Khảo sát tác động kháng khuẩn của nhũ dịch chứa tinh dầu tràm trà Úc và hương nhu trắng trên vi khuẩn Enterococcus faecalis gây viêm ống tuỷ răng

So sánh hiệu quả sát khuẩn in vitro của nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu với dung dịch NaClO 3% trên các vi khuẩn E. faecalis phân lập từ lâm sàng. So sánh hiệu quả sát khuẩn ex vivo của nhũ dịch bơm rửa với dung dịch NaClO 3% trên mô hình viêm ống tủy răng do E. faecalis.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG KHUẨN CỦA NHŨ DỊCH CHỨA TINH DẦU TRÀM TRÀ ÚC VÀ HƯƠNG NHU TRẮNG TRÊN VI KHUẨN ENTEROCOCCUS FAECALIS GÂY VIÊM ỐNG TUỶ RĂNG Hà Đan Phương*, Lê Tuấn Anh* TÓM TẮT Mở đầu: Enterococcus faecalis nguyên nhân hàng đầu gây thất bại điều trị nội nha Dung dịch bơm rửa ống tuỷ sử dụng phổ biến dung dịch NaClO 3% cho hiệu tốt lại có nhiều nhược điểm có mùi khó chịu, gây kích ứng nơi tiếp xúc, gây mòn men khả diệt vi khuẩn khơng hồn tồn Các nghiên cứu trước Bộ mơn Vi ký sinh, khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh bào chế nhũ tương bơm rửa chứa phối hợp tinh dầu tràm trà Úc (TTO) hương nhu trắng (OG) để ứng dụng làm dung dịch bơm rửa ống tủy điều trị viêm ống tủy cho hiệu sát khuẩn nhiều vi khuẩn gây bệnh miệng tương đương với dung dịch NaClO 3% mô hình in vitro Để tiếp tục mở rộng đề tài, tác dụng sát khuẩn in vitro chủng E faecalis lâm sàng tác dụng sát khuẩn ex vivo nhũ dịch tinh dầu so sánh với dung dịch NaClO 3% Mục tiêu: So sánh hiệu sát khuẩn in vitro nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu với dung dịch NaClO 3% vi khuẩn E faecalis phân lập từ lâm sàng So sánh hiệu sát khuẩn ex vivo nhũ dịch bơm rửa với dung dịch NaClO 3% mơ hình viêm ống tuỷ E faecalis Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Vi khuẩn thử nghiệm: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Mẫu bệnh phẩm mẫu nhổ bỏ thu thập từ Răng Hàm Mặt Trung ương TP Hồ Chí Minh Chất thử nghiệm: tinh dầu TTO OG, dung dịch NaOCl 3% Phương pháp nghiên cứu: Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm phương pháp nuôi cấy Các chủng E faecalis định danh kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Khảo sát tác động sát khuẩn in vitro nhũ tương chứa hỗn hợp TTO OG chủng E faecalis phân lập So sánh hiệu nhũ tương với dung dịch natri hypoclorid 3% Khảo sát tác động sát khuẩn ex vivo nhũ tương mô hình nhiễm khuẩn ống tủy E faecalis So sánh hiệu nhũ tương với dung dịch natri hydroclorid 3% Kết quả: Đã phân lập định danh 15 chủng E faecalis từ 80 mẫu bệnh phẩm Thử nghiệm khả sát khuẩn in vitro chủng E faecalis phân lập từ lâm sàng cho thấy hiệu tương đương nhũ dịch bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu dung dịch đối chiếu natri hypochlorite 3% Thử nghiệm ex vivo mô hình viêm ống tủy E faecalis cho thấy nhũ dịch nghiên cứu cho hiệu sát khuẩn chậm cho tác dụng kéo dài hơn, giảm thiểu nguy tái nhiễm trùng so với dung dịch NaClO 3% Kết luận: Kết thu nghiên cứu cho thấy tiềm nhũ tương bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu TTO OG, có khả thay dung dịch bơm rửa ống tủy cổ điển Từ khóa: Tinh dầu tràm trà Úc, tinh dầu hương nhu trắng, NaOCl, nhiễm trùng ống tủy, sâu răng, Enterococcus faecalis * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Lê Tuấn Anh ĐT: 0779784030 Email: letuananh@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược 61 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 ABSTRACT STUDY ON THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF THE EMULSION CONTAINING TEA TREE OIL AND OCIMUM GRATISSIMUM ESSENTIAL OIL ON ENTEROCOCCUS