Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi (Citrus maxima)

ii Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Ngọc Yên - TS Nguyễn Thị Lan Phi Cán chấm nhận xét : TS Phan Ngọc Hòa Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Hoài Hương Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 12 tháng 07 năm 2016 Thành phần Hội đồng đánh giả luận văn thạc sĩ gồm: PGS TS Đồng Thị Thanh Thu TS Nguyễn Hoài Hương TS Phan Ngọc Hòa TS Trần Thị Thu Trà TS Tôn Nữ Minh Nguyệt Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận Văn Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÓA XÃ HỘI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Quách Nhật Hoàng MSHV: 7140462 Ngày, tháng, năm sinh: 08.11.1988 Nơi sinh: Tây Ninh Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã số : 60 54 01 01 I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kháng oxy hóa dịch chiết từ hạt bưởi (Citrus maxima) II NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: + Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn nấm mốc) dịch chiết hạt bưởi trích li phương pháp co2 siêu tới hạn chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate theo hai phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) + Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa hai dịch chiết hạt bưởi kể phương pháp DPPH III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : - TS Trần Thị Ngọc Yên - TS Nguyễn Thị Lan Phi Tp HCM, ngày tháng năm 2016 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô hướng dẫn TS Trần Thị Ngọc Yên TS Nguyễn Thị Lan Phi Các cô người theo sát hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức kỹ suốt trình học tập Đồng hành suốt q trình học tập thực đề tài, tơi xin gửi lời cảm ơn đến chị Lan Chi, em Nam Hải, Hữu Thành bạn đồng học lớp Cao học Cơng nghệ thực phẩm khóa 2014 Cuối cùng, xin bày tỏ lòng kính u biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ gia đình đồng hành suốt trình học tập Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2016 Học viên Nguyễn Qch Nhật Hồng V TĨM TẮT Đề tài sử dụng dịch chiết hạt bưởi (Citrus maxima) có hoạt chất limonin trích li co2 siêu tới hạn chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate từ hạt bưởi Thanh Trà (Thừa Thiên Huế) để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa kháng vi sinh vật Dịch chiết hạt bưởi trích li co2 siêu tới hạn ethyl actetate có hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH với giá trị IC50 45,34 7,55 mg/mL Đề tài khảo sát khả kháng vi sinh vật dịch chiết hạt bưởi chủng vi sinh vật gây hư hỏng ngộ độc thực phẩm gồm có: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium solani Aspergillus flavus Kết cho thấy dịch chiết hạt bưởi trích li co2 siêu tới hạn có khả kháng chủng vi sinh vật nghiên cứu, ngoại trừ Aspergillus flavus Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL 160 mg/mL tương ứng với chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhỉ Pseudomonas aeruginosa Dịch chiết hạt bưởi trích li ethyl acetate có khả kháng chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa MIC Staphylococcus aureus 128 mg/mL > 192 mg/mL chủng Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa Ket khảo sát cho thấy dịch chiết hạt bưởi co2 siêu tới hạn có hoạt tính cao 1,3 lần so với dịch chiết hạt bưởi ethyl acetate Staphylococcus aureus vi ABSTRACT In this study, the antioxidant and antimicrobial activities of the supercritical carbon dioxide extract and the Soxhlet extract with ethyl acetate obtaining from Thanh Tra pomelo seed were investigated The IC50 values resulted from DPPH assay were found to be 45.34 mg/mL for supercritical carbon dioxide