edu.vn
Trang 2ABSTRACT
STUDY ON THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE EMULSION CONTAINING TEA TREE OIL
AND OCIMUM GRATISSIMUM ESSENTIAL OIL ON ENTEROCOCCUS FAECALIS
CAUSING ENDODONTIC INFECTION
Ha Dan Phuong, Le Tuan Anh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 61 – 69
Background: Enterococcus faecalis is one of the major causes of failure in endodontic infection
treatment Sodium hypochlorite 3% solution (NaOCl) has been the most commonly irrigant for preparing infected root canals However, this solution could exert some undesirable effects including tissue toxicity at the exposed sites and eroding enamel for long exposure as well as incompletely killing of bacteria From former experiments, we had successfully formulated a emulsion containing mixture of tee trea oil (TTO) and Ocimum gratissimum essential oil (OG) that showed the same antibacterial effect with NaClO 3% solution on various pathogen that cause endodontic infection, in vitro In order to expand the application of this emulsion, we further compare the bactericidal effect of the studied emulsion with NaOCl 3% solution
on E faecalis isolated from clinical specimen, as well as on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis
Objectives: Compare the bactericidal effect of the emulsion contain mixture of TTO and OG with
NaClO 3% solution on E faecalis isolated from clinical samples Compare the antibacterial effect of the study emulsion on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis
Materials and methods: Tested microbes: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Streptococcus mutans
ATCC 35668 Clinical samples: Decayed teeth after tooth extraction procedure, taken from Dental Hospital
of Central Ho Chi Minh city Subtances: tea tree oil, Ocimum gratissimum essential oil, sodium hypoclorite 3% solution Methods: Isolate Enterococcus faecalis from decayed teeths obtained from patients Compare the in vitro bactericidal effect of studied emulsion to NaOCl 3% solution on isolated E faecalis Compare the antibacterial effect of the studied emulsion to NaOCl 3% on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis
Results: Among 80 samples taken from Dental Hospital of Central Ho Chi Minh city, E faecalis was
dectected in 15 samples In in vitro test, the studied emulsion exhibited the same bactericidal effect to the NaClO 3% solution In ex vivo model, the studied emulsion could not eliminate E faecalis as fast as the NaClO solution did In contrast, the studied emulsion showed long-lasting effect and reduced the amount of re-infection teeth compare to the NaClO 3% solution
Conclusion: The result of this study showed that the emulsion containing TTO and OG could be a
promising irrigant to replace NaClO and others in fighting root canal infection
Keywords: Endodontic infections, Enterococcus faecalis, Irrigants, Tea tree oil, Ocimum gratissimum
essential oil
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sức khỏe răng miệng là một phần quan
trọng của sức khỏe con người Theo thống kê
của Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh răng miệng
xếp hàng thứ tư trong số các bệnh lý có chi phí
điều trị cao nhất, trong đó, sâu răng và bệnh
nha chu từng được xem là gánh nặng sức khỏe răng miệng hàng đầu(12) Hệ vi khuẩn răng miệng là nguyên nhân chính dẫn đến bệnh nhiễm trùng nội nha, trong đó, nhiễm trùng nội nha tiên phát chủ yếu gây ra do vi khuẩn
