Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm sàng lọc những phối hợp có tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn giữa berberin và một số kháng sinh β-lactam trên staphylococcus aureus. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA PHỐI HỢP BERBERIN VÀ KHÁNG SINH β-LACTAM Đinh Thị Liên*, Vũ Thanh Thảo*, Trần Cát Đơng*, Trần Thành Đạo* TĨM TẮT Mở đầu: Staphylococcus aureus kháng meticillin (MRSA) thường gặp nhiễm trùng bệnh viện, nhiên, việc điều trị gặp nhiều khó khăn vi khuẩn đề kháng với nhiều kháng sinh, kháng sinh βlactam Nhiều nghiên cứu cho thấy phối hợp kháng sinh chất kháng sinh làm tăng hoạt tính vi khuẩn đề kháng Berberin loại kháng sinh thực vật có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus Mục tiêu: Sàng lọc phối hợp có tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn berberin số kháng sinh β-lactam Staphylococcus aureus Phương pháp: Tác động kháng khuẩn berberin tác động hiệp đồng kháng khuẩn berberin với số β-lactam xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch Khả hiệp đồng kháng khuẩn berberin với kháng sinh xác định phương pháp bàn cờ Kết đánh giá qua số ức chế riêng phần FIC Kết quả: Trên chủng MSSA MRSA, kết định tính cho thấy berberin có tác dụng hiệp đồng với ampicillin, oxacillin cefuroxim Từ đó, xác định giá trị MIC berberin MSSA 256 µg/ml, MRSA 128 µg/ml Trên MSSA, cặp phối hợp berberin/ampicillin; berberin/oxacillin có FIC 0,375 (hiệp lực) phối hợp berberin/cefuroxim có số FIC (cộng lực) Trên MRSA, berberin có tác dụng hiệp đồng với ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC=0,5) cefuroxim (FIC=0,313) Kết luận: Berberin có tác dụng hiệp lực hay cộng hợp với β-lactam bán tổng hợp (ampicillin oxacicillin) cephalosporin hệ (cefuroxim) S aureus khơng hiệp đồng với cephalosporin hệ Từ khóa: Staphylococcus aureus, berberin, tác dụng hiệp đồng, kháng sinh β-lactam ABSTRACT INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL ACTIVITIES ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS OF BERBERIN AND β-LACTAMS COMBINATION Dinh Thi Lien, Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong, Tran Thanh Dao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 437 - 442 Background: Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) was frequently reported in nosocomial infection However, treatment was usually failed because of multiple resistance with antibiotics, especially βlactams Recently studies showed combination between antibiotic and non-antibiotic substances may increase antimicrobial effect on resistant strains Berberin has been use for a long time as plant derived antimicrobial agent against Staphylococcus aureus Objectives: Screening for combinations of berberin and β-lactams having synergic effect on Staphylococcus aureus Methods: Antimicrobial activities of berberin and combined effects with β-lactams were determined agar *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS TS Trần Thành Đạo ĐT: 0903716482 Chuyên Đề Dược Khoa Email: thanhdaot@yahoo.com 437 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 diffusion method Checkerboard method was used to determine type of combined effect of combination between berberin and β-lactams Outcome was assessed by FIC index Results: On both Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus (MSSA) and Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains, the preliminary test showed berberin has combined