extract and 7.55 mg/mL for ethyl acetate extract The study has also examined the antimicrobial activity of pomelo seed extract extracts against the six food pathogenic microorganisms: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus flavus and Fusarium solani The supercritical carbon dioxide pomelo extract showed the strong effect against s aureus, B cereus, s typhi, p aeruginosa and F solani The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) values were 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL and 160 mg/mL for s aureus, B cereus, s typhi and p aeruginosa, respectively The ethyl acetate extract collected by using Soxhlet equipment showed the effect against s aureus, B cereus, s typhi and p aeruginosa The MIC of this extract was 128 mg/mL for s aureus and more than 192 mg/mL for B cereus, s typhi and p aeruginosa The results showed that the antibacterial activity on s aureus of the supercritical carbon dioxide pomelo seed extract was higher (1.3 times) compared to that of the ethyl acetate pomelo seed exttact LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu trình bày phần kết luận văn thân thực hiện, không chép người khác Nguyễn Quách Nhật Hoàng MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hạt bưởi 1.2 Một số phương pháp tách chiết 1.2.1 Trích li Soxhlet 1.2.2 Trích li CŨ2 siêu tới hạn 1.2.3 Trích li có hỗ trợ vỉ sóng 10 1.2.4 Trích li có hỗ trợ sóng siêu âm 11 1.3 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 12 1.3.1 Một sổ chủng vỉ khuẩn, vỉ nấm gãy bệnh thường gặp 12 1.3.2 Phương pháp xác định hoạt tỉnh kháng vỉ sinh vật 17 1.4 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa 18 1.4.1 Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl radical) 18 1.4.2 Phương pháp ABTS 19 1.4.3 Phương pháp ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) 19 1.4.4 Phương pháp TRAP (Total Radical - Trapping Antioxidant Potential) 20 1.4.5 Phương pháp FRAP (Ferric Reducing - Antioxidant Power) 20 1.4.6 Phương pháp Reducing power 20 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 21 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Chủng vi sinh vật 23 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chat mơi trường thủ nghiêm 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Khảo sát quy trình tách chiết phương pháp co2 siêu tới hạn 26 2.2.2 Khảo sát quy trình tách chiết Soxhlet sử dụng dung mơi ethyl acetate 27 2.2.3 Phãn tích hàm lượng lỉmonỉn bằngHPLC 27 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vỉ sinh vật 28 2.2.4.1 Phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn 28 2.2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 29 2.2.5 Phương pháp DPPHxác định hoạt tính kháng oxy hóa 30 2.3 Xử lý số liệu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Quy trình tách chiết dịch chiết hạt 31 3.1.1 Khảo sát quy trình tách chiết phương pháp co2 siêu tới hạn 31 3.1.2 Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate 34 3.1.3 Chuẩn bị mẫu dịch chiết thí nghiệm 36 3.2 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 36 3.2.1 Kết đo đường kỉnh vòng khảng vỉ sinh vật 36 3.2.2 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 38 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa phuơng pháp DPPH 39 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 4.1 Kết luận 41 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 53 PHỤ LỤC 55 PHỤ LỤC 57 PHỤ LỤC 59 PHỤ LỤC 61 PHỤ LỤC 63 PHỤ LỤC 65 PHỤ LỤC 66 PHỤ LỤC 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 24 Bảng 2.2 Thành phần môi trường Tryptone Soya Broth (TSB) 25 Bảng 2.3 Thành phần môi trường Potato Dextrose Broth (PDB) 25 Bảng 