Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát tác dụng kháng salmonella và shigella của một số dẫn chất chalcon dị vòng tổng hợp được và khả năng phối hợp với kháng sinh trên các chủng vi khuẩn nêu trên.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG SALMONELLA VÀ SHIGELLA CỦA MỘT SỐ PHỐI HỢP CHALCON DỊ VÒNG VÀ KHÁNG SINH Trần Hồng Thoại Nga*, Nguyễn Thị Cẩm Vi **, Trần Cát Đơng*, Trần Thành Đạo* TĨM TẮT Mở đầu: Flavonoid hợp chất gần thường nhắc đến khả kháng khuẩn hiệp đồng với kháng sinh ức chế phát triển nhiều vi khuẩn đề kháng Trong chalcon nhóm phụ flavonoid, có nhiều dẫn chất báo cáo có tác dụng sinh học đa dạng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa,… Mục tiêu: Khảo sát tác dụng kháng Salmonella Shigella số dẫn chất chalcon dị vòng tổng hợp khả phối hợp với kháng sinh chủng vi khuẩn nêu Phương pháp: Tác động kháng khuẩn flavonoid khảo sát phương pháp khuếch tán đĩa thạch Tác động hiệp đồng kháng khuẩn flavonoid với kháng sinh định tính phương pháp khuếch tán thạch đĩa Định lượng khả hiệp đồng kháng khuẩn flavonoid với kháng sinh Salmonella Shigella phương pháp bàn cờ Kết quả: Các dẫn xuất chalcon dị vòng F4 F5 phối hợp với kháng sinh doxycylin cefuroxin có tác dụng hiệp đồng Salmonella Ngoài ra, phối hợp F4 doxycyclin; F4 cefuroxim; F5 doxycyclin có tác dụng hiệp đồng Shigella Kết luận: Đã tổng hợp số chất chalcon có tác động kháng khuẩn Salmonella Shigella, có hai chất chalcon dị vòng F4 F5 có tiềm hiệp đồng với kháng sinh hai vi khuẩn Từ khóa: Chalcon, kháng sinh, tác dụng hiệp đồng, phương pháp bàn cờ ABSTRACT INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITIES OF SOME COMBINATIONS OF HETEROCYCLIC CHALCONE AND ANTIBIOTIC AGAINST SAMONELLA AND SHIGELLA Tran Hong Thoai Nga, Nguyen Thi Cam Vi , Tran Cat Đong, Tran Thanh Đao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 431 - 436 Background: Flavonoids have recently been interested because of their potentially antimicrobial activities and synergic effects with antibiotics against resistant bacteria Objectives: Investigate antimicrobial activities alone and on the combination with antibiotics against Salmonella and Shigella of some synthetic heterocyclic chalcone derivatives Methods: Antimicrobial activities of chalcone derivatives were determined by agar diffusion method Checkerboard method was used to determine type of synergic effect of combination of chalcone derivatives with antibiotics Results: Among the six heterocyclic chalcone derivatives the compounds of F4 (1-(pyridine-2-yl)-3-(3hydroxyphenyl)-2-propene-1-one)) and F5 (1-(furane-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-one) showed potentially synergic effect with doxycylin and cefuroxim against tested Salmonella Combinations of F4 and *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Trường Đại học Tơn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 Chuyên Đề Dược Khoa Email: thanhdaot@yahoo.com 431 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 doxycycline; F4 and cefuroxim; F5 and doxycyclin are the most potential against tested Shigella Conclusions: In this work, six heterocyclic chalcon derivatives have been synthesized and two of them demonstrated positive synergism with antibiotics against Salmonella and Shigella Keywords: Chalcone, antibiotic, synergic effect, checkboard methods Do đó, việc tìm hoạt chất có ý ĐẶT VẤN ĐỀ nghĩa quan trọng nhiệm vụ cấp Sự đời kháng sinh kỷ 20 bách ngành Dược Việt Nam nói riêng làm giảm đáng kể mối đe dọa bệnh giới nói chung truyền nhiễm Tuy nhiên, năm gần Trong năm gần đây, việc tìm đây, lợi ích bị hủy hoại chất kháng khuẩn có sẵn thiên nghiêm trọng xuất lây lan nhiên có khả tăng cường tác dụng chống chủng vi khuẩn kháng với loại thuốc rẻ tiền lại vi khuẩn kháng sinh hệ đầu ngày hiệu hệ đầu tiên, xem quan tâm Trong số nghiên cứu lựa chọn hàng đầu Một số bệnh gần cho thấy đồng vận trà xanh nhiễm khuẩn phổ biến có tỉ lệ đề kháng kháng sinh số vi khuẩn họ enterobacter kháng sinh cao như: bệnh tiêu chảy, nhiễm Salmonella, Shigella, E coli…(9) trùng đường hô hấp, viêm màng não, nhiễm Flavonoid hợp chất thường trùng lây truyền qua đường tình dục nhiễm nhắc đến khả kháng khuẩn trùng bệnh viện Một số ví dụ quan trọng bao hiệp đồng với kháng sinh ức chế phát triển gồm Streptococcus pneumoniae kháng penicillin, nhiều vi khuẩn đề kháng(1,5,6,7) Trong đó, enterococci kháng vancomycin, Staphylococcus chalcon nhóm phụ flavonoid aureus kháng methicillin, Salmonella đa đề kháng gần có nhiều dẫn chất báo cáo Mycobacterium tuberculosis đa đề kháng Hậu có tác dụng sinh học đa dạng Nhiều hợp nhiễm trùng vi khuẩn đề kháng chất nhóm có tác động kháng khuẩn, khơng đáp ứng với điều trị, dẫn đến bệnh kéo kháng nấm, kháng ung thư, chống oxy hóa, dài nguy tử vong cao Điều trị thất bại trung hòa gốc tự có đặc tính kháng dẫn đến làm tăng số người bị nhiễm bệnh viêm, giảm đau(8,11) cộng đồng(12) Khi vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh hệ đầu tiên, điều trị chuyển sang kháng sinh hệ hai ba, có giá thành đắt, ví dụ loại thuốc trị bệnh lao đa đề kháng đắt 100 lần loại thuốc hệ đầu dùng để điều trị thể không để kháng Nhằm tiếp tục nghiên cứu sâu thêm hợp chất chalcon cấu trúc hoạt tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp số dẫn chất chalcon dị vòng (Hình 1) khảo sát tác dụng kháng Salmonella Shigella Hình Cấu trúc số chalcon dị vòng 432 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Các đĩa giấy kháng sinh mua từ công ty Nam Khoa: ampicillin (Am) 10 μg/đĩa; cefuroxim (Cu) 10 μg/đĩa; doxycyclin (Dx) 30 μg/đĩa; bactrim (Bt) 30 μg/đĩa Các chủng vi khuẩn Shigela sp Salmonella sp Bộ môn Vi Sinh - Ký sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp Môi trường nuôi cấy vi khuẩn mua từ công ty Merck: môi trường phân lập giữ gốc vi khuẩn: Tryptic Soy Agar (TSA); mơi trường hoạt hóa vi khuẩn: canh thang Tryptic Soy Broth (TSB); môi trường thử nghiệm kháng sinh: Mueller-Hinton Agar (MHA) Các chalcon thử nghiệm (xem Bảng 1) tổng hợp mơn Hóa Dược- Khoa DượcĐH Y Dược TP.HCM) theo tài liệu công bố(11) Phương pháp Nghiên cứu Y học flavonoid phương pháp khuếch tán đĩa thạch(10), đường kính vùng ức chế kháng sinh thử nghiệm xác định phương pháp kháng sinh đồ(4) Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn flavonoid với kháng sinh phương pháp khuếch tán đĩa thạch(2) Định lượng khả hiệp đồng kháng khuẩn flavonoid với kháng sinh vi khuẩn phương pháp bàn cờ(2) Đánh giá kết quả: phối hợp có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn thử nghiệm chọn để tính số ức chế riêng phần FIC (fractional