Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của loài địa y mọc trên thân cây dừa

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA LOÀI ĐỊA Y MỌC TRÊN THÂN CÂY DỪA Mã số: 97-18 Chủ nhiệm đề tài: DS PHAN CẢNH TRÌNH Tp Hồ Chí Minh, 03/2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA LOÀI ĐỊA Y MỌC TRÊN THÂN CÂY DỪA Mã số: 97-18 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 03/2019 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH STT Họ tên Phan Cảnh Trình Võ Lê Cơng Tráng Học hàm/ học vị Cơ quan công tác Dược sĩ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM Sinh viên Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM iii MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22 PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 31 THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 Tài liệu tham khảo 48 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Các chủng vi sinh vật dùng thử nghiệm 23 Bảng Các dụng cụ, thiết bị sử dụng đề tài 24 Bảng Hóa chất dung môi 25 Bảng Tiêu chuẩn đánh giá sơ mức độ kháng vi sinh vật qua vòng ức chế 29 Bảng Kết định tính thành phần hóa học chỗ 33 Bảng Bảng định tính hóa học theo qui trình Cuiley 36 Bảng Khối lượng cao toàn phần cao phân đoạn sắc ký cột chân không 37 Bảng Các vết tương ứng với Rf cao methanol toàn phần 38 Bảng Đường kính vịng ức chế vi sinh vật cao toàn phần (mm) 40 Bảng 10 Đường kính vịng ức chế vi sinh vật phân đoạn sau sắc ký cột chân không (mm) 41 v DANH MỤC HÌNH Hình Các dạng tản địa y Hình Axit protolichesterinic (1) axit lichesterinic (2) 11 Hình Axit pulvinic (3); methyl ester axit pulvinic (4); calycin (5) pulvinamid (6) 11 Hình Methyl paraben (7), methyl orsellinate (8), methyl β-orsellinate (9) methyl hematommate (10) 12 Hình Axit orsellinic (11), axit confluentic (12), atranorin (13) axit diffractaic (14) 12 Hình Axit physodic (15), axit norlobaric (16), axit salazinic (17) axit parellic (18) 13 Hình Usnic acid 13 Hình Anthraquinon (21), hypericin (22) naphthazarin (23) 14 Hình Địa điểm thu hái mẫu địa y Dirinaria applanata 23 Hình 10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26 Hình 11 Tản địa y Dirinaria applanata thân dừa thu hái Giồng Trôm, Bến Tre, vào tháng 02 năm 2018, kích thước tương ứng cm 31 Hình 12 Tản địa y kính hiển vi soi nổi; thuỳ xếp sát nhau, gấp nếp lông chim từ tâm (B), thuỳ có kích thước từ 0,4-2,0 mm (C) Khu vực tản thường nơi tập trung quan sinh sản dạng bào tử phấn (A) Thanh kích thước tương ứng mm 32 Hình 13 Mặt cắt ngang tản địa y kính hiển vi soi (A) Lớp vỏ trên; (B) Bào tử phấn; (C) Lớp tảo; (D) Lớp tuỷ; (E) Lớp vỏ 32 Hình 14 Bào tử túi có vách ngăn túi bào tử chứa tối đa bào tử 33 Hình 15 Kết hoá định danh chỗ, mũi tên dấu vùng tuỷ 33 Hình 16 Tinh thể đặc trưng kết tinh dịch chiết aceton, quan sát kính hiển vi quang học vật kính x40 (C, D, E, F), vật kính x10 (A, B) Thanh kích thước thị 100 µm 34 Hình 17 Tản địa y phát huỳnh quang UV 365 nm (bên trái) Tản địa y ánh sáng trắng (bên phải) (A) Tản địa y non: tắt quang UV 365 nm, có số điểm phát quang, tương ứng vị trí xuất bào tử phấn (B) Bào tử phấn phát quang UV 365 nm (C) Tản già thối hố (D) vị trí bào tử phấn phát quang tản tuổi trung bình kích thước cm 35 Hình 18 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao methanol toàn phần chiết từ địa y 38 Hình 19 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn cao n-hexan (H), cloroform (C1, C2, C3), đối chứng cao toàn phần (CTP) 39 Hình 20 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn ethyl acetat (E1, E2, E3); đối chứng cao toàn phần (CTP) 39 Hình 21 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn methanol (M1, M2, M3, M4, M5, M6); đối chứng cao toàn phần (CTP) 40 Hình 22 Kết tự sinh đồ E2 chủng MRSA 42 Hình 23 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn D 43 Hình 24 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng ba hệ dung môi 45 Hình 25 Tinh thể axit divaricatic [4] 46 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ DMSO Dimethyl Sulfoxide EA Ethyl acetat MeOH Methanol MHA Mueller Hinton Agar MIC Minimal Inhibitory Concentration SDA Sabouraud Dextrose Agar TSA Tryptic Soy Agar vii Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường Mở đầu MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Đề kháng kháng sinh trở thành mối lo ngại toàn giới nhiều năm trở lại Nhiều trường hợp vi khuẩn đề kháng với kháng sinh thuộc nhóm để dành tigercyclin colistin Trước tình Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (IDSA) khởi động dự án 10 x 20 nhằm huy động viện nghiên cứu hiệp hội phát triển 10 kháng sinh vào năm 2020 [1] Hầu hết kháng sinh tổng hợp xạ khuẩn vi nấm, nhiên hoạt động sàng lọc kháng sinh từ nhóm vi sinh vật ngày khó khăn số lượng nghiên cứu mức bão hoà Địa y hệ cộng sinh hai vi sinh vật, nấm tảo, có tiềm cao chất chuyển hố thứ cấp có hoạt tính sinh học chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư, hấp phụ tia UV-B, kháng viêm [2] Dirinaria applanata loài địa y phổ biến vùng nhiệt đới chưa nghiên cứu đầy đủ chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt Việt Nam Trong đề tài này, chúng tơi tiến hành “Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết methanol từ địa y Dirinaria applanata” với mục tiêu sau: Khảo sát đặc điểm thực vật học định danh địa y thu hái từ thân Dừa, huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre Chiết xuất khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao methanol Phân tách phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ cao Xác định nồng độ ức chế tối thiểu chất phân lập TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ ĐỊA Y Khái niệm phân loại Địa y kết cộng sinh vi nấm (mycobiont) phận quang hợp (photobiont phycobiont) thường tảo vi khuẩn lam (cyanobacterium) Tảo cung cấp chất từ q trình quang hợp, nấm có tác dụng bảo vệ cung cấp hợp chất tự nhiên cho tảo Sự cộng sinh giúp chúng tồn phát triển [3] Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường Mở đầu Sự xếp tảo hệ sợi nấm tạo thành cấu trúc tản đặc trưng với ba dạng gồm: Địa y khảm (crustose lichen) có bề dày tản mỏng bám chặt vào giá thể sợi nấm vùng tuỷ (Error! Reference source not found.-I) Địa y phiến (foliose lichen) có tản dạng phiến lá, mặt khác biệt rõ rệt Tản bám lỏng lẻo bề mặt giá thể rễ giả (Error! Reference source not found.-II) Địa y sợi (fruticose lichen) có tản dạng sợi giống bụi nhỏ, đứng bề mặt giá thể xõa xuống (Error! Reference source not found.-III) Hình Các dạng tản địa y Vai trị cơng dụng Từ lâu đời, quốc gia Châu Âu sử dụng địa y làm thực phẩm, phẩm nhuộm, nguyên liệu thô sản xuất nước hoa trị liệu y học cổ truyền Khoảng 700 địa y Evernia prunastri Pseudevernia furfuracea (gọi oakmoss) khai thác hàng năm Pháp cho ngành công nghiệp nước hoa Y học cổ truyền Trung quốc sử dụng 71 loài địa y thuộc 17 chi (9 họ) với mục đích làm thuốc chữa bệnh Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae, Cladionaceae sử dụng nhiều hết Một vài loại cao điều chế từ địa y sử dụng để trị bệnh khác Lobaria pulmonaria trị bệnh hô hấp, Xanthoria parientina điều trị vàng da, Usnea spp để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Ireland moss) trị tiêu chảy Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp trường Mở đầu Một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ địa y Từ lâu hợp chất từ địa y nghiên cứu hệ thống quốc gia Châu Âu, với nhiều hoạt tính sinh học đa dạng [4]: - Kháng sinh: depside, depsidone axit usnic có khả kháng vi khuẩn Gram dương - Kháng ung thư: axit usnic, protolichesterinic, axit nephrosteranic, polyporic dẫn xuất, axit