kỵ khí bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí không bắt
Trang 3buộc Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc rất dễ dàng bị
loại bỏ hoặc giảm thiểu số lượng bằng các thiết
bị và dung dịch bơm rửa nội nha Ngược lại,
vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc có thể sống
sót được trong môi trường khắc nghiệt và
kháng nhiều phương pháp điều trị Nhiễm
trùng nội nha thứ phát do thất bại trong điều
trị nội nha thường do các vi khuẩn còn tồn tại
trong ống tủy chân răng sau khi trám bít ổng
tủy gây nên Trong số các tác nhân gây nhiễm
trùng nội nha, Enterococcus faecalis được tìm
thấy trong 4-40% trường hợp nhiễm trùng nội
nha tiên phát(14) và tăng lên đến 30-90% trong
nhiễm trùng nội nha thứ phát(17) Vi khuẩn này
được xem là nguyên nhân hàng đầu gây thất
bại trong điều trị nội nha do khả năng kháng
dung dịch bơm rửa cũng như khả năng sống
sót cao, đơn lẻ không cần sự hỗ trợ của các loài
vi khuẩn khác(7)
Hiện nay, có rất nhiều dung dịch bơm rửa
nội nha được sử dụng trong lâm sàng như
natri clorid, hydroperoxid 3%, clorohexidin…
tuy nhiên phổ biến nhất vẫn là natri
hypoclorid (NaClO) Ở nồng độ sử dụng 2,5%
- 5,25%, NaOCl cho hiệu quả sát khuẩn cao
cũng như khả năng làm sạch mô bị hoại tử tốt
Tuy nhiên, NaClO có mùi khó chịu, tác dụng
sát khuẩn có thể bị giảm khi tiếp xúc với dịch
viêm có tính acid Khi sử dụng ở nồng độ cao
và trong thời gian dài, NaClO có thể ảnh
hưởng đến độ bền và độ đàn hồi của lớp ngà
răng là nguyên nhân gây vỡ thân răng do
dung dịch này có khả năng hoà tan ion calci
của ngà răng(1) Ngoài ra, trong khi rửa ống
tủy, dung dịch dễ bị đẩy ra ngoài và kích thích
vùng nha chu quanh chóp hay làm bỏng niêm
mạc miệng Do đó, việc nghiên cứu các dung
dịch bơm rửa nội nha có tác dụng tương
đương hoặc tốt hơn NaOCl mà không gây tác
dụng phụ đang là vấn đề được quan tâm
Tinh dầu Hương nhu trắng và Tràm trà Úc
từ lâu đã được biết đến với tác dụng sát khuẩn
mạnh Các nghiên cứu của Bộ môn Vi – Ký
sinh đã cho thấy phối hợp hai loại tinh dầu
cho tác dụng cộng lực trên nhiều loại vi khuẩn(4,6) Lê Văn An (2017) đã xây dựng và tối
ưu hóa thành công công thức nhũ tương phối hợp hai loại tinh dầu trên cho hiệu quả sát
khuẩn in vitro tốt trên nhiều vi khuẩn gây
bệnh răng miệng, tương đương với dung dịch NaClO 3%(5) Tuy vậy, nhũ tương trên mới chỉ được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn
chuẩn in vitro và cần được đánh giá hoạt tính
trên các vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cũng như thử nghiệm trên các mô hình dược lý có
độ tin cậy cao hơn
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Vi sinh vật
Streptococcus mutans ATCC 35668
Chất thử nghiệm
Nhũ tương chứa 0,45% (kl/kl) tinh dầu Tràm trà Úc (TTO); 0,13% (kl/kl) tinh dầu Hương nhu trắng (OG)(5) Dung dịch NaClO 3%
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu răng bệnh phẩm
Mẫu răng bệnh phẩm được thu thập tại khu điều trị kỹ thuật cao, bệnh viện Răng Hàm Mặt Trung Ương TP Hồ Chí Minh Các răng được lựa chọn là các răng cối, trưởng thành, ống tuỷ còn nguyên vẹn Sát trùng xung quanh vùng răng nhổ bằng dung dịch
H2O2 3% và NaClO 2,5%, trung hòa bằng dung dịch Na2S2O3 5% Răng sau khi nhổ, được chuyển vào ống falcon có nút vặn chứa
môi trường Streptococcus faecalis Broth (SF
