Chiết tách , tinh sạch và khảo sát tác dụng đối kháng vi sinh vật của Salanin từ nhân hạt cây xoan Ấn Độ trồng tại Việt NamTài liệu được in trên tạp chí khoa học tập 44, số 2 - 2006- Vũ Văn Độ, Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Ngọc Hạnh -
24 TP CHÍ KHOA HC VÀ CÔNG NGH Tp 44, s 2, 2006 Tr. 24- 31 CHIT TÁCH, TINH SCH VÀ KHO SÁT TÁC DNG I KHÁNG VI SINH VT CA SALANIN T NHÂN HT CÂY XOAN N (Azadirachta indica A. juss) TR'NG TI VI(T NAM V V!N "#, NGUY&N TI(N TH)NG, NGUY&N TH* MINH, NGUY&N NGC HNH I. M U Cây xoan n còn gi là cây neem (Azadirachta indica A. juss) h Meliaceae !"c s# d%ng làm thu'c tr) sâu r*t có hi,u qu. / nhi0u n1i trên th3 gi4i [6, 8, 10]. Hi,n nay các nhà khoa hc ã phân lAp h1n 60 ch*t limonoid có kh. nBng gây ngán Bn và xua uDi côn trùng t) hGt và lá neem [1, 2, 3, 8, 9, 11]. J n!4c ta, cây neem ang !"c trKng nhi0u / các tLnh Nam Trung B nh! Ninh ThuAn, Bình ThuAn Q phR xanh vùng *t cát cSn cTi và c.i tGo *t bV hoang hóa nhW kh. nBng chVu hGn cao cRa cây. GYn ây chúng tôi ã báo cáo k3t qu. phân lAp azadirachtin, mt limonoid chính cRa nhân hGt neem trKng tGi Ninh ThuAn [12]. Trong bài này, chúng tôi trình bày ph!1ng pháp phân lAp và xác Vnh c*u trúc salanin, kh.o sát hoGt tính gây c t3 bào và kh. nBng kháng vi sinh vAt kiQm Vnh cRa salanin. II. NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP 1. Nguyên liu HGt neem (Azadirachta indica A. juss) !"c thu tGi khu r)ng neem trKng tGi huy,n Ninh Ph!4c, tLnh Ninh ThuAn vào tháng 7 nBm 2003, t) nh_ng cây 4 - 5 nBm tuDi. 2. Ph!"ng pháp và thi(t b* -PhD hKng ngoGi (IR) !"c o trên máy VECTOR 22, dùng viên nén KBr. -PhD kh'i l!"ng !"c o trên thi3t bV 1100 series LC/ MSD Trap, Agilent. -PhD cng h!/ng t) hGt nhân !"c o trên máy Bruker Avance 500 MHz. dVch chuyQn hóa hc !"c tính theo mppm so v4i TMS, hSng s' t!1ng tác (J) tính bSng Hz. -Phân tích soc kí l4p mpng trên b.n nhôm Silicagel Merck 60 F 254 tráng srn có dày 0,2 mm. - Soc kí ct s# d%ng silicagel Merck cs hGt 0,04 mm - 0,063 mm. - Soc kí lpng cao áp (HPLC) s# d%ng Yu dò DAD, ct Bondapack, C 18 , 3,9 × 300 mm. - iQm nóng ch.y !"c o trên máy Electrothermal IA 9000 series, dùng mao qu.n không hi,u chLnh. - Tác ng 'i kháng vi sinh vAt và gây c t3 bào !"c th# tGi phòng thí nghi,m th# hoGt tính sinh hc - Vi,n Hóa hc các h"p ch*t thiên nhiên, Hà Ni. III. K,T QU/ VÀ TH/O LU1N 1. Chi(t tách và phân l5p salanin 25 HGt neem thu !"c, sau khi loGi bp h3t vp và phYn thVt qu., !"c s*y 3n khô / 50 o C. 5 kg nhân hGt em li trích v4i ete dYu hpa (40 - 60 o C) bSng b chi3t Soxhlet. Sau khi loGi dung môi ete dYu hpa, thu !"c 970 g ctn dYu s,t, màu vàng nâu. HTn h"p dYu !"c ti3p t%c hòa tan trong methanol (MeOH). LoGi dung môi methanol, thu !"c 230 g ctn s,t màu vàng sAm. Ctn tan trong methanol cho chGy soc kí ct nhanh v4i h, dung môi là ete dYu hpa và chloroform v4i phân cvc tBng dYn. KiQm tra các phân oGn thu !"c sau soc kí ct bSng soc kí b.n mpng Q gom các phân oGn có R f gi'ng nhau. Ti3p t%c soc kí ct lYn 2 v4i các phân oGn giàu salanin thu !"c / trên, chúng tôi thu !"c 120 mg tinh thQ hình lBng tr% không