Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của cao chiết methanol và các phân đoạn từ địa y dirinaria applanata

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH c&d PHAN CẢNH TRÌNH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO CHIẾT METHANOL VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH c&d PHAN CẢNH TRÌNH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO CHIẾT METHANOL VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA Ngành: Công nghệ Dược phẩm Bào chế thuốc Mã số: 872.02.02 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN ĐINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Phan Cảnh Trình TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết methanol phân đoạn từ địa y Dirinaria applanata Phan Cảnh Trình Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Đinh Nga Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu Dirinaria applanata loài địa y phổ biến Việt Nam, nhiên chưa có báo cáo đầy đủ thành phần hóa học hoạt tính sinh học địa y Do đó, nghiên cứu tiến hành phân lập định hướng chất kháng VSV từ mẫu địa y thuộc loài này, thu hái thân Dừa huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre Đối tượng phương pháp nghiên cứu Địa y tiến hành định danh hình thái số phản ứng hóa học đặc trưng Chiết với dung môi khác xác định dung môi chiết tốt chất kháng VSV phương pháp khuếch tán đĩa giấy Phân lập định hướng chất kháng vi sinh vật từ cao tồn phần chiết dung mơi nhờ kỹ thuật sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển kỹ thuật kết tinh lại Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp tự sinh đồ phương pháp khuếch tán sử dụng để xác định phân đoạn chứa chất kháng khuẩn Kỹ thuật MS, NMR sử dụng để xác định cấu trúc chất Sử dụng phương pháp vi pha loãng để xác định giá trị MIC MBC chất phân lập Tiến hành xác định động học diệt khuẩn theo thời gian time-kill study Kết bàn luận Mẫu địa y nghiên cứu định danh Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi Cao toàn phần methanol chiết từ địa y ức chế vi khuẩn Gram dương nồng độ MIC < 200 µg/ml; đặc biệt S pyogenes (MIC ≤ 20 µg/ml), MRSA (MIC = 78,1 µg/ml) Qua sắc ký cột phân lập acid divaricatic acid atraric Acid divaricatic cho tác động kháng tốt vi khuẩn Gram dương, nấm men, nấm da; acid atraric khơng thể hoạt tính nồng độ thử 512 µg/ml Nồng độ MIC chất MRSA S pyogenes 32 µg/ml µg/ml Acid divaricatic chất diệt khuẩn phụ thuộc nồng độ MRSA chứng minh đường cong diệt khuẩn (time-kill curve) Kết luận đề nghị Acid divaricatic phân lập từ địa y Dirinaria applanata chất diệt khuẩn tốt, có tiềm ứng dụng trị liệu Từ khóa: Dirinaria applanata, kháng khuẩn, acid divaricatic ABSTRACT Master of Pharmacy Thesis – Academic year: 2017 – 2019 Antimicrobial activities of the methanol extract and fractions from the lichen Dirinaria applanata Phan Canh Trinh Supervisor: Associate Professor Nguyen Dinh Nga, PhD Background Lichen, Dirinaria applanata distributes very popular in Vietnam, however, there are not enough data for this species in terms of secondary metabolites and bioactivity The aim of this study is isolating and evaluating antimicrobial activity of Dirinaria applanata sample collected from Ben Tre province, Viet Nam Materials and method The nomenclature of this lichen sample was identified by morphology and some specific chemical reaction Lichen was extracted with many solvents to choose the best antimicrobial activity using disc diffusion assay The column vacuum chromatography, column chromatography, and recrystallization were applied to isolate compounds from methanol crude extracts TLC-bioautography and diffusion method were used to indicate antimicrobial fractions Chemical structures of the isolated compounds were interpreted by MS and NMR data MIC and MBC values of the purity compounds were evaluated by broth microdilution method according to CLSI M07-A11 (2018) Time-kill study was also carried out on the active compound Results The lichen sample was identified Dirinaria applanata (Fée) D D Awasthi Methanol crude extract displays