broth) vô trùng, lưu giữ ở nhiệt độ lạnh
10oC Chuyển về phòng thí nghiệm để xử lý trong vòng 2 giờ
Phân lập vi khuẩn
Mẫu răng đươc làm vỡ bằng cách cho tiếp xúc nhanh với nitơ lỏng và đập mạnh bằng chày trong cối sao cho mảnh răng vỡ thành mảnh kích thước khoảng 5 mm Chuyển toàn
Trang 4bộ mảnh vỡ vào môi trường SF broth, vortex
mạnh và ủ ở 37oC trong vòng 2 giờ để hồi
phục vi khuẩn trong mẫu(Error! Reference
source not found.) Pha loãng cấp 10 liên tiếp
2 cấp độ trong môi trường SF broth Hút 100
μl từ mỗi cấp pha loãng ở trên trải lên đĩa
thạch chứa môi trường thạch máu, ủ các đĩa
ở 37oC, ở điều kiện vi hiếu khí Sau 48 giờ,
quan sát sự mọc của các khóm vi khuẩn trên
đĩa và bắt lấy các khóm vi khuẩn có các đặc
tính của chi Enterococcus: cầu khuẩn gram
dương, dạng chuỗi ngắn, huyết giải hoặc
, có phản ứng catalase âm, Pyrrolidonyl
Arylamidase (PYR) test dương và bile
esculin dương
Định danh vi khuẩn
Chiết tách ADN nhiễm sắc thể
Phân lập vi khuẩn đã bắt giữ ở bước trên
lên trên thạch máu, sau đó, chuyển một khóm
vi khuẩn thu vào môi trường Tryptic Soy
Broth (TSB), ủ ở 37oC trong 18 giờ Tiến hành
chiết tách ADN nhiễm sắc thể của vi khuẩn
trên theo phương pháp SDS-KOAc
Khuếch đại đoạn gen 16S rADN
Sử dụng cặp mồi phổ quát (mồi xuôi,
5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' và
ngược, 5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA
CTT-3')(18) Chương trình nhiệt được thiết lập
cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC
trong 5 phút; biến tính ở 95oC trong 45 giây;
bắt cặp ở 55oC trong 45 giây; tổng hợp ở 72oC
trong 2 phút; bước tổng hợp cuối cùng ở 72oC
trong 10 phút Kiểm tra sản phẩm PCR bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1%, sản
phẩm mong muốn có kích thước 1505 bp được
tinh chế bằng bộ kit của hãng ABM (Mỹ) theo
quy trình của nhà sản xuất
Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của E faecalis
Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu có kích
thước 310 bp từ gen 16S rADN, trong đó, mồi
xuôi EF-F có trình tự 5’-GTT TAT GCC GCA
TGG CAT AAG AG-3’ nằm ở vị trí base thứ
165 đến 187 trên gen 16S rARN của E faecalis
(mã số truy cập Y18293 trên GenBank) và mồi ngược EF-R có trình tự 5’-CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’ nằm ở vị trí base thứ 457
đến 474 trên gen 16S rARN của E faecalis (mã
số truy cập Y18293 trên GenBank)(9) Chương trình nhiệt được thiết lập cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC trong 2 phút; biến tính
ở 95oC trong 30 giây; bắt cặp ở 60oC trong 1 phút; tổng hợp ở 72oC trong 1 phút; bước tổng hợp cuối cùng ở 72oC trong 2 phút Mẫu chứng dương là sản phẩm PCR đoạn 16S
rARN của E faecalis ATCC 29212, chứng âm là
sản phẩm PCR đoạn 16S rARN của
Streptococcus mutans ATCC 35668 Vi khuẩn
được xác định là E faecalis khi kết quả điện di
sản phẩm PCR trên gel agarose 2% thu được băng ADN kích thước 310 bp
Chuẩn bị vi sinh vật cho thử nghiệm tính kháng khuẩn của nhũ tương nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn E faecalis lên môi
trường Tryptic soy agar (TSA) Chuyển 3-5 khóm vi khuẩn được phân lập sang ống nghiệm chứa môi trường TSB, ủ ở 37oC trong 2-6 giờ Hiệu chỉnh mật độ vi sinh vật về khoảng 1-3.108 CFU/mL bằng cách đo OD ở bước sóng 625 nm, với cóng đo 1 cm đạt trong khoảng 0,08-0,1 Sau đó, pha loãng về mật độ