inhibitory concentration), dựa theo công thức sau(2,3) Trong đó: MIC: nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration); FIC < 0,5: hiệp đồng; 0,5 < FIC < 2: cộng hợp, FIC > 2: đối kháng Định tính tác động kháng khuẩn Bảng Danh pháp cấu trúc chalcon dị vòng khảo sát tác dụng sinh học STT Danh pháp 1-(pyridin-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on Công thức 1-(furan-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F2 1-(thiophen-2-yl)-3-(2-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F3 1-(pyridin-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F4 1-(furan-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on F5 O Ký hiệu F1 OH O 1-(thiophen-2-yl)-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propen-1-on Chuyên Đề Dược Khoa F6 433 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết định tính tác động kháng khuẩn chalcon dị vòng thử nghiệm Các chalcon thử nghiệm pha thành dung dịch mẹ dimetyl sulfoxid (DMSO), sau pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/mL với môi trường MHA cho nồng độ chất trợ tan DMSO 2% Cho khoảng - 10 μL dung dịch vào lỗ đục mặt thạch Tiến hành song song với mẫu chứng chứa DMSO Để yên khoảng 15 phút cho chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Ủ hộp thạch tủ ấm 35-37 oC 16-18 Đọc kết mắt thường, ghi nhận đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Bảng Bảng Định tính tác động kháng khuẩn chalcon Shigella Salmonella Vi khuẩn thử nghiệm Shigella sp Salmonella sp Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) F1 F2 F3 F4 F5 F6 Am* Cu* Dx* Bt* 8 29 12 24 0 4 24 22 21 30 *Xác định đường kính vòng vơ khuẩn kháng sinh dung phương pháp kháng sinh đồ với đĩa giấy tẩm kháng sinh DMSO Đọc kết dựa vào lan rộng vòng vơ khuẩn hướng vào chất thử nghiệm phối hợp (xem Bảng 4) Bảng Định tính tác dụng hiệp đồng Shigella Kháng sinh F1 Ampicillin (Am) Cefuroxim (Cu) Doxycyclin (Dx) Bactrim (Bt) Chalcon thử nghiệm F2 F3 F4 F5 F6 - - - - - - - - - + + - - - - + + - - - - - - - Các cặp Dx F4, Dx F5, Cu F4, Cu F5 có tác dụng hiệp đồng Shigella Bảng Định tính tác dụng hiệp đồng Salmonella Kháng sinh F1 Ampicillin (Am) Cefuroxim (Cu) Doxycyclin (Dx) Bactrim (Bt) Chalcon thử nghiệm F2 F3 F4 F5 F6 - - - - - - - - - + + - - - - + + - - - - - - - Các cặp Dx F4, Dx F5, Cu F4, Cu F5 có tác dụng hiệp đồng Salmonella Trên vi khuẩn Shigella, chất F1, F2, F4, F5 F6 có tác động ức chế, vi khuẩn Salmonella có chất F4, F5 có hoạt tính kháng khuẩn yếu Giá trị MIC kháng sinh chất thử nghiệm riêng rẽ Shigella Salmonella Kết định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn kháng sinh chất thử nghiệm pha nước cất vô trùng Các chất thử Các dẫn chất chalcon pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/ml với nồng độ chất trợ tan DMSO 2% nhỏ khoảng 8-10 μL vào lỗ mặt thạch Đặt đĩa kháng sinh lên bề mặt thạch cho khoảng cách từ tâm đĩa kháng sinh đến tâm giếng chứa chất thử lớn tổng bán kính vòng kháng khuẩn riêng phần kháng sinh chất thử nghiệm 1-2 mm Để yên khoảng 15 phút cho chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Song song tiến hành mẫu chứng lỗ chứa 434 Các bột kháng sinh cân xác nghiệm chalcon pha thành dung dịch mẹ DMSO, sau pha với mơi trường MHA cho nồng độ chất trợ tan DMSO 2% để đạt nồng độ mong muốn giếng