physodalic, glucan dẫn xuất lichenin - Kháng HIV: muối sulfate acetyl glucan từ loài địa y Umbilicaria esculenta (Miyoshi) Mink có khả ngăn chặn phá hoại tế bào virus HIV ống nghiệm - Ngoài ra, số hợp chất cịn có tác dụng trợ tim (axit pulvinic), giảm đau, hạ sốt (axit usnic axit diffractaic), ức chế enzym (axit lecanoric, axit usnic…) ức chế phát triển thực vật (axit psoromic, axit virensic, axit usnic…) Thành phần hóa học địa y Có nhiều hệ thống phân loại hợp chất hóa học từ địa y, hệ thống phân loại sử dụng nhiều hệ thống phân loại Shibata cộng đề [5] Các hợp chất hóa học địa y chia làm ba nhóm dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp chúng Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone dẫn xuất acid tetronic Nguồn gốc acid mevalonic: terpenoid, steroid Nguồn gốc polyketide: depside, depsidone, quinones, xanthones, chromones, acid aliphatic Các chất chuyển hóa thứ cấp diện với lượng lớn địa y thường dựa vào chúng để phân loại, địa y khó phân biệt mặt hình thái học [4] Sau số nhóm hợp chất thường gặp địa y 10 37 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Chương Thành phần hóa học hoạt tính Bảng Khối lượng cao toàn phần cao phân đoạn sắc ký cột chân không Khối lượng(g) Độ ẩm (%) Cao tổng 93,0 11.82 n-hexan - Cloroform - Cloroform 0,10 - Cloroform 0,09 - Ethyl acetat 0,02 - Ethyl acetat 1,42 - Ethyl acetat 0,22 - Methanol 0,11 - Methanol 0,24 - Methanol 0,61 - Methanol 0,92 - Methanol 0,64 - Methanol (rửa cột) 0,06 - Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng Pha động Ba phân đoạn cao cloroform khảo sát hệ dung môi pha động gồm n-hexan : ethyl acetat; n-hexan : ethyl acetat : methanol, với tỷ lệ khác dung môi kèm thêm lượng nhỏ axit acetic băng Hệ C6H6 - EtOAC - AcOH = (7:3:0,2) cho vết tách rõ, gọn Sử dụng hệ dung môi cho khảo sát Tiến hành tương tự cho cao methanol toàn phần, cao phân đoạn ethyl acetat cao phân đoạn methanol thu kết hệ dung môi CHCl3 - EtOAC - AcOH = (9:1:0,2) phù hợp cho việc tách cao toàn phần phân đoạn ethyl acetat; CHCl3 – EtOAC - MeOH - AcOH (9:0,5:0,5:0,1) cho vết tách rõ, gọn cao methanol Pha tĩnh Pha tĩnh sử dụng mỏng silicagel 60 F254, Merck Kết sắc ký lớp mỏng Phân đoạn cloroform: C6H6 - EtOAc - AcOH (7:3:0,2) Phân đoạn ethyl acetat cao methanol toàn phần: CHCl3 - EtOAc - AcOH (9:1:0,2) Phân đoạn methanol: CHCl3 - EtOAc - MeOH - AcOH (9:0,5:0,5:0,1) Triển khai lần phát cách soi UV254, UV365 thuốc thử VS 38 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Cao methanol tồn phần: Trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao toàn phần với hệ dung môi CHCl3 - EtOAc - AcOH (9:1:0,2) cho vết tách 254; vết 365; vết thử VS với giá trị Rf trình bày Bảng 3.8 Hình 18 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao methanol toàn phần chiết từ địa y Bảng Các vết tương ứng với Rf cao methanol toàn phần Vết Rf Màu VS Màu UV365 0,06 - Phát quang 0,13 Đỏ nhạt - 0,16 - Hồng nhạt 0,19 Đỏ - 0,41 Tím - 0,56 Đỏ nhạt - 0,66 - Phát quang 0,69 - Hồng nhạt 0,78 Đỏ nhạt Hồng 10 0,88 Tím - Tiến hành tương tự với cao phân đoạn n-hexan, cloroform, ethyl acetat methanol; thu sắc ký đồ trình bày Error! Reference source not found., Error! Reference source not found., Error! Reference source not found 39 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Hình 19 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn cao n-hexan (H), cloroform (C1, C2, C3), đối chứng cao toàn phần (CTP) Hình 20 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn ethyl acetat (E1, E2, E3); đối chứng cao toàn phần (CTP) 40 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Hình 21 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn methanol (M1, M2, M3, M4, M5, M6); đối chứng cao toàn phần (CTP) KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT Sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật cao tồn phần Sau giai đoạn chiết xuất cao toàn phần với methanol, chúng tơi thu 93,0 gam cao tồn phần Cao tiến hành sàng lọc chủng vi sinh vật gây bệnh cho người phương pháp khuếch tán qua giếng với nồng độ mg/giếng Bảng Đường kính vịng ức chế vi sinh vật cao toàn phần (mm) Vi sinh vật K pneumoniae E coli P aeruginosa MRSA MSSA C albican C tropicalis S faecalis M canis T rubrum Đường kính vịng kháng (mm) 15,00 22,40 14,00 13,00 22,11 31,03 22,19 Nhận xét: Đánh giá độ mạnh sơ chúng tơi nhận thấy cao tồn phần có khả kháng mạnh chủng vi khuẩn gram dương S aureus đề kháng không đề kháng methicilin, S faecalis, ngồi chúng cịn có khả kháng nâm men C albicans, 41 Chương Thành phần hóa học hoạt tính C tropicalis nấm da T rubrum M canis Sử dụng chủng cho thử nghiệm Khảo sát khả kháng vi sinh vật thị cao phân đoạn Cao toàn phần sau sắc ký cột chân không thu 13 phân đoạn tiến hành đánh giá hoạt tính cao khuếch tán qua đĩa giấy với nồng độ mg/ đĩa giấy với chủng thị xác định mục 3.4.1 Kết thể Error! Reference source not found Bảng 10 Đường kính vịng ức chế vi sinh vật phân đoạn sau sắc ký cột chân không (mm) CÁC PHÂN ĐOẠN KẾT QUẢ THỬ CÁC PHÂN ĐOẠN MRSA MSSA CA CG CT n-Hexan - - - - - Cloroform - - 10 7 Cloroform - - 8 Cloroform 8 12 10 12 Ethyl acetat 11 11 14 11 12 Ethyl acetat 14 16 12 12 Ethyl acetat 15 16 10 9 Methanol 13 15 - - - Methanol 13 15 - - Methanol 12 15 11 10 Methanol 9 13 11 - Methanol 7 12 - Methanol (rửa cột) - - - - - CA: Candida tropicalis, CG: Candida glabrata, CT: Candida tropicalis Nhận xét: Theo liệu từ Error! Reference source not found chất kháng khuẩn, kháng nấm nằm phân đoạn phân cực trung bình đến mạnh Để xác định xác mục tiêu kháng khuẩn, chúng tơi tiến hành hình sinh học phân đoạn cao có hoạt tính kháng vi sinh vật trên, từ chọn lựa mục tiêu cho thí nghiệm Trong thời gian có hạn, chúng tơi tập trung khảo sát phân đoạn E2 phân đoạn có hoạt tính mạnh, sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng có vết với hàm lượng cao E1, E3; đồng thời có đầy đủ vết E1 E3 42 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Hiện hình sắc ký lớp mỏng Triển khai sắc ký lớp mỏng phân đoạn E2 với hệ dung môi CHCl3 – EtOAc – AcOH (95:5:0,2) Quan sát UV 254 kết thu vết có Rf là: 0,13; 0,48; 0,90 Tiến hành tự sinh đồ vi khuẩn đại diện MRSA thu kết Error! Reference source not found Hình 22 Kết tự sinh đồ E2 chủng MRSA Nhận xét: Trên tự sinh đồ xuất vịng kháng MRSA vị trí vết tắt quang UV 254, màu đỏ phun thuốc thử VS, có giá trị Rf = 0,13 Đây mục tiêu cho thí nghiệm Tiến hành lập mục tiêu sắc ký cột cổ điển Vết mục tiêu tách tốt với hệ dung môi CHCl3 – EtOAc – AcOH (9:1:0,2) giá trị Rf = 0,13 phù hợp cho sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột phân đoạn E2 Khảo sát điều kiện sắc ký cột cổ điển: Dùng pipet pasteur khảo sát hệ dung môi sắc ký cột cổ điển cho lượng mẫu nhỏ phân đoạn E2; rửa giải với CHCl3 – EtOAc (9:1) tăng dần lên tỉ lệ đến (0:10) phân đoạn E2, chọn hệ dung môi cho phân đoạn E2; cho thấy khả tách tốt đố Phân đoạn E2 đem sắc ký cột cổ điển có khối lượng 0,79 g, nạp mẫu khơ (trộn đồng lượng với 0,79 g silica gel cỡ nhỏ (40-63 µm)) Điều kiện sắc ký cột cổ điển: Pha tĩnh: 50 gam silicagel, cỡ nhỏ (40 – 63 µm) Pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1) tăng dần lên tỉ lệ (0:10) Cột thủy tinh trung tính dài 50 cm, đường kính 1,20 cm Thể tích phân đoạn: ml 43 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Kiểm tra phân đoạn SKLM phát với thuốc thử VS Với điều kiện sắc ký trên, thu gộp phân đoạn giống lại với thu được: Phân đoạn A: – (0,02 g) Phân đoạn B: – 20 (0,36 g) Phân đoạn C: 21 – 59 (0,15 g) Phân đoạn D: 60 – 114 (0,2 g) Phân đoạn E: 115 – 176 (0,01 g) Nhận xét: Cả phân đoạn C D có chứa mục tiêu phân lập PĐ-C có chứa nhiều tạp khơng