107 CFU/mL bằng dung dịch đệm phosphat (PBS) vô trùng Vi khuẩn sau khi chuẩn bị xong phải đưa vào thử nghiệm trong vòng 15 phút
Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro của nhũ tương nghiên cứu trên các chủng E faecalis phân lập từ bệnh phẩm
Hút 500 L huyền trọc E faecalis mật độ
107 CFU/mL phân lập từ lâm sàng cho lần lượt
vào 3 ống nghiệm chứa 10 ml lần lượt nhũ tương nghiên cứu, dung dịch NaClO 3% và dung dịch PBS Vortex mạnh để trộn đều Sau
60 giây tiếp xúc, đếm số lượng vi khuẩn sống còn lại trong mỗi ống bằng phương pháp đếm
Trang 5sống trên môi trường Streptococcus faecalis
agar (SF agar) Thử nghiệm được lặp lại 3 lần
Tạo mô hình viêm ống tủy răng do E faecalis
Dựa trên mô hình được mô tả bởi
Nakamura C.V, và cs(8), nhưng có sự điều
chỉnh về lượng vi sinh vật nạp vào mẫu răng
Các mẫu răng sau khi được thu nhận sẽ được
làm sạch với 100 mL nước cất Sau đó làm
đồng nhất chiều dài và dung tích làm việc của
các ống tủy răng bằng máy trâm quay
Protaper Universal (Dentsply Maillefer) với
các trâm SX, S1, F1, F2, F3, F4 Rửa sạch các
ống tủy bằng nước cất Dùng composite
resin trám chặt vùng lỗ chóp chân răng, để
khô Chôn cố định các răng vào eppendorf
2 mL, đậy chặt nắp và tiệt trùng ở 121oC
trong 20 phút Bơm 10 μL huyền trọc vi
khuẩn E faecalis mật độ 108 CFU/mL vào mỗi
ống tủy Dùng trâm K-file #15 vô khuẩn đưa
tới lui trong ống tủy để huyền trọc vi khuẩn đi
được đến chóp răng Ủ mẫu răng ở 37oC Sau
mỗi 24 giờ, thêm vào mỗi ống tủy 50 μL môi
trường Brain Heart Infusion broth (BHI) Nuôi
mẫu răng liên tục trong 7 ngày
Xác định lượng vi khuẩn trong mỗi ống tủy
Dùng côn giấy vô khuẩn #20 có chiều dài
tương ứng với chiều dài làm việc đặt vào ống
tủy, để yên trong 1 phút Chuyển côn giấy vào
eppendorf chứa sẵn 2 mL dung dịch NaCl
0,9% vô khuẩn, vortex mạnh trong 1 phút
Đếm số lượng vi khuẩn sống có trong
eppendorf bằng phương pháp đếm sống trên
môi trường SF agar
So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo trên
E faecalis của nhũ dịch nghiên cứu và
dung dịch NaClO 3%
Sau thời gian nuôi cấy, phân chia ngẫu
nhiên các răng thành ba nhóm, mỗi nhóm 13
răng Tiến hành xác định số lượng vi khuẩn
trong các răng ở mỗi nhóm trước khi rửa (T0)
Sau đó, các răng trong mỗi nhóm được
bơm rửa bằng nhũ dịch nghiên cứu hoặc dung
dịch NaClO 3% hoặc NaCl 0,9% theo cùng một quy trình như sau: Dùng bơm tiêm hút 2 mL dung dịch bơm rửa Đặt kim bơm vào vừa chặt ống tủy, lùi lại khoảng 1,0 mm Bơm nhẹ với vận tốc 2 mL/phút Thao tác bơm rửa chỉ thực hiện một lần
Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống tủy của mỗi nhóm ngay sau khi bơm rửa (T1) Tiếp tục bơm 50 μL môi trường BHI vào các ống tủy, ủ các mẫu răng ở 37o Sau mỗi 24 giờ, thêm vào mỗi ống tủy 50 μL môi trường BHI Nuôi các mẫu răng liên tục trong 7 ngày Xác định số lượng vi khuẩn trong các ống tủy ở mỗi nhóm sau 7 ngày (T2)
Từ các giá trị T0, T1, T2, xác định phần trăm lượng vi khuẩn giảm ở các ống tủy trong mỗi nhóm ngay sau khi rửa và sau 7 ngày So sánh phần trăm lượng vi khuẩn bị tiêu diệt trung bình ở mỗi nhóm bằng phép kiểm T-test qua phần mềm Microsoft Excel 2016
KẾT QUẢ
Phân lập vi khuẩn E faecalis từ mẫu răng
bệnh phẩm
Từ 80 mẫu răng thu thập được, chúng tôi
đã phân lập được 40 mẫu cầu khuẩn có các đặc điểm thỏa mãn các đặc tính của nhóm
Enterococci là khóm huyết giải hoặc ; cầu