FAECALIS CAUSING ENDODONTIC INFECTION Ha Dan Phuong, Le Tuan Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 61 – 69 Background: Enterococcus faecalis is one of the major causes of failure in endodontic infection treatment Sodium hypochlorite 3% solution (NaOCl) has been the most commonly irrigant for preparing infected root canals However, this solution could exert some undesirable effects including tissue toxicity at the exposed sites and eroding enamel for long exposure as well as incompletely killing of bacteria From former experiments, we had successfully formulated a emulsion containing mixture of tee trea oil (TTO) and Ocimum gratissimum essential oil (OG) that showed the same antibacterial effect with NaClO 3% solution on various pathogen that cause endodontic infection, in vitro In order to expand the application of this emulsion, we further compare the bactericidal effect of the studied emulsion with NaOCl 3% solution on E faecalis isolated from clinical specimen, as well as on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis Objectives: Compare the bactericidal effect of the emulsion contain mixture of TTO and OG with NaClO 3% solution on E faecalis isolated from clinical samples Compare the antibacterial effect of the study emulsion on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis Materials and methods: Tested microbes: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Streptococcus mutans ATCC 35668 Clinical samples: Decayed teeth after tooth extraction procedure, taken from Dental Hospital of Central Ho Chi Minh city Subtances: tea tree oil, Ocimum gratissimum essential oil, sodium hypoclorite 3% solution Methods: Isolate Enterococcus faecalis from decayed teeths obtained from patients Compare the in vitro bactericidal effect of studied emulsion to NaOCl 3% solution on isolated E faecalis Compare the antibacterial effect of the studied emulsion to NaOCl 3% on ex vivo model of endodontic infection by E faecalis Results: Among 80 samples taken from Dental Hospital of Central Ho Chi Minh city, E faecalis was dectected in 15 samples In in vitro test, the studied emulsion exhibited the same bactericidal effect to the NaClO 3% solution In ex vivo model, the studied emulsion could not eliminate E faecalis as fast as the NaClO solution did In contrast, the studied emulsion showed long-lasting effect and reduced the amount of re-infection teeth compare to the NaClO 3% solution Conclusion: The result of this study showed that the emulsion containing TTO and OG could be a promising irrigant to replace NaClO and others in fighting root canal infection Keywords: Endodontic infections, Enterococcus faecalis, Irrigants, Tea tree oil, Ocimum gratissimum essential oil nha chu xem gánh nặng sức khỏe ĐẶT VẤNĐỀ miệng hàng đầu(12) Hệ vi khuẩn Sức khỏe miệng phần quan miệng nguyên nhân dẫn đến bệnh trọng sức khỏe người Theo thống kê nhiễm trùng nội nha, đó, nhiễm trùng Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh miệng nội nha tiên phát chủ yếu gây vi khuẩn xếp hàng thứ tư số bệnh lý có chi phí kỵ khí bắt buộc vi khuẩn kỵ khí khơng bắt điều trị cao nhất, đó, sâu bệnh 62 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 buộc Vi khuẩn kỵ khí bắt buộc dễ dàng bị loại bỏ giảm thiểu số lượng thiết bị dung dịch bơm rửa nội nha Ngược lại, vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc sống sót môi trường khắc nghiệt kháng nhiều phương pháp điều trị Nhiễm trùng nội nha thứ phát thất bại điều trị nội nha thường vi khuẩn tồn ống tủy chân sau trám bít tủy gây nên Trong