màu, kí hi,u MS. Bng 1. PhD 1 H - NMR và 13 C - NMR cRa ch*t MS trong dung môi CDCl 3 , mppm V* trí H [500 MHz, J(Hz)] C (125 MHz) 1 4,96 t, j = 3 71,37 2 2,31 m 27,62 3 4,78 t, j = 3 71,37 4 42,75 5 2,81 d, j = 12,5 39,46 6 3,99 dd, j = 3; 12 72,65 7 4,18 d, j = 3 85,72 8 49,12 9 2,75 dd, j = 4; 8 39,98 10 40,65 11 2,22 m 30,72 12 172,80 13 134,89 14 146,60 15 5,44 m 87,93 16a 16b 2,13 d, j = 12 2,25 d, j = 12 41,43 17 3,64 d, j = 3,5 49,46 18 1,67 s 13,14 19 0,98 s 15,14 20 127,13 21 7,32 t, j = 1,5 142,94 22 6,29 m 110,63 26 23 7,26 138,83 2 8a 28b 3,69 d, j = 3 3,59 7 7,70 29 1,22 s 19,63 30 1,30 s 16,93 OCH 3 3,26 s 51,49 1’ 170,40 2’ 129,09 3’ 137,24 4’ 1,82 d, j = 1 14,35 41,43 5’ 6’ 1,94 s 1,94 s 11,92 20,87 2. Xác ;*nh c<u trúc MS có các tc tính sau: - iQm nóng ch.y: Mp = 156 o C (Hexan - Ete etilic) - PhD hKng ngoGi: Vmax (cm -1 ): 2953, 1727, 1701, 1650, 1483, 1264, 1141, 1054. - PhD kh'i l!"ng: 619 [M + Na] + . - PhD cng h!/ng t) hGt nhân 1 H - NMR và 13 C - NMR !"c o trong dung môi CDCL 3 và dVch chuyQn hóa hc mppm !"c trình bày / b.ng 1. - PhD cng h!/ng t) hGt nhân 2 chi0u 1 H - 1 H - COSY và HMBC !"c trình bày / b.ng 2, hình 1 và hình 2. Bng 2. Sv t!1ng tác 1 H - 1 H - COSY và HMBC cRa ch*t MS Vò trí COSY HMBC 1 H 1 – H 2 C 10 , C 9 2 H 2 – H 1 ; H 2 – H 3 C 5 3 H 3 – H 2 4 5 H 5 – H 6 C 19 , C 29 , C 10 , C 4 , C 1 , C 3 , C 7 6 H 6 – H 5 ; H 6 – H 7 7 H 7 – H 6 8 9 H 9 – H 11 27 10 1 1 H 11 – H 9 C 12 12 13 14 15 H 15 – H 16a ; H 15 – H 16b 16a 16b H 1 6 – H 1 5 H 16 – H 17 C 2 0 17 H 17 – H 16 C 20 , C 13 , C 23 , C 14 , C 15 , C 2 , C 8 18 C 8 K3t qu. nhAn !"c cho th*y: - PhD cng h!/ng t) hGt nhân 1 H – NMR cho th*y các proton cRa vòng furan có mppm là 7,32; 6,29 và 7,26 t!1ng }ng v4i vV trí H-21, H-22 và H-23, mt nhóm CH 3 - có m~i ôi / vV trí 4’ (b.ng 1). - PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u COSY cho th*y rõ sv t!1ng tác cRa H 1 – H 2 , H 2 – H 3 , H 5 – H 6 … (hình 1 và b.ng 2). - PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u HMBC cho th*y có sv t!1ng tác xa cRa H 1 v4i C 9 – C 10 , tc bi,t / vV trí H 5 t!1ng tác v4i carbon / vV trí 19, 29, 10, 4, 1, 3 và 7 (hình 2 và b.ng 2). Hình 1. PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u 1 H - 1 H - COSY cRa MS 28 Hình 2. PhD cng h!/ng t) hGt nhân hai chi0u HMBC cRa MS Dva vào phân tích phD cng h!/ng t) hGt nhân 2 chi0u và so sánh v4i các tài li,u ã công b' [4, 6], ch*t MS !"c xác Vnh chính là salanin có c*u trúc nh! sau: O O O O D C 1 5 6 7 15 17 13 H O O H 3 C H 3 C C H 3 C O O OCH 3 1' 2' 3' 2 3 4 8 9 10 19 6' 28 29 5 ' 4' 30 18 11 12 16 20 21 22 2 3 ây là lYn Yu tiên, salanin !"c kh.o sát c*u trúc bSng phD 1 H - 1 H - COSY và phD HMBC. 3. Xác ;*nh kh@ nAng gây ;Bc t( bào ng!Di Kh. nBng gây c t3 bào !"c th# nghi,m theo ph!1ng pháp hi,n ang !"c ti3n hành tGi vi,n nghiên c}u ung th! Qu'c gia cRa M„. Các dòng t3 bào ung th! ng!Wi: Hep - G2 (ung th! gan), Fl (ung th! màng t# cung), RD (ung th! màng tim). T3 bào ung th! !"c duy trì liên t%c / các i0u ki,n tiêu chu…n và !"c s# d%ng th# v4i các ch*t th# ã !"c chu…n bV srn / các nKng khác nhau trên phi3n vi l!"ng 96 gi3ng, phi3n th# nghi,m bao gKm: t3 bào, môi tr!Wng nuôi c*y và ch*t th#, !"c R / 37 o C Q t3 bào ti3p t%c phát triQn. Sau ó t3 bào !"c l*y ra c' Vnh, r#a, nhum và hòa lGi bSng dung dVch chu…n, c trên máy Elisa / b!4c sóng 515 - 540 nm. K3t qu. th# nghi,m c tính t3 bào cRa ch*t MS biQu hi,n bSng s' t3 bào s'ng sót (%), !"c ghi nhAn / b.ng 3. 