khuẩn gram dương, xếp thành chuỗi ngắn; phản ứng catalase âm tính, PYR dương tính và phản ứng Bile esculin dương tính Tiến hành chiết tách và khuếch đại đoạn gen 16S rARN
từ 40 mẫu sử dụng cặp mồi phổ quát Sau khi tinh chế sản phẩm 16S rADN ở trên, chúng tôi
tiếp tục khuếch đại trình tự đặc hiệu của E
faecalis sử dụng cặp mồi EF-F: 5’-GTT TAT
GCC GCA TGG CAT AAG AG-3’ và EF-R: 5’-CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’ Kết quả,
chứng dương E faecalis ATCC 29212 cho băng
ADN kích thước 310 bp, chứng âm
Streptococcus mutans ATCC 35668 và mẫu
Trang 6trắng (không có ADN khuôn mẫu) không cho
băng ADN nào Từ đó, 15 chủng liên cầu cho
kết quả khuếch đại được băng ADN kích
thước 310 bp được xác định là E faecalis Như vậy tỷ lệ E faecalis phân lập và định danh
được từ lâm sàng là 15/80 mẫu chiếm 18,75%
Hình 1: Kết quả PCR khuếch đại đoạn 310 bp của E faecalis từ một số mẫu bệnh phẩmGiếng 1: 100bp
Opti-DNA Marker; Giếng 2: mẫu E faecalis ATCC 29212 (chứng dương); Giếng 3: mẫu S mutans ATCC
35668 (chứng âm); Giếng 4 – 20: một số mẫu bệnh phẩm; Giếng 21: mẫu trắng
Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro của
nhũ tương nghiên cứu trên các chủng E
faecalis phân lập từ bệnh phẩm
Kết quả đếm sống cho thấy, nhũ tương
bơm rửa ống tủy cho hiệu quả sát khuẩn hoàn
toàn sau 60 giây tiếp xúc trên cả 15 chủng vi
khuẩn E faecalis phân lập và định danh từ
mẫu bệnh phẩm tương đương với dung dịch đối chứng NaClO 3%
Bảng 1: Số lượng vi khuẩn ở mỗi nhóm sau khi cho tiếp xúc với các dịch thử nghiệm 60 giây
STT
Lượng vi khuẩn (CFU/ml) Mẫu trắng
(x10 5 CFU)
Ghi chú: Các mẫu không có vi khuẩn mọc trở lại được biểu diễn là có ít hơn 10 CFU/răng (giới hạn phát hiện của
phương pháp đếm sống trong nghiên cứu này)
Tạo mô hình viêm ống tuỷ răng do E faecalis
Sau khi tạo mô hình, lượng vi khuẩn
E.faecalis trung bình từ 3 nhóm (nhóm trắng,
nhóm thử và nhóm chứng) tại thời điểm ban
đầu được thể hiện qua bảng 1 Số lượng vi
khuẩn ban đầu trong các răng ở mỗi nhóm
khác nhau không có ý nghĩa thống kê p > 0,05
So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo trên E faecalis của nhũ dịch nghiên cứu và dung dịch NaClO 3%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
500 bp
300 bp
200 bp E1 E2 E6 E13 E21 E23 E25 E34
Trang 7Sau khi bơm rửa ống tuỷ bằng 3 dung
dịch, số lượng vi khuẩn đếm được trong mỗi
nhóm được thể hiện qua bảng 1 Như vậy, nhũ
tương nghiên cứu có khả năng tiêu diệt được
99,90% lượng vi khuẩn ngay sau khi bơm rửa,
thấp hơn có ý nghĩa (p < 0,05) so với Nhóm đối
chiếu (NaClO 3%) khi dung dịch này tiêu diệt
được hơn 99,99% lượng vi khuẩn với 10/10 mẫu răng đều không phát hiện được vi sinh vật mọc trở lại trong phương pháp đếm sống Trong khi đó, mẫu trắng bơm rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% làm giảm (do rửa trôi cơ học)
được 83,36% lượng E faecalis, thấp nhất trong
3 nhóm thử nghiệm (p < 0,05)
Bảng 2: Thống kê số lượng vi khuẩn trong các răng ở mỗi nhóm thử nghiệm
Nhóm trắng NaCl 0,9%
Nhóm thử Nhũ tương bơm rửa
Nhóm đối chiếu NaClO 3%
Số vi khuẩn trung
bình
(x10 3 CFU/ml)
134,36
33,70
25,68
7,21
51,98
16,29
154,55
36,21
0,14
0,10
1,72
1,25
158,77
38,46
< 0,001 (**)
3,88
3,63
83,36
2,11
61,31
8,59
-
99,90
0,18
99,00
1,26
- > 99,99
97,55
1,43 Số răng có vi khuẩn
mọc lại 11/11 11/11 11/11 11/11 7/11 4/11 10/10 0/10 9/10