effect with ampicillin, oxacillin and cefuroxim MIC of berberin on MSSA was 256 µg/ml, on MRSA was 128 µg/ml On MSSA, combination of berberin/ampicillin; berberin/oxacillin have FIC of 0,375 (synergic effect) and berberin/cefuroxim has FIC of (additional effect) On MRSA, berberin has synergic effect with ampicillin (FIC = 0,375), oxacillin (FIC=0,5) and cefuroxim (FIC=0,313) Conclusions: Berberin has additional or synergic effect with semi-synthetic β-lactams (ampicillin oxacicillin) or second generation cephalosporin (cefuroxim) on S aureus, but no combined effect was observed with third generation cephalosporin Keyword: Staphylococcus aureus, berberin, combined effect, β-lactam antibiotics Staphylococcus aureus đề kháng methicillin việc ĐẶT VẤN ĐỀ cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn Cùng với việc khám phá sử dụng kháng Để hạn chế đề kháng trên, vấn đề điều trị sinh điều trị nhiễm khuẩn vấn đề đề phối hợp kháng sinh chứng tỏ hiệu kháng kháng sinh vi sinh vật đặt trường hợp nhiễm trùng nghiêm Hiện “sự kháng thuốc vi khuẩn trọng Trong năm qua, vấn đề xác định trở thành thảm họa ngấm ngầm” WHO tương tác kháng sinh có nhiều kết quan kêu gọi quốc gia phải coi tình trạng kháng trọng công bố nghiên cứu thực kháng sinh nói riêng kháng thuốc kháng chủ yếu xác định tương tác hai kháng khuẩn nói chung mối đe dọa tồn cầu(5) sinh Gần có nghiên cứu cho Staphylococcus aureus nguyên nhân gây thấy phối hợp kháng sinh chất số bệnh nhiễm trùng người động khơng phải kháng sinh - ví dụ berberin, vật Mặc dù phát nhiều kháng kháng sinh thực vật sử dụng y sinh chúng không tác động học cổ truyền từ lâu - làm tăng hoạt tính Staphylococcus aureus đề kháng methicillin Do vi khuẩn đề kháng đó, việc nhiễm vi khuẩn vấn đề Với khuynh hướng trở với thiên nhiên, nghiêm trọng lâm sàng việc nghiên cứu ngày chất có nguồn gốc từ thiên nhiên chất kháng khuẩn xác định chế nhà nghiên cứu quan tâm tác động chúng mục tiêu việc nghiên Alkaloid hợp chất tự nhiên phân bố cứu khoa học liên tục Mặt khác, tỷ lệ rộng rãi thực vật(6) Những nǎm gần Staphylococcus aureus đề kháng với kháng nghiên cứu, sàng lọc chất sinh truyền thống methicillin, oxacillin, hay kháng sinh có nguồn gốc từ dược liệu, nhà nafcillin tiếp tục tăng Vancomycin phương kế khoa học phát berberin có hoạt tính cuối điều trị Staphylococcus aureus kháng Staphylococcus aureus đề kháng kháng đa thuốc, vào năm 2002 theo báo methicillin(4,6,7,8) Hyeon-Hee Yu cộng cáo Trung tâm Phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ phối hợp berberin với ampicillin, oxacillin (CDC) ghi nhận có trường hợp nhiễm MRSA phương pháp bàn cờ ghi trùng Staphylococcus aureus kháng nhận MIC berberin nguyên chất MRSA vancomycin hồn tồn Vì vậy, tìm phối từ 32-128 μg/ml giảm xuống 10-50 μg/ml hợp có tác dụng tốt (kháng sinh với kháng sinh phối hợp với ampicillin, oxacillin(10) kháng sinh với chất khơng phải Nhằm góp phần tìm phối hợp có kháng sinh) trường hợp nhiễm tác dụng tốt, gia tăng hiệu kháng 438 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 sinh tụ cầu đề kháng methicilin, tiến hành đề tài nhằm sàng lọc phối hợp có tác dụng hiệp đồng kháng khuẩn berberin số kháng sinh β-lactam Staphylococcus aureus nhằm làm sở cho nghiên cứu để chọn lựa phối hợp thuốc điều trị hữu hiệu Staphylococcus aureus ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng thử nghiệm Berberin clorid: công ty trách nhiệm hữu hạn Dược Phẩm Thanh Thảo cung cấp đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III Các kháng sinh dùng nghiên cứu công ty Nam Khoa sản xuất gồm kháng sinh (ampicillin 10 μg/đĩa; oxacillin μg/đĩa; cefotaxim (Ct, 30 μg/đĩa); ceftazidim (Cz, 30 μg/đĩa); ceftriaxon (Cx, 30 μg/đĩa); cefuroxim (Cu, 30 μg/đĩa) Bột kháng sinh: ampicillin (Am), oxacillin (Ox), cefuroxim (Cu, tiêu chuẩn USP) môi trường: Mueller-Hinton Agar (MHA); Tryptic Soy Broth (TSB) Tryptic Soy Agar (TSA) công ty Merck cung cấp Vi khuẩn thử nghiệm Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA), Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) Bộ môn Vi sinh-Ký sinh, Đại học Y Dược TP.HCM cung cấp Phương pháp nghiên cứu Quá trình thực gồm bước: Định tính tác động kháng khuẩn berberin thử nghiệm kháng sinh đồ kháng sinh thử nghiệm để xác định đường kính vùng ức chế phương pháp khuếch tán đĩa thạch(2) Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn berberin với kháng sinh phương pháp khuếch tán đĩa thạch(1) Định lượng khả hiệp đồng kháng khuẩn berberin với kháng sinh vi khuẩn phương pháp bàn cờ(1,4) Đánh giá kết quả: phối hợp có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn thử nghiệm chọn để tính số ức chế riêng phần FIC Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học (fractional inhibitory concentration), dựa theo cơng thức sau(1,2) Trong đó: FIC < 0,5: hiệp đồng; 0,5 < FIC < 2: cộng hợp, FIC > 2: đề kháng MIC: nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết xác định đường kính vòng vơ khuẩn berberin kháng sinh thử nghiệm Berberin pha thành dung dịch mẹ dimetyl sulfoxid (DMSO), sau pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/mL với mơi trường MHA cho nồng độ chất trợ tan DMSO 5% Cho khoảng - 10 μL dung dịch vào lỗ đục mặt thạch Tiến hành song song với mẫu chứng chứa DMSO Để yên khoảng 15 phút cho chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Ủ hộp thạch tủ ấm 3537 oC 16-18 Đọc kết mắt thường, ghi nhận đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn kháng sinh thử nghiệm Staphyllococcus aureus ATCC 29213 (MSSA) nằm giới hạn cho phép CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) Như đĩa kháng sinh sử dụng, chủng vi khuẩn, phương pháp khuếch tán đạt yêu cầu CLSI (2) Ngoài ra, kết MRSA cho thấy vi khuẩn đề kháng với kháng sinh β-lactam sử dụng Bảng Định tính tác dụng kháng khuẩn berberin kháng sinh đồ kháng sinh thử nghiệm Vi khuẩn MRSA MSSA Đường kính vùng ức chế chất thử nghiệm (mm) Berberin Am Ox Ct Cx Cz Cu 10 17,5 12 13,5 14 10 32 25 31 28 18 28 Kết định tính tác động hiệp đồng berberin kháng sinh phối hợp Các chất thử nghiệm pha thành dung dịch có nồng độ 1024 μg/ml với nồng độ chất trợ 439 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học tan DMSO 5% nhỏ khoảng 8-10 μL vào lỗ mặt thạch (8) Đặt đĩa kháng sinh lên bề mặt thạch cho khoảng cách từ tâm đĩa kháng sinh đến tâm giếng chứa chất thử lớn tổng bán kính vòng kháng khuẩn riêng phần kháng sinh chất thử nghiệm 1-2 mm Để yên khoảng 15 phút cho chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Song song tiến hành mẫu chứng lỗ chứa DMSO Đọc kết dựa vào lan rộng vòng vơ khuẩn hướng vào chất thử nghiệm phối hợp Kết định tính tác động hiệp đồng kháng S aureus trình bày Bảng Bảng Các kháng sinh có tác dụng hiệp đồng với berberin Kháng sinh Am Ox Ct Cx Cz Cu Berberin MSSA + + + MRSA + + + Trên vi khuẩn S aureus nhạy cảm meticillin (MSSA) có phối hợp thể tác động hiệp đồng: berberin ampicillin; berberin oxacillin; berberin