số tác nhân gây nhiễm trùng nội nha, Enterococcus faecalis tìm thấy 4-40% trường hợp nhiễm trùng nội nha tiên phát(14) tăng lên đến 30-90% nhiễm trùng nội nha thứ phát(17) Vi khuẩn xem nguyên nhân hàng đầu gây thất bại điều trị nội nha khả kháng dung dịch bơm rửa khả sống sót cao, đơn lẻ khơng cần hỗ trợ loài vi khuẩn khác(7) Hiện nay, có nhiều dung dịch bơm rửa nội nha sử dụng lâm sàng natri clorid, hydroperoxid 3%, clorohexidin… nhiên phổ biến natri hypoclorid (NaClO) Ở nồng độ sử dụng 2,5% - 5,25%, NaOCl cho hiệu sát khuẩn cao khả làm mô bị hoại tử tốt Tuy nhiên, NaClO có mùi khó chịu, tác dụng sát khuẩn bị giảm tiếp xúc với dịch viêm có tính acid Khi sử dụng nồng độ cao thời gian dài, NaClO ảnh hưởng đến độ bền độ đàn hồi lớp ngà nguyên nhân gây vỡ thân dung dịch có khả hồ tan ion calci ngà răng(1) Ngoài ra, rửa ống tủy, dung dịch dễ bị đẩy ngồi kích thích vùng nha chu quanh chóp hay làm bỏng niêm mạc miệng Do đó, việc nghiên cứu dung dịch bơm rửa nội nha có tác dụng tương đương tốt NaOCl mà không gây tác dụng phụ vấn đề quan tâm Tinh dầu Hương nhu trắng Tràm trà Úc từ lâu biết đến với tác dụng sát khuẩn mạnh Các nghiên cứu Bộ môn Vi – Ký sinh cho thấy phối hợp hai loại tinh dầu Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học cho tác dụng cộng lực nhiều loại vi khuẩn(4,6) Lê Văn An (2017) xây dựng tối ưu hóa thành cơng cơng thức nhũ tương phối hợp hai loại tinh dầu cho hiệu sát khuẩn in vitro tốt nhiều vi khuẩn gây bệnh miệng, tương đương với dung dịch NaClO 3%(5) Tuy vậy, nhũ tương thử nghiệm chủng vi khuẩn chuẩn in vitro cần đánh giá hoạt tính vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm thử nghiệm mơ hình dược lý có độ tin cậy cao ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Vi sinh vật Enterococcus faecalis ATCC Streptococcus mutans ATCC 35668 29212, Chất thử nghiệm Nhũ tương chứa 0,45% (kl/kl) tinh dầu Tràm trà Úc (TTO); 0,13% (kl/kl) tinh dầu Hương nhu trắng (OG) (5) Dung dịch NaClO 3% Phương pháp nghiên cứu Mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm thu thập khu điều trị kỹ thuật cao, bệnh viện Răng Hàm Mặt Trung Ương TP Hồ Chí Minh Các lựa chọn cối, trưởng thành, ống tuỷ nguyên vẹn Sát trùng xung quanh vùng nhổ dung dịch H2O2 3% NaClO 2,5%, trung hòa dung dịch Na2S2O3 5% Răng sau nhổ, chuyển vào ống falcon có nút vặn chứa mơi trường Streptococcus faecalis Broth (SF broth) vô trùng, lưu giữ nhiệt độ lạnh 10oC Chuyển phòng thí nghiệm để xử lý vòng giờ Phân lập vi khuẩn Mẫu đươc làm vỡ cách cho tiếp xúc nhanh với nitơ lỏng đập mạnh chày cối cho mảnh vỡ thành mảnh kích thước khoảng mm Chuyển toàn 63 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 mảnh vỡ vào môi trường SF broth, vortex mạnh ủ 37oC vòng giờ để hồi phục vi khuẩn mẫu(Error! Reference source not found.) Pha loãng cấp 10 liên tiếp cấp độ môi trường SF broth Hút 100 μl từ cấp pha loãng trải lên đĩa thạch chứa môi trường thạch máu, ủ đĩa 37oC, điều kiện vi hiếu khí Sau 48 giờ, quan sát mọc khóm vi khuẩn đĩa bắt lấy khóm vi khuẩn có đặc tính chi Enterococcus: cầu khuẩn gram dương, dạng chuỗi ngắn, huyết giải  , có phản ứng catalase âm, Pyrrolidonyl Arylamidase (PYR) test dương bile esculin dương Định danh vi khuẩn Chiết tách ADN nhiễm sắc thể Phân lập vi khuẩn bắt giữ bước lên thạch máu, sau đó, chuyển khóm vi khuẩn thu vào mơi trường Tryptic Soy Broth (TSB), ủ 37oC 18 giờ Tiến hành chiết tách ADN nhiễm sắc thể vi khuẩn theo phương pháp SDS-KOAc Khuếch đại đoạn gen 16S rADN Sử dụng cặp mồi phổ quát (mồi xuôi, 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' ngược, 