29 Bng 3. Kh. nBng gây c t3 bào cRa MS SF t( bào sFng sót (%) STT Kí hiu mLu Hep-G2 F1 RD 1 DMSO* 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 2 Ch}ng (+)** 1,5 ± 0,09 1,05 ± 0,6 2,5 ± 0,02 3 MS 101,8 ± 1,1 102,8 ± 2,5 68,7 ± 1,5 * DMSO [Dimethyl sulfoxide, (CH 3 ) 2 SO)]: Dung dVch không, dùng làm 'i ch}ng trong trong thí nghi,m; ** Ch}ng(+): S# d%ng thu'c trV ung th! tc hi,u. Các k3t qu. nhAn !"c / trên cho th*y MS không gây c 'i v4i 3 dòng t3 bào Fl, RD và Hep-G2. 4. Xác ;*nh tính ;Fi kháng vi sinh v5t HoGt tính 'i kháng vi sinh vAt !"c thvc hi,n theo 2 b!4c: Bc 1: Th# Vnh tính theo ph!1ng pháp khu3ch tán trên thGch, s# d%ng khoanh gi*y lc t…m ch*t th# theo nKng tiêu chu…n. Các chRng vi sinh vAt kiQm Vnh gKm Gi di,n các nhóm sau: - Vi khu…n Gr (-): E. coli, P. aeruginosa. - Vi khu…n Gr (+): B. subtillis, S. aureus. - N*m m'c: Asp. niger, F. oxysporum. - N*m men: C. albicans, S. cerevisiae. Bc 2: Các mˆu cho hoGt tính d!1ng / b!4c 1 s‰ !"c ti3n hành th# ti3p b!4c 2 Q tính ra nKng }c ch3 t'i thiQu (MIC) theo ph!1ng pháp cRa Vanden Bergher và Vlietlink (1994) ti3n hành trên phi3n vi l!"ng 96 gi3ng. Kháng sinh kiQm Vnh bao gKm: Ampicilin, Tetracycline, Nystatin. + Mˆu thô có giá trV: MIC <= 200 ‹g/ ml, !"c coi là d!1ng tính kháng vi sinh vAt. + Mˆu tinh có giá trV: MIC <= 50 ‹g/ ml, !"c coi là d!1ng tính kháng vi sinh vAt. K3t qu. xác Vnh hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh cRa MS !"c trình bày / b.ng 4. Bng 4. K3t qu. xác Vnh hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh cRa MS Kí hiu mLu NNng ;B Oc ch( tFi thiPu MIC ( µg/ ml) Vi khu…n Gr(-) Vi khu…n Gr(+) N*m m'c N*m men E. coli P. aeruginosa B. substillis S. aureus Asp. niger Asp. oxysporum C. albicans S. cerevisiaeMS (_) (_) 25 (_) 12,5 25 12,5 25 30 K3t qu. nhAn !"c cho th*y MS có hoGt tính 'i kháng 5 vi sinh vAt kiQm Vnh, tc bi,t kháng mGnh A. niger và C. albicans. IV. K,T LU1N T) nhân hGt neem trKng tGi Ninh ThuAn chúng tôi ã phân lAp salanin / dGng tinh khi3t và kh.o sát c*u trúc bSng các ph!1ng pháp phD hi,n Gi, tc bi,t là phD cng h!/ng t) hGt nhân 2 chi0u COSY và HMBC cRa salanin !"c công b' lYn Yu tiên / Vi,t Nam. Salanin !"c kh.o sát hoGt tính gây c t3 bào ng!Wi và hoGt tính 'i kháng vi sinh vAt kiQm Vnh. K3t qu. cho th*y salanin không có tác d%ng gây c t3 bào ng!Wi nh!ng lGi có hoGt tính kháng 5 vi sinh vAt kiQm Vnh, tc bi,t kháng mGnh 'i v4i A. niger và C. albicans. TÀI LIU THAM KH/O 1. Bina S. Siddiqui and Munawwer Rasheed - Three new triterpenoids from Azadirachta indica, Helvetica Chimica Acta 84 (2001) 1962-1968. 2. Bina S. Siddiqui, Syed Tariq Ali, Munawwer Rasheed and Muhammad Nadeem Kardar - Chemical constituents of the flowers of Azadirachta indica, Helvetica Chimica Acta 86 (2003) 2787-2796. 