Ba chủng nấm sợi nghiên cứu có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt phổ rộng, đặc biệt là khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đã kháng nhiều loại kháng sinh. Đã xác định được các đặc điểm của chất kháng sinh và các đặc điểm sinh học, phân loại đến loài ba chủng nấm trên. Bước đầu thử nghiệm tác dụng của chất kháng sinh và bào tử nấm sợi trên ấu trùng tằm và sâu tơ hại rau cải cho kết quả tốt.
Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHÁNG SINH CHỐNG SINH VẬT GÂY HẠI Trần Thị Minh Định *, Trần Thanh Thủy † Mở đầu Nấm sợi đối tượng hấp dẫn cho nghiên cứu đa dạng sinh học, nhóm vi sinh vật (VSV) giàu tiềm sản sinh chất có hoạt tính sinh học q, có chất kháng sinh (CKS) Từ lâu, CKS có nguồn gốc từ nấm sợi người biết đến ứng dụng có hiệu trị bệnh cho người, vật nuôi, trồng Tuy nhiên, việc sử dụng CKS khơng hợp lí với xuất bệnh nan y khiến cho nhiều CKS khơng tác dụng chữa bệnh Việc tìm kiếm CKS trở thành nhiệm vụ cấp thiết Hơn nữa, để giảm thiểu chất hoá học nông nghiệp, người tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học cơng tác phòng trừ dịch bệnh cho Nấm sợi sinh CKS đối tượng thiếu chế phẩm Ở Việt Nam cơng trình nghiên cứu nấm sợi rừng ngập mặn sinh CKS ỏi Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Ba chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn có hoạt tính kháng sinh (kí hiệu M1, M2, M3) sưu tập giống PTN Vi sinh-Sinh hoá Trường ĐHSP Tp.HCM Các VSV kiểm định gồm : * † CN, Khoa Sinh học, Trường ĐHSP Tp.HCM TS, Khoa Sinh học, Trường ĐHSP Tp.HCM 138 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 + Bacillus subtilis, Salmonella, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum nhận từ sưu tập giống PTN Vi sinh-Sinh hoá + Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans nhận từ Viện Pasteur + E.coli kháng thuốc nhận từ Bệnh viện Bình Dân + Mơi trường nuôi cấy, giữ giống nấm sợi RNM môi trường Yeast Extract Agar (YEA), môi trường phân loại nấm sợi Malt Yeast Extact Agar (MEA), môi trường tách chiết CKS YEA, môi trường xốp thu bào tử chủng nấm sợi gồm 60% cám, 30% bột đậu nành, 10% bột ngô + Ấu trùng tằm tuổi ba nhận từ Công ti Dâu tằm tơ, Lâm Đồng + Sâu tơ hại rau cải nhận từ Công ti Vipesco, Tp.HCM 2.2 Phương pháp nghiên cứu Khảo sát khả sinh kháng sinh phương pháp khối thạch (Egorov N.X, 1983), phương pháp đục lỗ khoanh giấy lọc (Nguyễn Lân Dũng cộng sự, 1978) Tách chiết CKS dung môi dịch lên men Xác định số tính chất lí hố dịch KS thô (Egorov N.X., 1983) Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại nấm sợi (Bùi Xuân Đồng 1986, 2000; R Samson cộng sự, 2004) Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào cách đo kích thước vòng phân giải (Stephen, 2000) Khảo sát khả diệt côn trùng nấm sợi (T.K.Chỉnh, 1996) 139 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ Kết biện luận 3.1 Khảo sát đặc điểm sinh kháng sinh ba chủng nấm sợi 3.1.1 Hoạt tính kháng sinh ba chủng nấm sợi Chúng tiến hành khảo sát khả sinh CKS ba chủng nấm sợi với VSV kiểm định trình bày phần 2.1 Kết trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.1 Khả kháng nấm gây bệnh ba chủng nấm sợi Các chủng nấm kiểm định Aspergillus niger Fusarium oxysporum Khả gây bệnh Hoạt tính kháng sinh (D-d, cm) Bệnh thối cổ rễ họ đậu Bệnh héo vàng nhiều trồng cạn M1 M2 M3 – +++ – + +++ ++ Ghi : - : không kháng, + : kháng yếu, ++ : kháng mạnh, +++ : kháng mạnh Bảng 3.2 Khả kháng VSV gây