Nồng độ chất thử nghiệm kháng sinh pha loãng giảm dần ½ phiến 96 giếng Chấm 1-2 μl huyền dịch vi khuẩn chuẩn bị, ủ nhiệt độ 37 oC thời gian 1618 Đọc kết quả: giá trị MIC tính cho giếng có nồng độ chất thử thấp vi khuẩn thử nghiệm không mọc (xem Bảng 5) Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Bảng Xác định MIC kháng sinh chalcon thử nghiệm Shigella Salmonella Chủng VK MIC kháng sinh chalcon (µg/ml) Am Cu Dx Shigella 128 16 Salmonella 16 F1 F2 F3 F4 F5 F6 512 1024 - 32 32 1024 - 1024 512 - Các chất F4, F5 có tác động chủng vi khuẩn thử nghiệm, mạnh Shigella (32 Cefuroxim F4 (1-(pyridin-2-yl)-3-(3hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Bảng Giá trị FIC phối hợp kháng sinh chalcon vi khuẩn Shigella MIC (µg/ml) Các STT phối hợp Riêng rẽ μg/ml), yếu trên Salmonella (>512 μg/ml) Các chất F1, F2, F6 có tác động yếu Shigella (>512 μg/ml) không tác động Salmonella Định lượng tác dụng hiệp đồng dẫn chất chalcon kháng sinh phiến 96 giếng Trên vi khuẩn Shigella Tiến hành phối hợp chất thử nghiệm kháng sinh phối hợp phiến 96 giếng theo ngun tắc pha lỗng ½, giếng cơng thức (1), kết xem Bảng Bảng Trong phối hợp trên, chúng tơi xác định có cặp phối hợp có tác dụng hiệp đồng Shigella, có giá trị FIC < 0,5: Doxycyclin F4 (1-(pyridine-2-yl)-3-(3hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Doxycyclin F5 (1-(furan-2-yl)-3-(3- hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Trên vi khuẩn Salmonella Trong phối hợp trên, xác định có cặp phối hợp có tác dụng hiệp đồng Shigella, có giá trị FIC < 0,5: Doxycyclin F4 (1-(pyridin-2-yl)-3-(3hydroxyphenyl)-2-propen-1-on) Chuyên Đề Dược Khoa Phối hợp Cu F4 Cu F5 32 32 16 Dx 16 F4 Dx F5 32 16 32 4 FIC Mức giảm Kết luận giá trị MIC kiểu kháng phối sinh hợp phối hợp (lần) 0,75 Cộng hợp 0,5 Cộng hợp 0,3125 Hiệp đồng 16 0.375 Hiệp đồng Bảng Giá trị FIC phối hợp kháng sinh chalcon vi khuẩn Salmonella STT Các phối MIC (µg/mL) hợp Riêng Phối rẽ hợp có nồng độ gấp đôi giá trị MIC chất phối hợp Tính giá trị FIC theo Nghiên cứu Y học Cu F4 Cu F5 Dx F4 Dx F5 16 1024 16 512 1024 512 Gía Kết luận Mức giảm trị kiểu tác giá trị MIC FIC động kháng sinh phối hợp (lần) 0,07 Hiệp đồng 64 0,25 64 Cộng hợp 256 0,25 0,187 Hiệp đồng 128 0,75 Cộng hợp 256 16 Liên quan cấu trúc tác dụng Các chalcon có vòng A furfuran pyridin có tác dụng kháng khuẩn trung bình Shigella Salmonella, đặc biệt, hoạt tính tăng lên đáng kể Shigella có thêm nhóm hydroxyl vị trí vòng B Chalcon có tác dụng hiệp đồng với cefuroxim doxycyclin Shigella cấu trúc có nhóm hydroxy vị trí vòng B Ngược lại, chalcon có vòng A thiophen khơng có có tác dụng kháng khuẩn khơng có tác dụng hiệp đồng với cefuroxim hay doxycyclin Shigella Salmonella 435 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KẾT LUẬN Trong báo cáo ghi nhận lần tính kháng khuẩn dẫn xuất chalcon tổng hợp hai vi khuẩn đường ruột Salmonella Shigella Kết cho thấy có F4 F5 chalcon dị vòng có tìm hiệp đồng với kháng sinh doxycyclin cefuroxim vi khuẩn Shigella Salmonella Phối hợp F4 với cefuroxim doxycyclin phối hợp có tác dụng mạnh Salmonella, thể khả làm giảm MIC kháng sinh tương ứng 64 lần 16 lần Phối hợp F5 với cefuroxim doxycyclin phối hợp có tác dụng trung bình Salmonella, khả cộng lực kháng Salmonella thể khả làm giảm MIC kháng sinh tương ứng lần lần