5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3')(18) Chương trình nhiệt thiết lập cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC phút; biến tính 95oC 45 giây; bắt cặp 55oC 45 giây; tổng hợp 72oC phút; bước tổng hợp cuối 72oC 10 phút Kiểm tra sản phẩm PCR phương pháp điện di gel agarose 1%, sản phẩm mong muốn có kích thước 1505 bp tinh chế kit hãng ABM (Mỹ) theo quy trình nhà sản xuất Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu E faecalis Khuếch đại đoạn gen đặc hiệu có kích thước 310 bp từ gen 16S rADN, đó, mồi xi EF-F có trình tự 5’-GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG AG-3’ nằm vị trí base thứ 165 đến 187 gen 16S rARN E faecalis 64 (mã số truy cập Y18293 GenBank) mồi ngược EF-R có trình tự 5’-CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’ nằm vị trí base thứ 457 đến 474 gen 16S rARN E faecalis (mã số truy cập Y18293 GenBank)(9) Chương trình nhiệt thiết lập cho 30 chu kỳ, gồm: biến tính khởi đầu 95oC phút; biến tính 95oC 30 giây; bắt cặp 60oC phút; tổng hợp 72oC phút; bước tổng hợp cuối 72oC phút Mẫu chứng dương sản phẩm PCR đoạn 16S rARN E faecalis ATCC 29212, chứng âm sản phẩm PCR đoạn 16S rARN Streptococcus mutans ATCC 35668 Vi khuẩn xác định E faecalis kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% thu băng ADN kích thước 310 bp Chuẩn bị vi sinh vật cho thử nghiệm tính kháng khuẩn nhũ tương nghiên cứu Phân lập vi khuẩn E faecalis lên môi trường Tryptic soy agar (TSA) Chuyển 3-5 khóm vi khuẩn phân lập sang ống nghiệm chứa môi trường TSB, ủ 37oC 2-6 giờ Hiệu chỉnh mật độ vi sinh vật khoảng 1-3.108 CFU/mL cách đo OD bước sóng 625 nm, với cóng đo cm đạt khoảng 0,08-0,1 Sau đó, pha lỗng mật độ 107 CFU/mL dung dịch đệm phosphat (PBS) vô trùng Vi khuẩn sau chuẩn bị xong phải đưa vào thử nghiệm vòng 15 phút Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro nhũ tương nghiên cứu chủng E faecalis phân lập từ bệnh phẩm Hút 500 L huyền trọc E faecalis mật độ 10 CFU/mL phân lập từ lâm sàng cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nhũ tương nghiên cứu, dung dịch NaClO 3% dung dịch PBS Vortex mạnh để trộn Sau 60 giây tiếp xúc, đếm số lượng vi khuẩn sống lại ống phương pháp đếm Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 sống môi trường Streptococcus faecalis agar (SF agar) Thử nghiệm lặp lại lần Tạo mơ hình viêm ống tủy E faecalis Dựa mơ hình mơ tả Nakamura C.V, cs(8), có điều chỉnh lượng vi sinh vật nạp vào mẫu Các mẫu sau thu nhận sẽ làm với 100 mL nước cất Sau làm đồng chiều dài dung tích làm việc ống tủy máy trâm quay Protaper Universal (Dentsply Maillefer) với trâm SX, S1, F1, F2, F3, F4 Rửa ống tủy nước cất Dùng composite resin trám chặt vùng lỗ chóp chân răng, để khô Chôn cố định vào eppendorf mL, đậy chặt nắp tiệt trùng 121oC 20 phút Bơm 10 μL huyền trọc vi khuẩn E faecalis mật độ 108 CFU/mL vào ống tủy Dùng trâm K-file #15 vô khuẩn đưa tới lui ống tủy để huyền trọc vi khuẩn đến chóp Ủ mẫu 37oC Sau 24 giờ, thêm vào ống tủy 50 μL môi trường Brain Heart Infusion broth (BHI) Nuôi mẫu liên tục ngày Xác định lượng vi khuẩn ống tủy Dùng giấy vơ khuẩn #20 có chiều dài tương ứng với chiều dài làm việc đặt vào ống tủy, để yên phút Chuyển côn giấy vào eppendorf chứa sẵn mL dung dịch NaCl 0,9% vô khuẩn, vortex mạnh phút Đếm số lượng vi khuẩn sống có eppendorf phương pháp đếm sống môi trường SF agar So sánh hiệu sát khuẩn ex vivo E faecalis nhũ dịch nghiên cứu dung dịch NaClO 3% Sau thời gian nuôi cấy, phân chia ngẫu nhiên thành ba nhóm, nhóm 13 Tiến hành xác định số lượng vi khuẩn nhóm trước rửa (T0) Sau đó, nhóm bơm rửa