cefuroxim Trên vi khuẩn S aureus kháng methicillin (MRSA) có phối hợp thể tác động hiệp đồng: berberin ampicillin; berberin oxacillin; berberin cefuroxim Giá trị MIC kháng sinh berberin riêng rẽ S aureus thử nghiệm Các bột kháng sinh cân xác pha nước cất vơ trùng Các chất thử nghiệm chalcon pha thành dung dịch mẹ DMSO, sau pha với mơi trường MHA cho nồng độ chất trợ tan DMSO 5% để đạt nồng độ mong muốn giếng Nồng độ chất thử nghiệm kháng sinh pha lỗng giảm dần ½ phiến 96 giếng Ủ nhiệt độ 37 oC thời gian 16-18 Đọc kết quả: giá trị MIC tính cho giếng có nồng độ chất thử thấp vi khuẩn thử 440 nghiệm khơng mọc Kết trình bày Bảng Bảng MIC (µg/ml) berberin kháng sinh S aureus Chất thử Berberin Am Ox Cu MIC (μg/ml) MSSA 256 0,5 0,5 MRSA 128 16 128 Giá trị MIC berberin MSSA 256 μg/ml MRSA 128 μg/ml Giá trị MIC β-lactam MRSA cho thấy chủng vi khuẩn đề kháng với kháng sinh dùng thử nghiệm (2) Định lượng tác dụng hiệp đồng berberin kháng sinh phiến 96 giếng Pha nồng độ berberin kháng sinh phối hợp với theo tỉ lệ định giếng phiến 96 giếng dao động xung quanh MIC chất thử nghiệm Trên phiến 96 giếng xem chiều ngang nồng độ berberin phối hợp với kháng sinh có nồng độ giảm dần ½ giếng chứa berberin kháng sinh có nồng độ gấp lần MIC chất, giếng nồng berberin giữ ngun kháng sinh có nồng độ giảm dần ½ Vi khuẩn chấm khoảng 1-2 μl lên bề mặt tất giếng, ủ 37 oC/16-18 Đối với MRSA ủ 24 Song song tiến hành chấm vi khuẩn lên mẫu chứng không chứa berberin kháng sinh Đọc kết quả: giếng có nồng độ thấp kháng sinh ức chế hồn tồn tạo khóm vi khuẩn dung để tính số ức chế riêng phần FIC berberin kháng sinh Bảng Giá trị FIC phối hợp kháng sinh với berberin MSSA ST Các phối MIC (µg/ml) FIC Kết luận Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 T hợp Berberin Am 256 0,5 B 256 32 Ox B Cu 0,5 256 0,125 128 0,5 Riêng Phối hợp rẽ 32 0,125 Kiểu tác Mức giảm động phối MIC (lần) hợp 0,38 Hiệp đồng 0,38 2 Hiệp đồng Cộng hợp Trên MSSA có phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin ampicillin; berberin oxacillin với số FIC 0,38 phối hợp có tác dụng cộng hợp berberin cefuroxim với số FIC Phối hợp berberin ampicillin, berberin amoxicillin thể kiểu tương tác hiệp đồng giá trị MIC thấp, có tìm sử dụng trị liệu Trên MRSA có phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin ampicillin với số FIC 0,38; berberin oxacillin 0,5 berberin cefuroxim 0,31 Các phối hợp berberin ampicillin, berberin oxacicillin, berberin với cefuroxim thể kiểu tương tác hiệp đồng giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tìm sử dụng trị liệu Hoạt tính kháng MSSA kháng sinh berberin phối hợp tăng lên đáng kể Với berberin tăng 2-8 lần, kháng sinh tăng 2-4 lần Phối hợp berberin ampicillin, berberin amoxicillin thể kiểu tương tác hiệp đồng giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tìm sử dụng trị liệu Bảng Giá trị FIC phối hợp berberin với kháng sinh chủng MRSA STT Phối hợp MIC (µg/ml) Riêng Phối rẽ hợp Berberin 128 Am B 128 Ox 16 B 128 Cu 128 32 32 32 Kết luận Mức Kiểu tác FIC giảm động phối MIC (lần) hợp 0,38 Hiệp đồng 0,50 Hiệp đồng 0,31 16 Hiệp đồng Trên MRSA có phối hợp có tác dụng hiệp đồng là: berberin ampicillin với số FIC Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học 0,375; berberin oxacillin 0,5 berberin cefuroxim 0,31 Các phối hợp berberin ampicillin, berberin oxacicillin, berberin với cefuroxim thể kiểu tương tác hiệp đồng giá trị MIC thấp, chứng tỏ có tiềm sử dụng trị