bệnh chủng nấm sợi Các chủng VSV kiểm định Escherichia coli E.coli kháng thuốc Bacillus subtilis Salmonella Pseudomonas aeruginosa Candida albicans 140 Khả gây bệnh Tiêu chảy nt Vi khuẩn hội gây bệnh đường ruột Thương hàn ngộ độc thực phẩm Viêm phế quản, viêm tai giữa, Các bệnh đường sinh dục Hoạt tính kháng sinh (D-d, cm) M1 0 M2 1,6 0,7 M3 2,4 1,8 1,7 2,5 1,3 1,3 2,5 0 0 1,2 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM E.coli Số 12 năm 2007 B.sutilis Hình 3.1 Hoạt tính kháng khuẩn chủng M3 3.1.2 Tách chiết CKS Nhằm lựa chọn phương pháp thu CKS tối ưu, tiến hành tách chiết CKS từ khối thạch dung môi khác dịch lên men, kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính CKS chủng nấm sợi tách chiết phương pháp khác Dung môi Acetone Butanol Cồn tuyệt đối Ethyl acetat Nước 80 0C Dịch lên men Hoạt tính kháng sinh (D-d, cm) M1 M2 M3 1,3 2,4 0,35 1,3 0,8 1,7 2,2 0,3 1,9 0,1 1,6 3,2 2,3 Như vậy, phương pháp thu nhận CKS tốt thu nhận từ dịch lên men 3.1.3 Xác định thời gian sinh tổng hợp CKS nhiều Nhằm xác định thời gian thu nhiều CKS nhất, tiến hành xác định thời gian sinh tổng hợp CKS nhiều ba chủng nấm sợi, kết thể Biểu đồ 3.1 141 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ Biểu đồ 3.1 Thời gian sinh CKS chủng nấm sợi 3.5 3.2 D-d (cm) 2.5 2.3 2.2 1.6 1.5 0.5 2.2 0.8 0.6 0 48h 72h 2.2 M1 1.8 1.6 1.4 1.2 1 96h 120h 144h 1.6 M2 M3 0.8 168h Thời gian Thời gian sinh CKS nhiều chủng M1 120h, chủng M2 48h, chủng M3 72h-120h 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền CKS Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính độ bền kháng sinh chủng nấm sợi Nhiệt độ Chủng M1 M2 M3 Thời gian (phút) 10 20 40 60 10 20 40 60 10 20 40 60 30 0C 400C 60 0C 800C 100 0C Hoạt tính kháng sinh (D-d, cm) 1,6 1,6 1,6 1,6 3,2 3,15 3,2 3,1 2,3 2,25 2,3 2,3 1,7 1,8 1,7 1,7 3,2 3,6 3,45 3,2 2,2 2,3 2,2 2,2 1,85 1,7 1,7 3,1 2,45 2,25 2,25 2,2 2,2 2,2 1,7 1,6 1,6 1,45 3,1 2,75 2,7 1,65 2,15 2,25 2,2 2,15 1,4 1,7 1,2 1,1 2,55 2,55 2,2 1,1 2,2 2,1 2,1 2,25 Kết cho thấy : nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính kháng sinh mạnh chủng M1 600C, chủng M2 400C, chủng M3 300C 142 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 CKS chủng M1 M2 có độ bền 1000C 40 phút, CKS chủng M3 chịu tất nhiệt độ thời gian khảo sát Có thể xem tính chất đặc biệt CKS có từ chủng nhờ độ bền CKS nhiều điều kiện nhiệt độ thời gian khác 3.2 Đặc điểm sinh học phân loại chủng nấm sợi 3.2.1 Phân loại chủng nấm sợi Bảng 3.5 Đặc điểm phân loại chủng nấm sợi nghiên cứu Đặc điểm chủng nấm sợi nghiên cứu - KL màu vàng nhạt M1 - Cuống sinh bào tử khơng phân nhánh - Bào tử có nhiều hình dạng - KL tròn, từ màu trắng xanh lục, phát triển nhanh - Khuẩn ty không màu - Cuống sinh BT ngắn phân nhánh M2 nhiều lần Các bào tử trần tập trung thành chùm nhỏ - BT hình ellip - KL tròn, màu trắng màu xám, mặt trái KL màu vàng nâu - Khuẩn ty phân nhánh - Cuống sinh BT không phân nhánh phân nhánh khơng đều, có hai M3 loại thể bình : hình chai hình trụ - Có hai loại BT : + BT lớn mọc đơn độc, hình cầu + BT nhỏ mọc thành chuỗi dài, hình ellip, hình chanh Đặc điểm phân loại taxon tương ứng theo Bùi Xuân Đồng (1986, 2000), A.Samson (2004) - KL màu trắng, hồng nhạt da cam nhạt - Cuống sinh bào tử phân Acremonium nhánh khơng phân nhánh - Bào tử nhiều hình dạng - KL có màu trắng từ trắng đến lục, phát triển nhanh - Khuẩn ty không màu Trichoderma - Cuống sinh BT phân nhánh nhiều, BT trần