nhũ dịch nghiên cứu dung Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học dịch NaClO 3% NaCl 0,9% theo quy trình sau: Dùng bơm tiêm hút mL dung dịch bơm rửa Đặt kim bơm vào vừa chặt ống tủy, lùi lại khoảng 1,0 mm Bơm nhẹ với vận tốc mL/phút Thao tác bơm rửa thực lần Xác định số lượng vi khuẩn ống tủy nhóm sau bơm rửa (T1) Tiếp tục bơm 50 μL môi trường BHI vào ống tủy, ủ mẫu 37o Sau 24 giờ, thêm vào ống tủy 50 μL môi trường BHI Nuôi mẫu liên tục ngày Xác định số lượng vi khuẩn ống tủy nhóm sau ngày (T2) Từ giá trị T0, T1, T2, xác định phần trăm lượng vi khuẩn giảm ống tủy nhóm sau rửa sau ngày So sánh phần trăm lượng vi khuẩn bị tiêu diệt trung bình nhóm phép kiểm T-test qua phần mềm Microsoft Excel 2016 KẾT QUẢ Phân lập vi khuẩn E faecalis từ mẫu bệnh phẩm Từ 80 mẫu thu thập được, phân lập 40 mẫu cầu khuẩn có đặc điểm thỏa mãn đặc tính nhóm Enterococci khóm huyết giải  ; cầu khuẩn gram dương, xếp thành chuỗi ngắn; phản ứng catalase âm tính, PYR dương tính phản ứng Bile esculin dương tính Tiến hành chiết tách khuếch đại đoạn gen 16S rARN từ 40 mẫu sử dụng cặp mồi phổ quát Sau tinh chế sản phẩm 16S rADN trên, chúng tơi tiếp tục khuếch đại trình tự đặc hiệu E faecalis sử dụng cặp mồi EF-F: 5’-GTT TAT GCC GCA TGG CAT AAG AG-3’ EF-R: 5’CCG TCA GGG GAC GTT CAG-3’ Kết quả, chứng dương E faecalis ATCC 29212 cho băng ADN kích thước 310 bp, chứng âm Streptococcus mutans ATCC 35668 mẫu 65 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 trắng (khơng có ADN khn mẫu) khơng cho thước 310 bp xác định E faecalis Như băng ADN Từ đó, 15 chủng liên cầu cho tỷ lệ E faecalis phân lập định danh kết khuếch đại băng ADN kích từ lâm sàng 15/80 mẫu chiếm 18,75% 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 500 bp 300 bp 200 bp E23 E25 E34 E1 E2 E6 E13 E21 Hình 1: Kết PCR khuếch đại đoạn 310 bp E faecalis từ số mẫu bệnh phẩmGiếng 1: 100bp Opti-DNA Marker; Giếng 2: mẫu E faecalis ATCC 29212 (chứng dương); Giếng 3: mẫu S mutans ATCC 35668 (chứng âm); Giếng – 20: số mẫu bệnh phẩm; Giếng 21: mẫu trắng toàn sau 60 giây tiếp xúc 15 chủng vi Khảo sát tác động kháng khuẩn in vitro khuẩn E faecalis phân lập định danh từ nhũ tương nghiên cứu chủng E mẫu bệnh phẩm tương đương với dung dịch faecalis phân lập từ bệnh phẩm đối chứng NaClO 3% Kết đếm sống cho thấy, nhũ tương bơm rửa ống tủy cho hiệu sát khuẩn hoàn Bảng 1: Số lượng vi khuẩn nhóm sau cho tiếp xúc với dịch thử nghiệm 60 giây STT 10 11 12 13 14 15 Mẫu trắng (x105 CFU) 2,12 3,50 2,52 4,86 1,34 4,00 4,15 3,20 1,04 2,32 1,05 2,70 2,31 1,15 4,08 Lượng vi khuẩn (CFU/ml) Nhũ dịch bơm rửa Lượng % diệt < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 Dung dịch hyposol 3% Lượng % diệt < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 < 10 > 99,99 Ghi chú: Các mẫu khơng có vi khuẩn mọc trở lại biểu diễn có 10 CFU/răng (giới hạn phát phương pháp đếm sống nghiên cứu này) Tạo mơ hình viêm ống tuỷ E faecalis Sau tạo mơ hình, lượng vi khuẩn E.faecalis trung bình từ nhóm (nhóm trắng, nhóm thử nhóm chứng) thời điểm ban đầu thể qua bảng Số lượng vi 66 khuẩn ban đầu nhóm khác khơng có ý nghĩa thống kê p > 0,05 So sánh hiệu sát khuẩn ex vivo E faecalis nhũ dịch nghiên cứu dung dịch NaClO 3% Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Sau bơm rửa ống tuỷ dung dịch, số lượng vi khuẩn đếm nhóm thể qua bảng Như vậy, nhũ tương nghiên cứu có khả tiêu diệt 99,90% lượng vi khuẩn sau bơm rửa, thấp có ý nghĩa (p < 0,05) so với Nhóm đối chiếu (NaClO 3%) dung dịch tiêu diệt Nghiên cứu Y học 99,99% lượng vi khuẩn với 10/10 mẫu không phát vi sinh vật mọc trở lại