PĐ-D Phân đoạn D sau gộp có vết tắt quang UV254, vết màu đỏ phun thuốc thử VS cách xa Hình 23 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng phân đoạn D Sắc ký cột cổ điển phân đoạn PĐ-D Phân đoạn D đem sắc ký cột cổ điển, khối lượng mẫu 0,15 g, nạp mẫu khô Điều kiện sắc ký: Pha tĩnh: 20g silicagel, cỡ hạt 40 – 63 µm Pha động: CHCl3 – EtOAc – CH3COOH băng (9:1:0,2) Cột thủy tinh trung tính dài 50cm, đường kính 1,2 cm Thể tích phân đoạn ml Kiểm tra phân đoạn SKLM phát với thuốc thử VS 44 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Với điều kiện sắc ký trên, thu 65 phân đoạn gộp phân đoạn giống lại với thu được: Phân đoạn a: 36 (11 mg) Phân đoạn b: 37 – 42 (77,3 mg) Phân đoạn c: 43 – 47 (8 mg) Phân đoạn b: cho methanol vào làm lạnh thu tủa b1, hút dịch lại cho vào lọ khác để kết tinh tự nhiên b2, hút dịch cho vào lọ khác để kết tinh tự nhiên b3, hút dịch cho vào lọ khác thu kết tinh b4 b1 :10,2 mg b2 : 10,0 mg b3 : mg b4 : 45,4 mg Phân đoạn b2 kiểm tra độ tinh khiết với ba hệ dung môi sắc ký lớp mỏng mục 3.4.5.1 Xác định phổ IR, MS H-NMR, dự đốn cấu trúc chất có hoạt tính Các phân đoạn b1, 3, lại tinh chế nhiều lần phương pháp kết tinh lại thu 4,6 mg tinh chất, xác nhận sắc ký lớp mỏng mục 3.4.5.1 Tiến hành xác định hoạt tính MIC Xác định cấu trúc mục tiêu Khảo sát độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng Hệ 1: CHCl3 – EtOAc – AcOH (9:1:0,2), Rf = 0,23 Hệ 2: CHCl3 – Aceton – MeOH – AcOH (8:1:1:0,4), Rf= 0,42 Hệ 3: CHCl3 – MeOH – AcOH (7:3:0,2), Rf = 0,71 45 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Hình 24 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng ba hệ dung môi Nhận xét: Với hệ dung môi kiểm tra tinh khiết sơ bộ, phân đoạn b2 đạt yêu cầu mặt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng Đề nghị kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế tối thiểu chất mục tiêu vi khuẩn Gram dương Chất mục tiêu dự đoán axit divaricatic; 4,6 mg chất sử dụng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn gram dương gồm MSSA, MRSA, Streptococcus faecalis phương pháp pha lỗng thạch, chúng tơi thu giá trị MIC chủng vi khuẩn 115 µg/mL Thí nghiệm lặp lại hai lần với kết giống BÀN LUẬN Đặc điểm thực vật học định danh Về mặt hình thái thực vật, khảo sát đặc điểm đại thể tản, đặc điểm vi thể cắt ngang, hoá định danh chỗ với mơ tả khố định danh địa y Bắc Mỹ, Keys to Lichens of North America [32] Kết tinh vi tinh thể dung dịch cồn 70:nước:glycerol (1:1:1) cho tinh thể đặc trưng giống mô tả axit divaricatic, xác định thành phần địa y thuộc chi Dirinaria tài liệu định danh hoá học [4] 46 Chương Thành phần hóa học hoạt tính Hình 25 Tinh thể axit divaricatic [4] Như vậy, đặc điểm thực vật vi hoá cho thấy địa y thu hái từ thân Dừa, Bến Tre Dirinaria applanata Thành phần hoá học địa y Sơ phân tích thành phần hố học địa y cho thấy tồn nhiều hợp chất phenol, phù hợp với hiểu biết trước thành phần hoá học địa y, chủ yếu hợp chất depside, depsidone [8] Tản địa y phát huỳnh quang UV 365nm chứng tỏ tồn nhiều hợp chất có khung cấu trúc cứng, khơng quay được, tạo hệ liên hợp kín Kết quan sát tản UV 365 nm cho thấy chất phát quang tập trung vị trí bào tử phấn, quan sinh sản địa y Qua khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng, thêm axit acetic băng vết sắc ký đồ tách rõ, gọn, không kéo vệt; chứng tỏ thành phần địa y có tính axit Hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật địa y tập trung vi khuẩn gram dương vi nấm Sau trình phân lập, thu phân đoạn b xác định tinh khiết ba hệ dung môi sắc ký lớp mỏng, với giá trị MIC Staphyloccocus aureus đề kháng methicilin, Streptococcus faecalis 115 µg/ml 47 Kết luận kiến nghị KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua trình thực đề tài, thu số kết sau: - Mô tả đặc điểm thực vật định danh địa y Dirinaria