liên kết chùm nhỏ - BT hình ellip, hình cầu hình thn - KL màu trắng màu xám, đơi chỗ có xám lục, lục, mặt trái KL màu vàng nâu - Khuẩn ty phân nhánh - Cuống sinh BT ngắn, phân nhánh không đều, Botryotrichu hai lần với nhánh m piluliferum nhánh phụ ngắn - Có hai loại BT : + BT lớn đơn độc, hình cầu, gần cầu + BT nhỏ thành chuỗi, hình trứng 143 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ Từ đặc điểm dựa vào mô tả Bùi Xuân Đồng (1986, 2000), R.Samson cộng (2004), kết luận : chủng M1 thuộc chi Acremonium, chủng M2 thuộc chi Trichoderma, chủng M3 loài Botryotrichum piluliferum Sacc & March Khuẩn lạc Khuẩn ty Cơ quan sinh sản Hình 3.3 Đặc điểm phân loại chủng M1 Khuẩn lạc Khuẩn ty Cơ quan sinh sản Hình 3.4 Đặc điểm phân loại chủng M2 Khuẩn lạc Cơ quan sinh sản Hình 3.5 Đặc điểm phân loại chủng M3 144 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 3.2.2 Các đặc điểm sinh học ba chủng nấm sợi Bảng 3.6 Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa ba chủng nấm sợi Các đặc điểm Khả chịu nhiệt Khả chịu mặn Khả đồng hoá nguồn carbon Khả đồng hoá nguồn nitơ 200C 250C 300C 350C 400C 0% 1% 2,5% 3% 4% 5% Glucose Maltose Sucrose Tinh bột Lactose Galactose CMC Bột đậu Cao thịt NaNO3 NH4Cl NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO2 Đường kính khuẩn lạc (mm) M1 M2 M3 12 4,2 2,5 17,7 10 5,3 28,7 14,5 1,5 23,7 0 0 8,7 44,3 21,5 5,2 36,2 15 5,3 28,7 14,5 22,2 2,8 3,8 12 3,5 9,3 5,7 23 14,5 7,8 18 5,5 6,2 14 17,2 4,5 8,3 17 4,6 6,5 5,2 10 4,8 23,2 68,2 60 24,5 5,5 4,3 32,2 10,5 5,0 64,2 25 5,1 65,2 19,7 4,9 49 17 4,2 29,1 Qua Bảng 3.6 thấy : Cả ba chủng nấm sợi sinh trưởng tốt 300C, độ mặn 0%, đồng hoá tất nguồn cacbon, nguồn nitơ khảo sát 145 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ Nguồn carbon tốt cho sinh trưởng với chủng M1 tinh bột, với chủng M2 M3 glucose Nguồn nitơ tốt cho sinh trưởng chủng M1 cao thịt, chủng M2 bột đậu, chủng M3 NH4Cl 3.2.3 Khả sinh enzyme ngoại bào ba chủng nấm sợi Biểu đồ 3.2 Hoạt tính enzyme ba chủng nấm sợi D-d (cm)3 2.5 2.5 2.4 2 1.5 2 1.8 M1 1.3 0.9 1.2 1.05 M2 M3 0.5 Enzyme Amylase Protease Cellulase Pectinase Qua Biểu đồ 3.2 thấy : Ba chủng nấm sợi có khả sinh loại enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase Chủng M1 sinh enzyme amylase mạnh Chủng M2 sinh enzyme protease cellulase mạnh Chủng M3 sinh enzyme pectinase mạnh 3.2.4 Khả phân giải dầu chủng nấm sợi Cả ba chủng nấm sợi có khả phân giải dầu, chủng M1 có khả phân giải dầu mạnh nhất, chủng M2 M3 phân giải dầu yếu 146 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 Hình 3.6 Khả phân giải dầu ba chủng nấm sợi 3.3 Bước đầu tìm hiểu tác dụng DKS BT chủng nấm sợi tằm sâu tơ Nhằm tìm hướng ứng dụng cho ba chủng nấm sợi nghiên cứu, tiến hành khảo sát tác dụng BT DKS chúng sâu tơ tắm, kết trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.7 Khả diệt tằm chủng nấm sợi Chủng M1 M2 M3 DKS BT DKS BT DKS BT Tỉ lệ tằm chết (%) 100 76,7 83,3 23,3 76,7 60 Thời điểm (ngày) 11 Mức độ diệt tằm Mạnh 15 15 15 15 15 Mạnh Mạnh Yếu Mạnh Khá mạnh Bảng 3.8 Khả diệt sâu tơ ba chủng nấm sợi Tỉ lệ sâu chết (%) Thời gian (ngày) Mức độ diệt sâu tơ DKS 50 10 Khá mạnh BT 20 10 Yếu Chủng M1 147 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM M2 M3 Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ DKS 34,6 10 Yếu BT 54,2 10 Khá mạnh DKS 66,7 10 Khá mạnh BT 34,4 10 Yếu Qua Bảng 3.7 thấy : Bào tử dịch kháng sinh ba chủng nấm sợi có khả diệt