2.4 Thành phần môi trường Mueller - Hinton Agar (MHA) 25 Bảng 2.5 Thành phần môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) 25 Bảng 3.1 Nồng độ limonin theo nhiệt độ trích li 31 Bảng 3.2 Nồng độ limonin theo lượng đồng dung môi 32 Bảng 3.3 Nồng độ limonin theo áp suất 32 Bảng 3.4 Nồng độ limonin theo thời gian 33 Bảng 3.5 Nồng độ limonin theo thời gian 34 Bảng 3.6 Nồng độ limonin theo tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 35 Bảng 3.7 Kết đo đường kính vòng kháng khuẩn 36 Bảng 3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) DC1 DC2 39 Bảng 3.9 Giá trị IC50 dịch chiết hạt bưởi 40 54 - ị - I ị - I II— II - 2D.37E BB 1127.57715 1.44451ô-! Totals : 152.57982 1.1HIUMè44 152.579'3 Hỡnh 4.7 Mau khảo sát trích li CƠ2 siêu tới hạn 15 MPa RatTiao TypQ Arw hnt/hraâ Amount Grp Maw (nini ImALT* ■] tpfDiJ “ - I - I - -— I I— - J—I - ±0.661 an Totals 1ỜỦ5.Ễ4ÍS4 t 4«32»-i 145.723» ti-mnln HS.72ÍÌ5 55 3W.3M PHỤ LỤC 3: PHƠ HPLC HÀM LƯỢNG LIMMONIN TRONG DỊCH CHIÉT TRÍCH LI BẰNG CO2 SIÊU TỚI HẠN ĐÊ KHẴO SÁT ÁP SUẤT íetTtme Type [mini Area f toount Grp Name Amt/Area (PPM J mAt; * g ] ■I 2Ũ.a22 BB Totalg Ĩ 135.83 34 85 B334 Hình 4.9 Mau khảo sát trích ỉỉ CƠ2 siêu tới hạn 25 MPa Hình 4.8 Mau khảo sát trích li CO2 siêu tới hạn 20 MPa 56 PHỤ LỤC 4: PHÔ HPLC HÀM LƯỢNG LIMMONIN TRONG DỊCH CHIÉT TRÍCH LI BẰNG co2 SIÊU TỚI HẠN ĐÊ KHẢO SÁT THỜI GIAN —■—’—u—‘-“-r -*■—*—■—■—I—'—■—■—•—T—•—'—■—■—Ị—•—•—■—r—T—'—•—'—' • I •'—'—’—r~r RetTime [min ] 20.341 Totals ! Typs , í* area 1037.30355 15 w Amt/ftrea ■IfiSisr-L K Amount [ppm] I 30 D51.L7 30 Grp Name LLnonin 15O.0ML7 Hình 4.10 Mầu khảo sát trích li CƠ2 siêu tới hạn với thời gian 40 phút Hình 4.11 Mẩu khảo sát trích lỉ CO2 siêu tới hạn với thời gian 60 57 i!8 HạW■ j— mftU’s I 20.42.2 ÊB Totalc : APour.t [ppnj L±3.8J34S Mint 58 Ret Time Type [mln] Ai-e-a JwtVAzcia Amount Gip Home [mAU's] [ppm] I I - I I I I 20.304 BB Totals : 1LB2.Ĩ331B 1.443-S 3*-l 170.63270 LiiDOJiixi 170.63270 Hình 4.12 Mau khảo sát trích li C02 siêu tới hạn với thời gian 80 phút 59 PHỤ LỤC 5: PHỔ HPLC HÀM LỮỢNG LIMMONIN TRONG CAO CHIẾT ETHYL ACETATE ĐỀ KHẢO SÁT THỜI GIAN TRÍCH LI 1ỈU-C- HHTE íĩ ■AJ w- H đj 31 D■ âũ -Ị Signs1 1: C-AD1 C4 Rnf-36D, 0(1 HntTims Type Area Ant/firca Annum: lain] ImALI's] Qcp Name [ ppai I I - - 20.879 VB 483,95221 1.4757Be-l 71,27309 WJJI c 5g>zw.3 Llmonirt 1»|D MUTCĨMVUMŨMỈŨOCirq-l&ir M H44«G irilãl Hình 4.13 Kết đo mẫu có thời gian chiết i w lí 3? signal 1! DADI c, 3i^-210rẸ R$r=?60r1 oa RẹtTlỉĩie Type [min] Areíi [rrAD^s] a Amt/Ar«a Amount Grp ỊI.1Ĩ1S [-ppml I - I I - I - I Hình 4.14 Kêt đo mâu cố thời gian cbỉêt 60 2Ữ.Í5L BB Ệ23,ei3Ểá ls4531&e-l 119,71231 Limonin Hình 4.14 Kêt đo mâu cố thời gian cbỉêt 61 RatTinđ Type Aroa Amt/Area Anount Grp Name (nin) (mAU's) (ppcn) - - —I - I - I I— - I — I -20.440 HH 10Q2.Ỉ7213 1.44742c-l L45.15S17 Linonin Hình 4.15 Kết đo mẫu có thời gian chiết wrJa-i L ■ PetTime Type [mlJil ? ĩ m Area flmt/Rrea Amount Grp ■Nine &dMJ*3] [ppnj 31PỘ15 VB 97ỉ,412Ệ0 l,J4825a-l LJ[},Í125Ễ1 Limanin Hình 16 Ket đo mẫu có thời gian chiết 62 PHỤ LỤC 6: PHỔ HPLC HÀM LƯỢNG LIMMONIN TRONG CAO CHIẾT ETHYL ACETATE ĐẺ KHẢO SÁT TỶ LỆ NGUYÊN LIỆU/DUNG MÔI t>L Kill 11 PLaza* ‘j ; :Z n'l -L.'Tiili :IL J-lL I^r> ■u Bt- n f Ỉá 41 B 9ÌS a Ị tii — * J I ?Éi i1 -i 3® B -St Ì ■< _ .IL Signal 1: rưu?l Cr Slg-210,0 „3È 1' F fl J0- t0,1Dữ EstTÍBa Typa Area Amt/Area asnoant Crp Nầma I rủiĩt I [túAU*B I I ppm I - I - I - —-I - I I I 24.722 HH fiO2,9ỂŨ2L 1.4Ỉ39&B-1 11Ể.74697 Limonln Hình 4.17 Kết đo mẫu có tỷ lệ ngun liệu:dung mơi 1:30 (g:ml) ■ụ" ũADlC UirttlDI-Ari-MŨ -KM pĩikHj:>JữliW*lAMiWCH-2E>HJIttì-SM ‘ù41-IÙGIj T?ư.