applanata thu hái từ thân Dừa, Bến Tre - Xác định cao chiết methanol từ địa y có hoạt tính Staphyloccocus aureus, Streptococcus faecalis, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Trichophyton rubrum Microsporum canis - Xác định mục tiêu kháng MRSA hình sinh học, tiến hành tách tinh chế thu phân đoạn b2 chất rắn màu trắng, kết tinh - Xác định MIC phân đoạn b Staphyloccocus aureus đề kháng methicilin, Streptococcus faecalis 115 µg/ml ĐỀ NGHỊ - Xác định độ tinh khiết phân đoạn b2 sắc ký lỏng hiệu cao - Xác định cấu trúc b2 phương pháp hoá lý - Tối ưu hoá điều kiện chiết xuất, tinh chế hợp chất phân đoạn b2 để tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học khác 48 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Abdelmohsen U R., Grkovic T., Balasubramanian S et al (2015), Elicitation of secondary metabolism in actinomycetes, Biotechnology advances 33 (6), 798-811 [2] Anandan R., Dharumadurai D., Manogaran G P (2016), "An introduction to actinobacteria", Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications, InTech [3] Arasu M V., Duraipandiyan V., Agastian P et al (2009), In vitro antimicrobial activity of Streptomyces spp ERI-3 isolated from Western Ghats rock soil (India), Journal de Mycologie Médicale 19 (1), 22-28 [4] Balouiri M., Sadiki M., Ibnsouda S K (2016), Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review, Journal of pharmaceutical analysis (2), 71-79 [5] Baltz R H (2007), Antimicrobials from actinomycetes: back to the future, MicrobeAmerican Society For Microbiology (3), 125 [6] Barka E A., Vatsa P., Sanchez L et al (2016), Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria, Microbiology and Molecular Biology Reviews 80 (1), 1-43 [7] Bhatti A A., Haq S., Bhat R A (2017), Actinomycetes benefaction role in soil and plant health, Microbial pathogenesis 111, 458-467 [8] Bộ môn Dược liệu (2017), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh, p 145 [9] Chen H (2013), Modern solid state fermentation, Netherlands: Springer, p 332 [10] Dashti Y., Grkovic T., Abdelmohsen U R et al (2014), Production of induced secondary metabolites by a co-culture of sponge-associated actinomycetes, Actinokineospora sp EG49 and Nocardiopsis sp RV163, Marine Drugs 12 (5), 3046-3059 [11] Domínguez-Pérez M., Tomé L I., Freire M G et al (2010), (Extraction of biomolecules using) aqueous biphasic systems formed by ionic liquids and aminoacids, Separation and Purification Technology 72 (1), 85-91 [12] Dorokhova L., Agre N., Kalakoutskii L et al (1970), Comparative study on spores of some actinomycetes with special reference to their thermoresistance, The Actinomycetales, Gustav Fischer Verlag, Jena 227-232 [13] Eisenstein B I., Oleson Jr F B., Baltz R H (2010), Daptomycin: from the mountain to the clinic, with essential help from Francis Tally, MD, Clinical Infectious Diseases 50 (Supplement_1), S10-S15 [14] Ezaki M., Iwami M., Yamashita M et al (1992), Biphenomycin A production by a mixed culture, Applied and environmental microbiology 58 (12), 3879-3882 [15] Fedeniuk R W., Shand P J (1998), Theory and methodology of antibiotic extraction from biomatrices, Journal of Chromatography A 812 (1-2), 3-15 [16] Fleming I., Nisbet L., Brewer S (1982), Target directed antimicrobial screens, Bioactive Microbial Products Search and Discovery Ed., JD BU'LOCK et al 107-130 [17] Gad A H (2017), Phylogenetic Diversity and Anti-MRSA Activity of Halotolerant Actinobacteria from sediments in Great Salt Plains, Oklahoma, bioRxiv 112649 [18] Greenwood D (2008), Antimicrobial drugs: chronicle of a twentieth century medical triumph, Oxford University Press, pp 209-268 [19] Hassan A., El-Barawy A., El Mokhtar M N (2011), Evaluation of biological compounds of Streptomyces species for control of some fungal diseases, J