Phối hợp F4 doxycyclin phối hợp có tác dụng mạnh Shigella, khả hiệp lực thể khả làm giảm MIC kháng sinh 16 lần Các phối hợp F4 cefuroxim; F4 doxycyclin; F5 doxycyclin phối hợp có dụng trung bình Shigella, giảm MIC kháng sinh lần Cảm ơn: Các tác giả cảm ơn quĩ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (Nafosted) hỗ trợ kinh phí nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO 436 Alcaraz L E.; Blanco S E.; Puig O.N.; Tomas F.; Ferretti F H (2000) Antibacterial activity of Flavonoids against methicillinresistant Staphylococcus aureus strains Journal of Theoretical Biology, 205(2), 231-240 10 11 12 Bajaksouzian, S., Visalli M A., Jacobs M R., and Appelbaum P C (1997) Activities of levofloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, alone and in combination with amikacin, against acinetobacters as determined by checkerboard and time-kill studies Antimicrob Agents Chemother 41:1073– 1076 Bonapace C R., White R L., Friedrich L V., and Bosso J A (2000) Evaluation of antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii: a comparison with E-test, time-kill, and checkerboard methods Diagn Microbiol Infect Dis 38:43– 50 CLSI (2008) Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing; Informational supplement M100-S18 Mandalari, G., Bennett R N., Bisignano G., et al (2007) Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citrus bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry J Appl Microbiol 103(6), 2056-64 Miller, Alan L (1996) Antioxidant Flavonoids: Structure, Function and Clinical Usage Alternative Medicine Review 2(1), 103-111 Nazrul Islam S K., Gray A I., Waterman P G., et al (2002) Screening of eight alkaloids and ten flavonoids isolated from four species of the genus Boronia (Rutaceae) for antimicrobial activities against seventeen clinical microbial strains Phytother Res 16(7), 672-4 22 Nielsen S F., Larsen M., (2004) Antibacterial chalconesbioisosteric replacement of 4’-hydroxy group Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12(11), 3047-3054 Tiwari, T P., Bharti S K., Kaur H D., et al (2005), "Synergistic antimicrobial activity of tea & antibiotics", Indian J Med Res 122(1), 80-4 33 Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2002) Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn Y Học TP Hồ Chí Minh, 6(1), 309 - 313 Trần Lê Ánh Thùy, Nguyễn Thị Thảo Như, Đỗ Tường Hạ, Võ Thị Anh Thư, Trần Thành Đạo Tổng hợp hoạt tính kháng vi sinh vật số dẫn chất Chalcon dị vòng Tạp chí Y hoc TP.HCM, Phụ Số 1, Tập 14, 2010, Tr 110-116 WHO (2002) Antimicrobial resistance trang web (truy cập thông tin ngày 10/11/2010): http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en/ Chuyên Đề Dược Khoa ... lần Phối hợp F5 với cefuroxim doxycyclin phối hợp có tác dụng trung bình Salmonella, khả cộng lực kháng Salmonella thể khả làm giảm MIC kháng sinh tương ứng lần lần Phối hợp F4 doxycyclin phối hợp. .. số dẫn chất chalcon dị vòng (Hình 1) khảo sát tác dụng kháng Salmonella Shigella Hình Cấu trúc số chalcon dị vòng 432 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ĐỐI TƯỢNG... định đường kính vòng vơ khuẩn kháng sinh dung phương pháp kháng sinh đồ với đĩa giấy tẩm kháng sinh DMSO Đọc kết dựa vào lan rộng vòng vơ khuẩn hướng vào chất thử nghiệm phối hợp (xem Bảng 4)