phương pháp đếm sống Trong đó, mẫu trắng bơm rửa dung dịch NaCl 0,9% làm giảm (do rửa trôi học) 83,36% lượng E faecalis, thấp nhóm thử nghiệm (p < 0,05) Bảng 2: Thống kê số lượng vi khuẩn nhóm thử nghiệm Sớ (n) (*) Sớ vi khuẩn trung bình (x103 CFU/ml) % giảm Sớ có vi khuẩn mọc lại Nhóm trắng NaCl 0,9% To T1 11 11 134,36 25,68   33,70 7,21 83,36  2,11 11/11 11/11 T2 11 51,98  16,29 61,31  8,59 Nhóm thử Nhũ tương bơm rửa To T1 T2 11 11 11 154,55 0,14 1,72    36,21 0,10 1,25 99,90 99,00   0,18 1,26 Nhóm đối chiếu NaClO 3% To T1 10 10 158,77 < 0,001  (**) 38,46 - > 99,99 11/11 11/11 10/10 0/10 7/11 4/11 T2 10 3,88  3,63 97,55  1,43 9/10 Ghi chú: (*) Số lượng thực tế nhóm sau loại bỏ sai số thô, (**) Các không phát vi khuẩn biểu diễn có 10 CFU/răng (giới hạn phát phương pháp đếm sống nghiên cứu này) Sau ngày, mẫu trắng làm giảm 61,31% lượng vi khuẩn so với ban đầu, 11/11 có vi khuẩn mọc trở lại Mẫu thử bơm rửa nhũ dịch tinh dầu làm giảm 99,00% lượng vi khuẩn so với ban đầu, với 4/11 có vi khuẩn mọc trở laị Mẫu đối chiếu làm giảm 97,55% lượng vi khuẩn so với ban đầu có 9/10 có vi khuẩn mọc trở lại Như vậy, nhũ dịch tinh dầu nghiên cứu cho khả ức chế vi khuẩn kéo dài ngăn ngừa tái nhiễm tốt so với dung dịch NaClO 3% (p < 0,05) BÀNLUẬN Phân lập vi khuẩn E faecalis từ mẫu bệnh phẩm Định danh vi sinh vật gây nhiễm trùng nội nha kỹ thuật PCR khuyếch đại đoạn 16S 23S rADN chứng minh có độ nhạy hiệu phương pháp ni cấy Enterococcus faecalis xác định phương pháp PCR nhiều đoạn mồi khác khuếch đại đoạn gen tuf dài 112 bp (phiên mã cho yếu tố nối dài EF-Tu), Chuyên Đề Dược đoạn gen 16S rARN đặc hiệu cho E faecalis đoạn 310 bp (base thứ 165 - 474 gen 16S rADN E faecalis, GenBank accession no Y18293) 138 bp (base thứ 51 - 188 gen 16S rADN E faecalis, GenBank accession no Y18293)(9) Cặp mồi khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 310 bp sử dụng để xác định E faecalis đề tài có độ nhạy khơng cao cặp mồi khuếch đại gen tuf nhiên lại cho độ đặc hiệu cao hơn(9) Ngồi ra, tính đặc hiệu đoạn mồi chứng minh qua nghiên cứu Siqueira cs thử nghiệm với ADN lồi khác(15) Do đó, chúng tơi sử dụng cặp mồi để xác định vi khuẩn E faecalis Sau định danh cặp mồi đặc hiệu, kết cho thấy 80 sâu thu nhận có 15 có diện E faecalis, chiếm 18,75% Tỉ lệ tương tự với nghiên cứu Việt Nam giới Theo nghiên cứu Nguyễn Thế Hạnh cs, E faecalis xuất 7/27 giai đoạn trước tạo hình ống tủy(10) Theo nghiên cứu Sjogren U cs, E faecalis xuất 3/18 giai đoạn 67 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 trước tạo hình ống tủy(16) Tỉ lệ sẽ cao mẫu bệnh phẩm lấy từ điều trị nội nha thất bại Theo nghiên cứu Ozbek S M cs, có 32/43 điều trị tủy thất bại có diện E faecalis(11) So sánh hiệu sát khuẩn ex vivo nhũ tương nghiên cứu dung dịch NaClO 3% Trong mơ hình nhiễm trùng ống tuỷ ex vivo, việc khảo sát lượng vi khuẩn lại sau bơm rửa cho phép đánh giá tốc độ sát khuẩn dung dịch bơm rửa, việc tái đánh giá lượng vi khuẩn sau ngày cho phép nhận định hiệu sát khuẩn hoàn toàn dung dịch bơm rửa Kết cho thấy, sau bơm rửa, nhũ tương chứa hỗn hợp tinh dầu tiêu diệt 99,91% lượng vi khuẩn E faecalis răng, thấp có ý nghĩa (p < 0,05) so với dung dịch đối chiếu NaClO 3%, dung dịch tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn Điều giải thích gốc OCl có kích thước nhỏ tính oxy hóa mạnh, dễ dàng thấm qua lớp tế bào phá hủy thành phần vi khuẩn cách nhanh chóng Trong đó, tinh dầu dạng nhũ tương với hoạt chất có kích thước lớn hơn, nên việc tiếp xúc thấm qua tế bào vi khuẩn sẽ gặp hạn chế nhiều Kết tương tự với nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu(5), so sánh hiệu kháng khuẩn ex vivo hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc (0,22% kl/kl) – hương nhu trắng (0,13% kl/kl) – cồn 15% (kl/kl) dung dịch NaClO 2,5% nhận thấy hiệu kháng khuẩn hỗn hợp thấp so với dung dịch đối chiếu sau bơm rửa (95,77% so với 99,99%) Kết tái đánh giá vi khuẩn sau ngày thể ưu điểm nhũ tương nghiên cứu Nhũ tương nghiên cứu có khả tiêu diệt 99,00% lượng E faecalis so với ban đầu, có 7/11 số ống tủy khảo sát phát vi khuẩn phương pháp 68 đếm sống Trong đó, dung dịch NaClO 3% khơng tiêu diệt hồn tồn vi khuẩn (97,55%) ống tủy, 9/10 khảo sát có vi khuẩn mọc trở lại sau ngày Nhóm trắng bơm rửa NaCl 0,9% làm giảm vi khuẩn chế học nên khơng có khả diệt hồn tồn vi khuẩn với 11/11 có vi khuẩn mọc lại sau ngày Như vậy, có tốc độ sát khuẩn khơng nhanh dung dịch NaClO, nhũ tương nghiên cứu có khả ức chế vi khuẩn E faecalis kéo dài Ngay sau thêm môi trường vào ống tủy, nồng độ cồn tinh dầu giảm xuống đủ khả ức chế vi khuẩn làm chúng không sinh trưởng bị tiêu diệt Ở nhóm đối chiếu, thêm môi trường vào, nồng độ gốc OCl- giảm xuống làm khả sát khuẩn Vi khuẩn E faecalis sẽ phát triển trở lại gây nhiễm ống tủy tiếp tục nguyên nhân mà E faecalis sống sót điều kiện thực tế gây thất bại điều trị nội nha Kết thu từ nghiên cứu có đồng thuận với nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu(5), sử dụng hỗn hợp tinh dầu – cồn 15% cho thấy khả kháng khuẩn kéo dài tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn E faecalis 5/6 thử nghiệm so với dung dịch NaClO 2,5%, dung dịch khơng thể diệt hồn vi khuẩn ống tủy với 6/6 tái nhiễm Nghiên cứu Estrela C cs phát thấy E faecalis 11/16 sau điều trị ống tủy với dung dịch NaClO 0,5-2,5%(2) Nghiên cứu Priyank H cs cho thấy tăng nồng độ NaClO lên 4% hay phối hợp thêm biện pháp khác sử dụng siêu âm, phối hợp với dung dịch H2O2 3% khơng tiêu diệt hồn tồn E faecalis(13) Như vậy, sử dụng dung dịch NaClO chứng minh qua nhiều nghiên cứu không hiệu E faecalis Điều nói lên cần thiết việc nghiên cứu phát triển dung dịch bơm rửa nội nha tiêu Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 diệt E faecalis chống tái nhiễm sau điều trị Nhũ tương nghiên cứu đề tài mở hướng cho vấn đề Tuy nhiên để nâng cao hiệu sát khuẩn nhũ tương nghiên cứu, cần thiết phải giảm cỡ hạt nhũ phương pháp bào chế để tăng khả thấm vào tế bào đến vị trí sâu chân để tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn 10 KẾT LUẬN 11 Kết thu nghiên cứu cho thấy tiềm nhũ tương bơm rửa ống tủy chứa hỗn hợp tinh dầu TTO OG, có khả thay dung dịch bơm rửa ống tủy cổ điển 12 TÀI LIỆU THAMKHẢO 13 Agrawal Vineet S, Rajesh M, Sonali K, et al (2014) A contemporary overview of endodontic irrigants–a review J Dent App, (6): pp.105-115 Estrela C, Silva JA, et al (2008) Efficacy of sodium hypochlorite and chlorhexidine against Enterococcus faecalis: a systematic review Journal of Applied Oral Science, 16 (6): pp.364-368 Fukushima H., Yamamoto K et al (1998) Localization and identification of Root Canal Bacteria in Clinically Asymptomatic Periapical Pathosis Journal of Endodontic, 16 (11): 534-538 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Hồ Ánh Nguyệt, Lâm Thị Ngọc Phương (2014) Tính kháng khuẩn tinh dầu tràm trà Úc hương nhu trắng chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh phân lập từ bệnh phẩm Chuyên Đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh, Phụ 18(2): tr.209-215 Lê Tuấn Anh, Lê Văn An, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2018) Khảo sát tác động kháng khuẩn hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc hương nhu trắng vi khuẩn gây nhiễm trùng ống tủy Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh, phụ 22 (1): tr.445-452 Lê Tuấn Anh, Nguyễn Thị Kim Loan, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2017), Khảo sát tác động kháng khuẩn hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc hương nhu trắng vi khuẩn Enterococcus faecalis gây viêm ống tủy Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh, phụ 21 (1): tr.562-567 Love RM (2001) Enterococcus faecalis – a mechanism for its role in endodontic failure International Endodontic Journal, pp.34: 399-405 Nakamura VC, Cai S, Candeiro GTM, et al (2012) Ex vivo evaluation of the effects of several root canal Chuyên Đề Dược 14 15 16 17 18 Nghiên cứu Y học preparation techniques and irrigation regimens on a mixed microbial infection International Endodontic Journal, 46 (3): pp.217 - 224 Nandakumar R, Mirchandani R, Fouad A (2007) Primer sensitivity: can it influence the results in Enterococcus faecalis prevalence studies? Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 103 (3): pp.429-432 Nguyễn Thế Hạnh (2015) Nghiên cứu lâm sàng, vi khuẩn học đánh giá hiệu sát khuẩn điều trị bệnh lý tủy rang thể loại BAUME IV calcium hydroxide camphorated parachlorophenol Viện nghiên cứu khoa học y dược lâm sàng, tr.108 Ozbek SM, Ozbek A, Erdorgan AS (2009) Analysis of Enterococcus faecalis in samples from Turkish patients with primary endodontic infections and failed endodontic treatment by real-time PCR SYBR green method Journal of Applied Oral Science, 17: pp.370-374 Petersen PE (2003) The World Oral Health report 2003: continuous improvement of oral health in the 21st century the approach of the WHO Global Oral Health Programme Community Dent Oral Epidemiol, 31 (1): pp.3 –23 Riyank H, Pandey V, Bagul A, et al (2017) Evaluation of 4% Sodium Hypochlorite in eliminating Enterococcus faecalis from the Root Canal when Used with Three Irrigation Methods: An in vitro Study The journal of contemporary dental practice, 18 (3): pp.214-217 Rụỗas IN, Siqueira JrJF, Santos KR (2004) Association of Enterococcus faecalis with different forms of periradicular diseases Journal of Endodontics 30 (5): pp.315-320 Siqueira JrJF, Rụỗas IN (2004) Polymerase chain reaction based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology, 97 (1): pp.85-94 Sjögren U, Figdor D, Spångberg L, et al (1991) The antimicrobial effect of calcium hydroxide as a short‐term intracanal dressing International Endodontic Journal, 24 (3): pp.119-125 Stuart CH, Schwartz SA, Beeson TJ, et al (2006) Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment Journal of Endodontics, 32 (2): pp.93-98 Wilson KH, Blitchington RB and Greene RC (1990) Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction J Clin Microbiol, 28: pp.1942-1946 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 69 ... Kim Loan, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2017), Khảo sát tác động kháng khuẩn hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc hương nhu trắng vi khuẩn Enterococcus faecalis gây vi m ống tủy Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí... Tuấn Anh, Lê Văn An, Huỳnh Thị Ngọc Lan (2018) Khảo sát tác động kháng khuẩn hỗn hợp tinh dầu tràm trà Úc hương nhu trắng vi khuẩn gây nhiễm trùng ống tủy Chuyên đề Dược, Y học TP Hồ Chí Minh,... nha có tác dụng tương đương tốt NaOCl mà không gây tác dụng phụ vấn đề quan tâm Tinh dầu Hương nhu trắng Tràm trà Úc từ lâu biết đến với tác dụng sát khuẩn mạnh Các nghiên cứu Bộ môn Vi – Ký