Ghi chú: (*) Số lượng răng thực tế ở mỗi nhóm sau khi loại bỏ sai số thô, (**) Các răng không phát hiện được vi khuẩn được biểu diễn là có ít hơn 10 CFU/răng (giới hạn phát hiện của phương pháp đếm sống trong nghiên cứu này)
Sau 7 ngày, mẫu trắng làm giảm 61,31%
lượng vi khuẩn so với ban đầu, trong đó cả
11/11 răng có vi khuẩn mọc trở lại Mẫu thử
bơm rửa bằng nhũ dịch tinh dầu làm giảm
99,00% lượng vi khuẩn so với ban đầu, với
4/11 răng có vi khuẩn mọc trở laị Mẫu đối
chiếu làm giảm 97,55% lượng vi khuẩn so với
ban đầu và có 9/10 răng có vi khuẩn mọc trở
lại Như vậy, nhũ dịch tinh dầu nghiên cứu
cho khả năng ức chế vi khuẩn kéo dài và ngăn
ngừa sự tái nhiễm tốt hơn so với dung dịch
NaClO 3% (p < 0,05)
BÀN LUẬN
Phân lập vi khuẩn E faecalis từ mẫu răng
bệnh phẩm
Định danh vi sinh vật gây nhiễm trùng nội
nha bằng kỹ thuật PCR khuyếch đại đoạn 16S
hoặc 23S rADN đã được chứng minh là có độ
nhạy và hiệu quả hơn các phương pháp nuôi
cấy Enterococcus faecalis có thể được xác định
bằng phương pháp PCR bằng nhiều đoạn mồi
khác nhau như khuếch đại đoạn gen tuf dài
112 bp (phiên mã cho yếu tố nối dài EF-Tu),
hoặc các đoạn gen trên 16S rARN đặc hiệu cho
E faecalis như đoạn 310 bp (base thứ 165 - 474
của gen 16S rADN E faecalis, GenBank
accession no Y18293) hoặc 138 bp (base thứ 51
- 188 gen của 16S rADN E faecalis, GenBank
accession no Y18293)(9) Cặp mồi khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 310 bp sử dụng để xác định
E faecalis trong đề tài này tuy có độ nhạy
không cao như cặp mồi khuếch đại gen tuf tuy
nhiên lại cho độ đặc hiệu cao hơn(9) Ngoài ra, tính đặc hiệu của đoạn mồi này cũng đã được chứng minh qua nghiên cứu của Siqueira và
cs khi thử nghiệm với ADN của các loài khác(15) Do đó, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi
này để xác định vi khuẩn E faecalis
Sau khi định danh bằng cặp mồi đặc hiệu, kết quả cho thấy trong 80 răng sâu thu nhận
có 15 răng có sự hiện diện của E faecalis, chiếm
18,75% Tỉ lệ này tương tự với các nghiên cứu
ở Việt Nam và trên thế giới Theo nghiên cứu
của Nguyễn Thế Hạnh và cs, E faecalis xuất
hiện ở 7/27 răng giai đoạn trước khi tạo hình ống tủy(10) Theo nghiên cứu của Sjogren U và
cs, E faecalis xuất hiện ở 3/18 răng giai đoạn
Trang 8trước khi tạo hình ống tủy(16) Tỉ lệ này sẽ cao
hơn nếu mẫu bệnh phẩm lấy từ răng đã điều
trị nội nha và thất bại Theo nghiên cứu của
Ozbek S M và cs, có 32/43 điều trị tủy thất bại
có sự hiện diện của E faecalis(11)
So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ
tương nghiên cứu và dung dịch NaClO 3%
Trong mô hình nhiễm trùng ống tuỷ răng
ex vivo, việc khảo sát lượng vi khuẩn còn lại
ngay sau khi bơm rửa cho phép đánh giá tốc
độ sát khuẩn của các dung dịch bơm rửa,
trong khi việc tái đánh giá lượng vi khuẩn sau
7 ngày cho phép nhận định hiệu quả sát
khuẩn hoàn toàn của các dung dịch bơm rửa
Kết quả cho thấy, ngay sau khi bơm rửa,
nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu tiêu diệt
được 99,91% lượng vi khuẩn E faecalis trong
các răng, là thấp hơn có ý nghĩa (p < 0,05) so
với dung dịch đối chiếu NaClO 3%, khi dung
dịch này tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn
Điều này có thể được giải thích là do gốc OCl
có kích thước nhỏ và tính oxy hóa rất mạnh,
dễ dàng thấm qua các lớp tế bào và phá hủy
các thành phần của vi khuẩn một cách nhanh
chóng Trong khi đó, tinh dầu ở dạng nhũ
tương với các hoạt chất có kích thước lớn hơn,
nên việc tiếp xúc và thấm qua tế bào vi khuẩn