Am Sci (4), 752-760 [20] Hernández-Macedo M L., Barreto E N., de Souza Cavalcanti A C et al (Year), Antimicrobial potential of Actinomycetes by NRPS and PKS-I pathways, BMC proceedings, BioMed Central, 2014; p P175 [21] Holt J G., Williams S T., Holt (1989), Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol 4, Lippincott Williams & Wilkins 49 Tài liệu tham khảo [22] Igarashi M., Hayashi C., Homma Y et al (2000), Tubelactomicin A, a Novel 16Membered Lactone Antibiotic, from Nocardia sp, The Journal of antibiotics 53 (10), 10961101 [23] Ikeda H., Shin-ya K., Omura S (2014), Genome mining of the Streptomycesavermitilis genome and development of genome-minimized hosts for heterologous expression of biosynthetic gene clusters, Journal of industrial microbiology & biotechnology 41 (2), 233250 [24] Isaka M., Boonkhao B., Rachtawee P et al (2007), A xanthocillin-like alkaloid from the insect pathogenic fungus Cordyceps brunnearubra BCC 1395, Journal of natural products 70 (4), 656-658 [25] Jensen P R., Dwight R., Fenical W (1991), Distribution of actinomycetes in near-shore tropical marine sediments, Applied and environmental microbiology 57 (4), 1102-1108 [26] Jensen P R., Williams P G., Oh D.-C et al (2007), Species-specific secondary metabolite production in marine actinomycetes of the genus Salinispora, Applied and environmental microbiology 73 (4), 1146-1152 [27] Jiang Y., Li Q., Chen X et al (2016), "Isolation and cultivation methods of Actinobacteria", Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications, InTech [28] Kwon H C., Kauffman C A., Jensen P R et al (2006), Marinomycins A− D, antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the recently discovered genus “Marinispora”, Journal of the American Chemical Society 128 (5), 16221632 [29] Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2009), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, p 383 [30] Lertcanawanichakul M., Sawangnop S (2011), A comparison of two methods used for measuring the antagonistic activity of Bacillus species, Walailak Journal of Science and Technology (WJST) (2), 161-171 [31] Li Q., Chen X., Jiang Y et al (2016), "Cultural, physiological, and biochemical identification of actinobacteria", Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications, InTech [32] Li Q., Chen X., Jiang Y et al (2016), "Morphological identification of actinobacteria", Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications, InTech [33] Ludwig W., Klenk H.-P (2005), "Overview: a phylogenetic backbone and taxonomic framework for procaryotic systematics", Bergey’s manual® of systematic bacteriology, Springer, pp 49-66 [34] Luti K J K., Mavituna F (2011), Streptomyces coelicolor increases the production of undecylprodigiosin when interacted with Bacillus subtilis, Biotechnology letters 33 (1), 113-118 [35] Martins S., Mussatto S I., Martínez-Avila G et al (2011), Bioactive phenolic compounds: production and extraction by solid-state fermentation A review, Biotechnology advances 29 (3), 365-373 [36] Miyadoh S (1997), Atlas of actinomycetes, Society for Actinomycetes Japan [37] Nagai A., Khan S T., Tamura T et al (2011), Streptomyces aomiensis sp nov., isolated from a soil sample using the membrane-filter method, International journal of systematic and evolutionary microbiology 61 (4), 947-950 [38] Nedialkova D., Naidenova M (2005), Screening the antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from Antarctica [39] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2004), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, Thí nghiệm vi sinh vật học, Vol 2, NXB ĐHQG Tp HCM, p 463 [40] Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), Điều tra, nghiên cứu số hoạt chất có khả kháng vi sinh vật kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn, Đại học Quốc gia Hà Nội, p.