tằm DKS BT chủng M1, DKS chủng M2, DKS chủng M3 có khả diệt tằm mạnh, mạnh DKS chủng M1 BT DKS ba chủng nấm sợi có khả diệt sâu tơ DKS chủng M1, BT chủng M2, DKS chủng M3 diệt sâu tơ mạnh, mạnh DKS chủng M3 Kết luận Kết khảo sát hoạt tính kháng sinh ba chủng nấm sợi RNM cho thấy : + Chủng M3 kháng khuẩn mạnh Chủng M2 kháng nấm mạnh đồng thời có phổ tác dụng rộng + Đã xác định phương pháp thu nhận CKS từ dịch lên men tối ưu + Đã xác định thời gian sinh kháng nhiều M1 120h, M2 48h, M3 : 72-120h + Đã xác định độ bền nhiệt CKS ba chủng nấm sợi : M1 M2-1000C/40 phút, M3-30-1000C/60 phút Đã định danh + Chủng M1 thuộc chi Acremonium + Chủng M2 thuộc chi Trichoderma + Chủng M3 loài Botryotrichum piluliferum Sacc & March 148 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 + Trên sở chúng tơi xác định đặc tính sinh học khác khả sinh enzym ngoại bào, phân giải dầu, chịu nhiệt, chịu mặn, đồng hoá nguồn carbon, nitơ ba chủng nấm sợi Bước đầu thử nghiệm DKS BT ba chủng nấm sợi sâu tơ tằm cho thấy : DKS chủng M1 có tác dụng tằm mạnh nhất, DKS chủng M3 có tác dụng sâu tơ mạnh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học kĩ thuật, 144 tr [2] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, NXB Khoa học kĩ thuật, tr.160-235 [3] Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, 201tr [4] Bùi Xuân Đồng (1986), Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam, tập 1-2, NXB Khoa học kĩ thuật [5] Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định Thái Thụy, Thái Bình, Luận văn thạc sĩ khoa học, ĐHSP Hà Nội [6] Robert A.Samson, Ellen S.Hoekstra, Jens C.Frisvad (2004), Introduction to food- and airbone fungi, Centraalbureau voor Schimmelcultures_Utrecht, 389pp Tóm tắt Khảo sát đặc điểm số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại Ba chủng nấm sợi nghiên cứu có khả kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt phổ rộng, đặc biệt khả kháng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh Đã xác định đặc điểm chất kháng sinh đặc điểm sinh học, phân loại đến loài ba chủng nấm Bước đầu thử nghiệm tác dụng chất kháng sinh bào tử nấm sợi ấu trùng tằm sâu tơ hại rau cải cho kết tốt 149 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ Abstract Surveying characteristics some of strains filamentous fungi with antibiotic against organisms causing diseases Our three filamentous fungi strains have ability to produce antibiotic They are effective against bacteria, mold, especially, bacteria which are resistant to many kinds of antibiotic The suitable method and time to get the antibiotic were determined We also determined identifical and biological characteristics of the fungi Both spores and antibiotic of the filamentous fungi can kill silkworm and diamondback moth 150 ... tắt Khảo sát đặc điểm số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại Ba chủng nấm sợi nghiên cứu có khả kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt phổ rộng, đặc biệt khả kháng vi khuẩn gây bệnh kháng. .. dịch kháng sinh ba chủng nấm sợi có khả diệt tằm DKS BT chủng M1, DKS chủng M2, DKS chủng M3 có khả diệt tằm mạnh, mạnh DKS chủng M1 BT DKS ba chủng nấm sợi có khả diệt sâu tơ DKS chủng. .. 144 Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TP.HCM Số 12 năm 2007 3.2.2 Các đặc điểm sinh học ba chủng nấm sợi Bảng 3.6 Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa ba chủng nấm sợi Các đặc điểm Khả chịu nhiệt Khả chịu mặn