sẽ gặp hạn chế hơn rất nhiều Kết quả này là
tương tự với nghiên cứu trước đó của cùng
nhóm nghiên cứu(5), khi so sánh hiệu quả
kháng khuẩn ex vivo của hỗn hợp tinh dầu
tràm trà Úc (0,22% kl/kl) – hương nhu trắng
(0,13% kl/kl) – cồn 15% (kl/kl) và dung dịch
NaClO 2,5% cũng nhận thấy hiệu quả kháng
khuẩn của hỗn hợp này thấp hơn so với dung
dịch đối chiếu ngay sau khi bơm rửa (95,77%
so với 99,99%)
Kết quả tái đánh giá vi khuẩn sau 7 ngày
thể hiện được ưu điểm nhũ tương nghiên cứu
Nhũ tương nghiên cứu có khả năng tiêu diệt
được 99,00% lượng E faecalis so với ban đầu,
trong đó có 7/11 số ống tủy khảo sát không thể
phát hiện được vi khuẩn bằng phương pháp
đếm sống Trong khi đó, dung dịch NaClO 3% không tiêu diệt được hoàn toàn vi khuẩn (97,55%) trong ống tủy, 9/10 răng khảo sát đều
có vi khuẩn mọc trở lại sau 7 ngày Nhóm trắng bơm rửa bằng NaCl 0,9% chỉ làm giảm
vi khuẩn bằng cơ chế cơ học nên không có khả năng diệt hoàn toàn vi khuẩn với 11/11 răng
có vi khuẩn mọc lại sau 7 ngày Như vậy, tuy
có tốc độ sát khuẩn không nhanh bằng dung dịch NaClO, nhưng nhũ tương nghiên cứu có
khả năng ức chế vi khuẩn E faecalis kéo dài
Ngay cả sau khi thêm môi trường mới vào ống tủy, nồng độ của cồn và tinh dầu giảm xuống nhưng vẫn còn đủ khả năng ức chế vi khuẩn làm chúng không sinh trưởng được và bị tiêu diệt Ở nhóm đối chiếu, khi thêm môi trường mới vào, nồng độ các gốc OCl- giảm xuống
làm mất đi khả năng sát khuẩn Vi khuẩn E
faecalis sẽ phát triển trở lại và gây nhiễm ống
tủy tiếp tục và đây là nguyên nhân mà E
faecalis có thể sống sót trong điều kiện thực tế
và gây thất bại trong điều trị nội nha Kết quả thu được từ nghiên cứu cũng có sự đồng thuận với nghiên cứu của trước đó của cùng nhóm nghiên cứu(5), khi sử dụng hỗn hợp tinh dầu – cồn 15% cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn kéo dài khi tiêu diệt được hoàn toàn vi
khuẩn E faecalis trong 5/6 răng thử nghiệm so
với dung dịch NaClO 2,5%, khi dung dịch này không thể diệt hoàn vi khuẩn trong ống tủy với 6/6 răng tái nhiễm Nghiên cứu của Estrela
C và cs cũng phát hiện thấy E faecalis trong
11/16 răng sau khi điều trị ống tủy với dung dịch NaClO 0,5-2,5%(2) Nghiên cứu của cũng Priyank H và cs cho thấy khi tăng nồng độ của NaClO lên 4% hay phối hợp thêm các biện pháp khác như sử dụng siêu âm, phối hợp với dung dịch H2O2 3% cũng không tiêu diệt được
hoàn toàn E faecalis(13) Như vậy, sử dụng dung dịch NaClO được chứng minh qua nhiều nghiên cứu là không
hiệu quả trên E faecalis Điều này nói lên sự
cần thiết trong việc nghiên cứu phát triển một dung dịch bơm rửa nội nha mới có thể tiêu
Trang 9diệt được E faecalis và chống tái nhiễm sau khi
điều trị Nhũ tương nghiên cứu trong đề tài có
thể mở ra hướng đi mới cho vấn đề này Tuy
nhiên để nâng cao hơn nữa hiệu quả sát khuẩn
của nhũ tương nghiên cứu, cần thiết phải giảm
cỡ hạt nhũ bằng phương pháp bào chế để tăng
khả năng thấm vào tế bào cũng như đi đến
được các vị trí sâu trong chân răng để tiêu diệt
hoàn toàn vi khuẩn
KẾT LUẬN
Kết quả thu được của nghiên cứu cho thấy
tiềm năng của nhũ tương bơm rửa ống tủy
chứa hỗn hợp tinh dầu TTO và OG, có khả
năng thay thế các dung dịch bơm rửa ống tủy
cổ điển
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Agrawal Vineet S, Rajesh M, Sonali K, et al (2014) A
contemporary overview of endodontic irrigants–a review J
Dent App, 1 (6): pp.105-115.