^pp Pages 50 Tài liệu tham khảo [41] Nguyễn Quỳnh Uyển, Đinh Thúy Hằng, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2016), Sàng lọc chất kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn phân lập vườn Quốc gia Cát Bà, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology 27 (4) [42] Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Phương Nhuệ, Vũ Thị Hạnh Nguyên et al (2012), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn HLD 3.16 có hoạt tính kháng khuẩn phân lập từ vùng ven bờ biển Việt Nam, Vietnam Journal of Science and Technology 50 (5), 579 [43] Nigam P S.-N., Pandey A (2009), Biotechnology for agro-industrial residues utilisation: utilisation of agro-residues, Springer Science & Business Media [44] Olano C., Méndez C., Salas J A (2009), Antitumor compounds from marine actinomycetes, Marine Drugs (2), 210-248 [45] Pérez J., Muñoz‐Dorado J., Braña A F et al (2011), Myxococcus xanthus induces actinorhodin overproduction and aerial mycelium formation by Streptomyces coelicolor, Microbial biotechnology (2), 175-183 [46] Phan Thị Huyền, Huỳnh Thư, Phan Ngọc Uyên Phương et al (2015), Xạ khuẩn phân lập từ đất vùng ven Thành phố Hồ Chí Minh: nguồn kháng sinh tiềm năng, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ 18 (3K), 76-85 [47] Ramesh S., Mathivanan N (2009), Screening of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal, India for antimicrobial activity and industrial enzymes, World Journal of Microbiology and Biotechnology 25 (12), 2103-2111 [48] Salwan R., Sharma V (2018), "The Role of Actinobacteria in the Production of Industrial Enzymes", New and Future Developments in Microbial Biotechnology and Bioengineering, Elsevier, pp 165-177 [49] Selvameenal L., Radhakrishnan M., Balagurunathan R (2009), Antibiotic pigment from desert soil actinomycetes; biological activity, purification and chemical screening, Indian journal of pharmaceutical sciences 71 (5), 499 [50] Servin J A., Herbold C W., Skophammer R G et al (2007), Evidence excluding the root of the tree of life from the actinobacteria, Molecular biology and evolution 25 (1), 1-4 [51] Song Q., Huang Y., Yang H (2012), Optimization of fermentation conditions for antibiotic production by Actinomycetes YJ1 strain against Sclerotinia sclerotiorum, Journal of Agricultural Science (7), 95 [52] Verma E., Chakraborty S., Tiwari B et al (2018), "Antimicrobial Compounds From Actinobacteria: Synthetic Pathways and Applications", New and Future Developments in Microbial Biotechnology and Bioengineering, Elsevier, pp 277-295 [53] Waksman S A (1963), "The actinomycetes and their antibiotics", Advances in applied microbiology, Elsevier, pp 235-315 [54] Waksman S A., Woodruff H B (1941), Actinomyces antibioticus, a new soil organism antagonistic to pathogenic and non-pathogenic bacteria, Journal of bacteriology 42 (2), 231 [55] Xu L., Li W., Liu Z et al (2007), Actinomycete systematic—principle, methods and practice, Chinese Scientifi c Press, Beijing 11-13 [56] Yoo J C., Kim J H., Ha J W et al (2007), Production and biological activity of laidlomycin, anti-MRSA/VRE antibiotic from Streptomyces sp CS684, The Journal of Microbiology 45 (1), 6-10 51 ... Minh, 03/2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA LỒI ĐỊA Y MỌC TRÊN THÂN C? ?Y DỪA Mã số: 97-18... gọn, không kéo vệt; chứng tỏ thành phần địa y có tính axit Hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật địa y tập trung vi khuẩn gram dương vi nấm Sau trình phân lập, thu phân đoạn... đ? ?y đủ chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt Vi? ??t Nam Trong đề tài n? ?y, tiến hành ? ?Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết methanol từ địa y Dirinaria applanata” với mục tiêu sau: Khảo sát