liệu Kết so với nghiên cứu tác dụng hiệp đồng berberin với ampicillin, oxacillin MRSA phù hợp với nghiên cứu Hyeon-Hee Yu cộng (khi phối hợp berberin với ampicillin, oxacillin MIC berberin, ampicillin, oxacillin giảm cách rõ rệt (với nồng độ berberin từ 10-50 μg/ ml làm tăng độ nhạy cảm MRSA kháng sinh)(10) Ngoài ra, nghiên cứu ghi nhận phối hợp với cephalosporin thử nghiệm, berberin cho tác động hiệp đồng với cefuroxim (thế hệ thứ 2), không làm tăng tác động ceftazidim, ceftriaxon (cephalosporin hệ 3) S aureus nhạy hay đề kháng methicillin KẾT LUẬN Berberin có tác dụng hiệp đồng cộng hợp MSSA MRSA với penicillin bán tổng hợp (ampicillin amoxicillin) cephalosporin hệ (cefuroxim), không hiệp đồng với cephalosporin hệ Như vậy, berberin ampicillin, berberin amoxicillin, berberin cefuroxim phối hợp tiềm phát triển thành chế phẩm phối hợp phương pháp trị liệu phối hợp trường hợp nhiễm S aureus Cảm ơn: Các tác giả cảm ơn Đại học Y Dược TP.HCM tài trợ kinh phí nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Bajaksouzian S., Visalli M A., Jacobs M R., and Appelbaum P C (1997) Activities of levofloxacin, ofloxacin, and ciprofloxacin, alone and in combination with amikacin, against acinetobacters as determined by checkerboard and time-kill studies Antimicrob Agents Chemother 41:1073– 1076 Bonapace C R., White R L., Friedrich L V., and Bosso J A (2000) Evaluation of antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii: a comparison with E-test, time-kill, and 441 Nghiên cứu Y học 442 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 checkerboard methods Diagn Microbiol Infect Dis 38:43– 50 CLSI (2008) Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing; Informational supplement M100-S18 Lương Đăng Hoàng (2007) Sử dụng phương pháp bàn cờ để khảo sát tác dụng hiệp đồng flavonoid kháng sinh MRSA Luận văn Thạc sĩ Dược học, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Xuân Hùng (2010) Sự kháng thuốc vi khuẩn thảm họa ngấm ngầm Thuốc sức khỏe 402, Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học NXB Y Học Hà Nội Simoes M, Bennett RN, Rosa EAS (2009) Understanding antimicrobial activities of phytochemicals agaisnt multudrug resistant bacteria and biofilm Natural Product 26, 746-757 10 Stermitz FR, Lorenz P, Tawara JN, et al (1999) Synergy in a medicinal plant: Antimicrobial action of berberine potentiated by 5′-methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor PNAS 97(4), 1433-1437 Trần Cát Đông, Nguyễn Văn Thanh (2002) Xây dựng mơ hình đánh giá chất có tiềm kháng khuẩn Y Học TP Hồ Chí Minh, 6(1):309 - 313 Yu Hyeon-Hee, Kim Kang-Ju, Cha Jeong-Dan, et al (2005) Antimicrobial activity of berberine alone and in combination with ampicillin or oxacillin against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Journal of Medicinal Food (454-461) Chuyên Đề Dược Khoa ... kháng sinh có nguồn gốc từ dược li u, nhà nafcillin tiếp tục tăng Vancomycin phương kế khoa học phát berberin có hoạt tính cuối đi u trị Staphylococcus aureus kháng Staphylococcus aureus đề kháng. .. khuẩn nói chung mối đe dọa tồn c u( 5) sinh Gần có nghiên c u cho Staphylococcus aureus nguyên nhân gây thấy phối hợp kháng sinh chất số bệnh nhiễm trùng người động kháng sinh - ví dụ berberin, ... nhi u kháng kháng sinh thực vật sử dụng y sinh chúng không tác động học cổ truyền từ l u - làm tăng hoạt tính Staphylococcus aureus đề kháng methicillin Do vi khuẩn đề kháng đó, việc nhiễm vi khuẩn