the strong antibacterial effects on Gram positive bacteria with MIC < 200 µg/ml; especially, on S pyogenes (MIC ≤ 20 µg/ml) and MRSA (MIC = 78,1 µg/ml) Applying column chromatography, we collected purity compounds which were proven to be atraric acid and divaricatic acid Divaricatic acid possesses the good inhibitory capability on Gram positive bacteria, Candida albicans and dermatophytes, meanwhile, atraric acid does not show the activity at the testing concentrations, ≤ 512 µg/ml In particular, MIC value of divaricatic acid on MRSA and S pyogenes are 32 µg/ml and µg/ml, respectively Times kill kinetic assay demonstrated that divaricatic acid is a bactericidal and concentration-dependent compound on MRSA Conclusion Divaricatic acid, isolated from Dirinaria applanata, is the potential anti-MRSA compound Keywords: Dirinaria applanata, antimicrobial, acid divaricatic MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG xii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI ĐỊA Y 1.2 CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TỪ ĐỊA Y 1.2.1 Nguồn gốc hợp chất chuyển hóa thứ cấp địa y 1.2.2 Khái niệm số nhóm hợp chất địa y 1.3 VAI TRỊ VÀ CƠNG DỤNG 10 1.3.1 Thực phẩm 10 1.3.2 Địa chất học 11 1.3.3 Phân hủy sinh học 11 1.3.4 Chất màu 11 1.3.5 Y học cổ truyền 11 1.4 KHÁNG SINH TRONG ĐỊA Y 12 1.4.1 Trong dân gian 12 1.4.2 Một số liệu hoạt tính kháng VSV địa y 13 1.5 ĐỊA Y TRONG DƯỢC ĐIỂN CÁC NƯỚC 14 1.6 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT TRONG ĐỊA Y 14 1.6.1 Quy trình Cuiley cải tiến phân tích sơ thành phần hóa học 14 1.6.2 Phản ứng màu 15 1.6.3 Vi tinh thể hóa 15 1.6.4 Phổ UV 15 1.6.5 Phổ NMR 16 1.6.6 Phổ khối (MS) 17 1.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ PHÂN TÁCH HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y 18 1.7.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 18 1.7.2 Sắc ký cột cổ điển 18 1.7.3 Sắc ký cột chân không 18 1.8 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT 19 1.9 ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA 20 vi 1.9.1 Danh pháp 20 1.9.2 Danh pháp khác 21 1.9.3 Vị trí phân loại 21 1.9.4 Phân bố 21 1.9.5 Mơ tả hình thái 21 1.9.6 Tình hình nghiên cứu nước giới 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 26 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.1.1 Nguyên liệu 26 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm 26 2.2 HÓA CHẤT 27 2.3 THIẾT BỊ 27 2.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 28 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.5.1 Thu hái xử lý mẫu 29 2.5.2 Khảo sát đặc điểm thực vật học định danh 29 2.5.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật địa y 30 2.5.4 Khảo sát dung môi chiết chất kháng vi sinh vật 32 2.5.5 Điều chế đánh giá hoạt tính kháng VSV cao tồn phần 33 2.5.6 Phân lập chất có hoạt tính kháng vi sinh vật 33 2.5.7 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ ĐỊNH DANH DIRINARIA APPLANATA 41 3.1.1 Đặc điểm hình thái học 41 3.1.2 Kết định tính thành phần hóa học chỗ 43 3.1.3 Kết tinh vi tinh thể 43 3.1.4 Phát quang bước sóng UV 365 nm 44 3.2 PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y 45 3.3 DUNG MÔI CHIẾT CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT 46 3.4 HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO METHANOL 46 3.5 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHÂN ĐOẠN 48 3.5.1 Sắc ký cột chân khơng cao tồn phần methanol 48 3.5.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật cao phân đoạn 49 vii 3.5.3 Sắc ký lớp mỏng kết hợp tự sinh đồ 50 3.6 SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN CAO PHÂN ĐOẠN E 51 3.6.1 Sắc ký cột cổ điển cao phân đoạn E-2 52 3.6.2 Sắc ký cột cổ điển cao phân đoạn E-5 53 3.6.3 Tinh chế chất thu 54 3.7 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỤC TIÊU 54 3.7.1 Khảo sát độ tinh khiết DA-1 DA-2 sắc ký lớp mỏng 54 3.7.2 Sắc ký lỏng hiệu cao xác định độ tinh khiết 55 3.7.3 Xác định cấu trúc DA-1 DA-2 56 3.8 HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA DA-1 VÀ DA-2 58 3.8.1 