3. S. P. Basak and D. P. Chakraborty - Chemical investigation of Azadirachta indica leaves, Journal of the Indian Chemical Society 45 (1968) 466-467. 4. R. Bryan Yamasaki, Thomas G. Ritland, Marka, Barnby, and James. A. Kloc - Isolation and purification of salanin from neem seeds and its quantification in neem and chinaberry seeds and leaves, (1988) 277-283. 5. De Silva, L. B., W. Stocklin and T. A. Geissman - The isolation of salanin from Melia dubia. Phytochemistry 8 (1969) 1817-1819. 6. H. S. Garg and D. S. Bhakuni - Salanoide, a meliacin from Azadirachta indica seed (neem oil), Journal of Ethnopharmacology 23 (1981) 39-51. 7. R. Henderson, R. Mc Crindle, A. Melera, and K. H. Overton - Tetranortriterpenoids - I. The constitution and stereochemistry of salanin, Tetrahedron 24 (1967) 1525-1528. 8. M. Jacobson - Review of neem research in the United States, In : Locke, J. C. and Lawson, R. H (Eds.), Proceeding of a workshop on neem potential in pest management, 1990. 9. W. Krans, M. Bokel, A. Klenk, and H. Pohnl - The structure of azadirachtin and 22, 23 - dihydro - 23 -ß – methocyazadirachtin, Tetrahedron letters (1985) 6435-6438. 10. H. Schmuttere, H. Properties and potential of natural pestisides from the neem tree, Azadirachta indica. Ann. Rev. Entomol. 35 271-290. 11. S. Siddiqui, T. Mahmood, B. S. Siddiqui, and S. Faizi - Isolation of triterpenoid from Azadirachta indica. Phytochemistry 25 (1986) 2183-2185. 12. V~ VBn , Nguy•n Ti3n Thong - Chi3t xu*t, tinh sGch và xác Vnh hàm l!"ng cRa azadirachtin trong hGt neem, TGp chí Sinh hc 27 (2) (2005) 57-60. 31 SUMMARY ISOLATION, PURIFICATION AND INVESTIGATION ON ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SALANIN FROM NEEM SEED KERNEl (Azadirachta indica A. juss) OF THE NEEM TREE PLANTED IN NINH THUAN PROVINCE, VIET NAM From the seed of the neem tree (Azadirachta indica A. juss), collected from Ninh Thuan province. For the first time, Salanin have been isolated, characterized and determinded molecular structure by spectroscopic analysis such as IR, MA, 1H - NMR, 13 C - NMR, COSY, HMBC. Salanin showed antimicrobial activity against B. subtillis, Asp. niger, F. oxysporum, C. albicans and S. cerevisiae. But, it was harmless for human cells. *+a ch,: Nh.n bài ngày 9 tháng 4 n2m 2005 V~ VBn , Nguy•n Ti3n Thong, Vi,n Sinh hc nhi,t 4i, Vi,n Khoa hc và Công ngh, Vi,t Nam. Nguy•n ThV Minh, Nguy•n Ngc HGnh, Vi,n Công ngh, hóa hc, Vi,n Khoa hc và Công ngh, Vi,t Nam. . 24 TP CHÍ KHOA HC VÀ CÔNG NGH Tp 44, s 2, 2006 Tr. 24- 31 CHIT TÁCH, TINH SCH VÀ KHO SÁT TÁC DNG I KHÁNG VI SINH VT CA SALANIN T NHÂN HT CÂY XOAN N (Azadirachta. 'i kháng 5 vi sinh vAt kiQm Vnh, tc bi,t kháng mGnh A. niger và C. albicans. IV. K,T LU1N T) nhân hGt neem trKng tGi Ninh ThuAn chúng tôi ã phân lAp salanin / dGng tinh khi3t và kh.o sát c*u. Bn và xua uDi côn trùng t) hGt và lá neem [1, 2, 3, 8, 9, 11]. J n!4c ta, cây neem ang !"c trKng nhi0u / các tLnh Nam Trung B nh! Ninh ThuAn, Bình ThuAn Q phR xanh vùng *t cát cSn cTi và