2 Estrela C, Silva JA, et al (2008) Efficacy of sodium hypochlorite
and chlorhexidine against Enterococcus faecalis: a systematic
review Journal of Applied Oral Science, 16 (6): pp.364-368
3 Fukushima H., Yamamoto K et al (1998) Localization and
identification of Root Canal Bacteria in Clinically Asymptomatic
Periapical Pathosis Journal of Endodontic, 16 (11): 534-538
4 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Hồ Ánh Nguyệt, Lâm Thị Ngọc
Phương (2014) Tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm trà Úc
và hương nhu trắng trên các chủng vi khuẩn đề kháng
kháng sinh phân lập từ bệnh phẩm Chuyên Đề Dược, Y
học TP Hồ Chí Minh, Phụ bản 18(2): tr.209-215
5 Lê Tuấn Anh, Lê Văn An, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2018)
Khảo sát tác động kháng khuẩn của hỗn hợp tinh dầu tràm
trà Úc và hương nhu trắng trên các vi khuẩn gây nhiễm
trùng ống tủy Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh,
phụ bản 22 (1): tr.445-452
6 Lê Tuấn Anh, Nguyễn Thị Kim Loan, Huỳnh Thị Ngọc Lan
(2017), Khảo sát tác động kháng khuẩn của hỗn hợp tinh dầu
tràm trà Úc và hương nhu trắng trên vi khuẩn Enterococcus
faecalis gây viêm ống tủy răng Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ
Chí Minh, phụ bản 21 (1): tr.562-567
7 Love RM (2001) Enterococcus faecalis – a mechanism for its
role in endodontic failure International Endodontic Journal,
pp.34: 399-405
8 Nakamura VC, Cai S, Candeiro GTM, et al (2012) Ex
vivo evaluation of the effects of several root canal
preparation techniques and irrigation regimens on a mixed
microbial infection International Endodontic Journal, 46 (3):
pp.217 - 224
9 Nandakumar R, Mirchandani R, Fouad A (2007) Primer
sensitivity: can it influence the results in Enterococcus
faecalis prevalence studies? Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 103 (3):
pp.429-432
10 Nguyễn Thế Hạnh (2015) Nghiên cứu lâm sàng, vi khuẩn học và đánh giá hiệu quả sát khuẩn trong điều trị bệnh lý tủy rang thể loại BAUME IV bằng calcium hydroxide và camphorated parachlorophenol Viện nghiên cứu khoa học
y dược lâm sàng, tr.108
11 Ozbek SM, Ozbek A, Erdorgan AS (2009) Analysis of
Enterococcus faecalis in samples from Turkish patients with
primary endodontic infections and failed endodontic
treatment by real-time PCR SYBR green method Journal of
Applied Oral Science, 17: pp.370-374
12 Petersen PE (2003) The World Oral Health report 2003: continuous improvement of oral health in the 21st century - the approach of the WHO Global Oral Health Programme
Community Dent Oral Epidemiol, 31 (1): pp.3 –23
13 Riyank H, Pandey V, Bagul A, et al (2017) Evaluation of
4% Sodium Hypochlorite in eliminating Enterococcus
faecalis from the Root Canal when Used with Three
Irrigation Methods: An in vitro Study The journal of
contemporary dental practice, 18 (3): pp.214-217
14 Rôças IN, Siqueira JrJF, Santos KR (2004) Association of
Enterococcus faecalis with different forms of periradicular
diseases Journal of Endodontics 30 (5): pp.315-320
15 Siqueira JrJF, Rôças IN (2004) Polymerase chain reaction– based analysis of microorganisms associated with failed
endodontic treatment Oral Surgery, Oral Medicine, Oral
Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 97 (1): pp.85-94
16 Sjögren U, Figdor D, Spångberg L, et al (1991) The antimicrobial effect of calcium hydroxide as a short‐term
intracanal dressing International Endodontic Journal, 24 (3):
pp.119-125
17 Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, et al (2006)
Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure
and current concepts in retreatment Journal of Endodontics,
32 (2): pp.93-98
18 Wilson KH, Blitchington RB and Greene RC (1990) Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with
polymerase chain reaction J Clin Microbiol, 28: pp.1942-1946
Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019