ŨỊ M- » « 17 ■M - s _ tì ã _ ã a _ a _ tt 23 Signal 1: UADI c, $ig=210,S Ref=ie0,100 PetTiĩỉ.e Type Area Amt/Area Amount Grp Name [min] [tnAU*a] 20.440 BB 10Ũ2.Ế7213 1.44ĩ42e-l [ppm] 14S.1S81? Limonln Hình 4.18 Ket đo mẫu có tỷ lệ ngun liệu:dung mơi 1:20 (g:ml) 63 r.x^j-iijH Rrt Wi.-Oj |5 ÍỦHẠMSAM k-::H::ij ỊB,tijưo* u U^IT fliỉ m Signal 1: DADI c, Siq-210,8 Ref-360,100 RetTire Type Area Crninl 20.814] VB An tỳ Area [mAU*3| Amount- Grp Name [ppn.l 1218.419963 1.44276Ù-1 175.80068 Limon in Hình 4.19 Kết đo mẫu có tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 1:10 (g:ml) D*P1 c sịrHM IP HPLCiKiaHQMoiMaũop ĨOIỊ-IS-M 154 -ríui (»1201 RetTLme Type Area amt/Area Amount Grp Name [min] 20.430 BB 1250.50769 1.4']221e-l [mAU^s] IppmI 180.34930 Hình 4.20 Ket đo mẫu có tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi 1:05 (g:ml) 64 PHỤ LỤC 7: HÌNH ĐỮỜNG KÍNH VỊNG KHÁNG KHN CÙA DỊCH CHIẾT TRÍCH LI BẰNG co2 SIÊU TĨa HẠN (DỊCH CHIẾT 1) Hình 4.21 Khả kháng Hình 4.22 Khả kháng Staphylococcus aureus DC1 Bacillus cereus DC1 Hình 4.23 Khả kháng Hình 4.24 Khả kháng Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi DC1 Hình 4.25 Khả kháng Fusarium solani DC1 65 PHỤ LỤC 8: HÌNH ĐƯỜNG KÍNH VỊNG KHÁNG KHUẲN CỦA DỊCH CHIẾT TRÍCH LI BẰNG ETHYL ACETATE (DỊCH CHIẾT 2) Hình 26 Khả kháng Hình 27 Khả kháng Staphylococcus aureus DC2 Bacillus cereus DC2 Hình 4.28 Khả kháng Pseudomonas aeruginosa DC2 Hình 4.29 Khả kháng Salmonella typhi DC2 66 PHỤ LỤC 9: KẾT QUẢ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT HẠT BUỞI Bảng 4.1 Hoạt tính kháng oxy hóa Dịch chiết LI LI Ao LI LI 0,640 0,640 0,640 0,640 10 0,345 0,346 0,349 0,347 45,83 Dịch 100 0,288 0,288 0,289 0,288 55,00 chiết 200 300 0,230 0,175 0,234 0,175 0,232 0,176 0,232 0,175 63,75 72,66 400 0,143 0,143 0,143 0,143 77,65 Ao 0,402 0,403 0,401 0,402 0,300 0,303 0,301 0,301 25,12 Dịch 0,257 0,256 0,256 0,256 36,32 chiết 0,224 0,189 0,224 0,187 0,234 0,255 0,189 0,188 41,79 53,23 10 0,161 0,162 0,160 0,161 59,95 45,34 7,55 67 y= 0.0828X + 46.246 Dịch chiết R2 = 0.9879 'I _■ Hình 4.30 Đi ' thị phin trăm ức chế Dịch chict King phương pháp DPPH Ấ y= 4.3285X+17.311 DỊchctdêt 70 , R =0i9896 60 50 40 30 ị Lr-' 20 r r 10 ) Ế ỉ lữ 12 Hình 4.31 Đo thị ph^n trăm ức chế Dịch chiết bạng phương pháp DPPH 68 TÓM TẮT LÝ LỊCH KHOA HỌC Bản thân Họ tên: Nguyễn Quách Nhật Hoàng Phái: Nữ Sinh ngày: 08/11/1988 Noi sinh: Tây Ninh Dân tộc: Kinh Email: nhathoang9217 @ gmail.com Quá trình đào tạo a ĐẠI HỌC T't nghiệp trường: Đại Học Dân Lập Văn Lang Ngành học: Cơng nghệ Sinh học Loại hình đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo: từ năm 2007 đ^n năm 2011 b SAU ĐẠI HỌC Thời gian đào tạo: từ năm 2014 đ^n năm 2016 Chuyên ngành: Công nghệ thực phàm Ngày bảo vệ luận văn: 12/07/2016 trường Đại học Bách Khoa Tp HCM Quá trình học tập làm việc thân (từ học đại học đen nay) Ket hoạt động khoa học, kỹ thuật Khả chuyên môn, nguyện vọng hoạt động khoa học, kỹ thuật Lòi cam đoan Tôi xin cam đoan nội dung khai thật ... TÀI: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kháng oxy hóa dịch chiết từ hạt bưởi (Citrus maxima) II NHỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: + Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn nấm mốc) dịch chiết hạt bưởi. .. định hoạt tính kháng oxy hóa dịch chiết từ hạt Citrus Mandahi cộng sử dụng phương pháp DPPH để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa dịch chiết từ hạt năm loài bưởi Mexican khác nhau, dịch chiết chiết... thu dịch chiết hạt bưởi Dịch chiết hạt bưởi sử dụng cho thử nghiệm khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kháng oxy hóa 2.1.2 Chủng vi sinh vật Sử dụng bốn chủng vi khuẩn hai chủng nấm mốc để khảo