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) DA-1 DA-2 vi sinh vật 58 3.8.2 Động học diệt khuẩn theo thời gian DA-2 (Time-kill curve) 59 3.9 BÀN LUẬN 61 3.9.1 Đặc điểm thực vật học phản ứng hóa học liên quan đến định danh 61 3.9.2 Acid atraric 61 3.9.3 Acid divaricatic 62 3.9.4 Về mặt phân bố loài ứng dụng 63 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 4.1 KẾT LUẬN 64 4.2 ĐỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC PL.1 PHỤ LỤC KHẢO SÁT DUNG MÔI CHIẾT CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT PL.1 PHỤ LỤC HOẠT TÍNH KHÁNG VSV CỦA CAO METHANOL PL.2 PHỤ LỤC HOẠT TÍNH KHÁNG VSV CỦA CAO PHÂN ĐOẠN PL.3 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ HPLC CỦA TỦA DA-1 PL.4 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ HPLC CỦA DA-2 PL.9 PHỤ LỤC PHỔ NMR CỦA DA-1 PL.12 PHỤ LỤC PHỔ NMR CỦA DA-2 PL.24 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Từ viết đầy đủ ATCC American Type Culture Collection BHA Brain Heart Infusion Agar BHI Brain Heart Infusion Broth CFU Colony Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DMSO Dimethyl sulfoxid HPLC High Performance Liquid Chromatography MBC Minimal Bactericidal Concentration (Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu) MHA Müller Hinton Agar MHAG MHA bổ sung 2% glucose MHB Müller Hinton Broth MHBG MHB bổ sung 2% glucose MIC Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin MS Mass Spectrometry (Khối phổ) MSSA Staphylococcus aureus nhạy methicillin NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) OD Optical density (Mật độ quang) PKS Polyketid synthase SDA Sabouraud Dextrose Agar ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng tản địa y Hình 1.2 Một số kiểu phát triển trung gian địa y Hình 1.3 Ví dụ địa y hợp chất địa y [15] Hình 1.4 Các đường chuyển hóa thứ cấp địa y [36] Hình 1.5 Cấu trúc monome bản: orcinol, β-orcinol, acid resorcylic, methyl phloroacetophenon hợp chất điển hình tạo từ monome Hình 1.6 Một số xanthon, anthraquinon, napthaquinon chromon từ địa y [15] 10 Hình 2.7 Địa điểm thu hái mẫu địa y Dirinaria applanata 26 Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28 Hình 2.9 Quy trình chiết dược liệu Ciuley cải tiến [1] 30 Hình 3.10 Tản địa y Dirinaria applanata thân dừa thu hái huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre, vào tháng 02 năm 2018, kích thước tương ứng cm 41 Hình 3.11 Tản địa y kính hiển vi soi nổi; (A) Khu vực tản thường nơi tập trung quan sinh sản bào tử phấn; (B) thuỳ xếp sát nhau, gấp nếp lơng chim từ tâm ra; (C) thuỳ có kích thước từ 0,4 – 2,0 mm Thanh kích thước tương ứng mm 42 Hình 3.12 Mặt cắt ngang tản địa y kính hiển vi soi (A) Lớp vỏ trên; (B) Bào tử phấn; (C) Lớp tảo; (D) Lớp tuỷ; (E) Lớp vỏ 42 Hình 3.13 Kết hoá định danh chỗ, mũi tên dấu vùng tuỷ 43 Hình 3.14 Tinh thể hình kim, chẻ nhánh vng góc kết tinh dịch chiết aceton, quan sát kính hiển vi quang học vật kính x 40 (C, D, E, F), vật kính x10 (A, B) Thanh kích thước thị 100 µm 44 Hình 3.15 Tản địa y phát huỳnh quang UV 365 nm (bên trái) Tản địa y ánh sáng trắng (bên phải) (A) Tản địa y non: tắt quang UV 365 nm, có số điểm phát quang, tương ứng vị trí xuất bào tử phấn (B) Bào tử phấn phát quang UV 365 nm (C) Tản già thối hố (D) vị trí bào tử phấn phát quang tản tuổi trung bình kích thước cm 44 Hình 3.16 SKLM phân đoạn UV 254 nm, UV 365 nm thuốc thử VS 49 x ... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH c&d PHAN CẢNH TRÌNH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO CHIẾT METHANOL VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ ĐỊA Y DIRINARIA APPLANATA. .. KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CAO METHANOL 46 3.5 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHÂN ĐOẠN 48 3.5.1 Sắc ký cột chân khơng cao tồn phần methanol 48 3.5.2 Khảo sát khả kháng vi sinh vật cao. .. địa y Để cung cấp chứng đ? ?y đủ chất có hoạt tính kháng vi sinh vật D applanata tiến hành đề tài ? ?Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cao Luận văn Thạc sĩ Dược học Đặt vấn đề chiết methanol phân