KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THÔ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus) TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THÔ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus) TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực :BÙI THỊ NGỌC HÂN Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THƠ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus) TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS NGUYỄN TẤT TOÀN BÙI THỊ NGỌC HÂN BSTY NGÔ BÁ DUY Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tất Tồn BSTY Ngơ Bá Duy – Người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ bước tơi suốt q trình nghiên cứu, thực luận văn Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Bộ môn Công nghệ sinh học Bộ môn Nội Dược – Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng Các hợp chất thiên nhiên – Viện Cơng nghệ hóa học tận tình giúp đỡ tạo điều kiện để giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn ba, mẹ, anh, chị tất bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn i TÓM TẮT Khoa học phát triển, nhà khoa học phát nhiều nhược điểm tác dụng phụ loại kháng sinh tổng hợp Bên cạnh đó, có nhiều loại thuốc có tác dụng dược lý, sử dụng dược liệu Theo kết điều tra Viện Dược liệu năm 2006, Việt Nam có 3.948 lồi thực vật nấm dùng làm thuốc, có khoảng 185 thuốc có giá trị sử dụng cao Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) biết đến loại thuốc có tác dụng dược lý: hạn chế viêm gan, bảo vệ phục hồi tế bào gan, đặc biệt Diệp hạ châu đắng có khả kháng khuẩn nhiều loại vi khuẩn Nghiên cứu tiến hành nhằm điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng, định hàm lượng Phyllan – thin Hypophyllanthin cao thơ, từ xác định khả kháng khuẩn cao thô chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết lạnh nhiệt độ phòng với dung mơi Methanol để điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus), sau sử dụng HPLC xác định hàm lượng Phyllanthin, hàm lượng Hypophyllanthin cao thô xác định MIC, MBC cao thơ phương pháp pha lỗng liên tục môi trường MHA BHI Kết điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng với hiệu suất lần chiết lần chiết tương ứng 3,70 % 6,21 % Ẩm độ cao thô lần chiết lần chiết 2: 13,01 % 17,36 % Kết phản ứng HPLC định lượng hàm lượng Phyllanthin hàm lượng Hypophyllanthin cao thô qua lần chiết: Phyllanthin 0,308 % 0,446 %, Hypo – phyllanthin 0,049 % 0,136 % Cao thô Diệp hạ châu đắng có hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn Gram âm, Gram dương ức chế vi khuẩn mạnh nồng độ 12,5 mg/ml (ức chế 100 %) ức chế yếu nồng độ 3,125 mg/ml (< 25 %) Xác định MIC MBC cao thô Diệp hạ châu đắng thu kết quả: cao thô ức chế Staphylococcus aureus ATCC MIC > 3,125 mg/ml, Bacillus subtilis ATCC, Streptococcus pyogenes ATCC, Salmonella typhimurium ATCC, Shigella flexerneri ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml ii SUMMARY “Antibacterial activity of Phyllanthus amarus extracts crude on some Gram negative and Gram positive using a high-throughput 96 well plate assay” First, Phyllanthus amarus was extracted with the methanolic solution Then, P amarus extracts crude were determined the Phyllanthin and Hypophyllanthin substance by HPLC Finally, MIC and MBC of P amarus extracts crude were determined by microtitre plate method on Gram negative and Gram positive bacteria: Staphylococcus aureus ATCC, Bacillus subtilis ATCC, Streptococcus pyogenes ATCC, Salmonella typhimurium ATCC, Shigella flexerneri ATCC The result: the performance of Phyllanthus amarus extracts crude of both first and second extracts were 3,70 %; 6,21 % and the humidity were 13,01 %; 17,36 %, respectively Phyllanthin and Hypophyllanthin substance of the two extracts were Phyllanthin: 0,308 % and 0,446 %; Hypophyllanthin: 0,049 % and 0,136 % P amarus extracts crude obtained antibacterial activity on Gram negative and Gram positive bacteria Inhibition of P amarus extracts crude to the bacterial growth were 100 % at 12,5 mg/ml and >= 25 % at 3,125 mg/ml The MIC of P amarus on Bacillus subtilis ATCC, Streptococcus pyogenes ATCC, Salmonella typhimurium ATCC, Shigella flexerneri ATCC at 3,125 mg/ml, Staphylococcus aureus ATCC at >3,15 mg/ml and the MBC of P amarus to experimental bacteria at 12,5 mg/ml Key words: P amarus extracts crude, antibacterial activity, HPLC, Phyllanthin, Hypophyllanthin, MIC, MBC iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary .iii Mục lục .iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình .ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nhóm vi khuẩn liên quan đến nghiên cứu 2.1.1 Staphylococcus aureus 2.1.2 Bacillus subtilis 2.1.3 Streptococcus pyogenes 2.1.4 Salmonella typhimurium 2.1.5 Shigella flexerneri 2.2 Giới thiệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 2.2.1 Vị trí phân loại 2.2.2 Hình thái phân bố iv 2.2.3 Tính chất 2.2.4 Thành phần hóa học 2.2.4.1 Phyllanthin 2.2.4.2 Hypophyllanthin 2.2.5 Tác dụng dược lý 2.3 Sơ lược chiết suất hợp chất thiên nhiên 11 2.4 Sơ lược sắc ký 13 2.4.1 Đại cương sắc ký 13 2.4.2 Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 13 2.5 Sơ lược phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 14 2.5.1 Phương pháp khuếch tán thạch 15 2.5.2 Phương pháp pha loãng môi trường lỏng 15 2.5.3 Nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu 16 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 16 3.2.2 Hóa chất sử dụng 16 3.2.3 Dụng cụ thiết bị 16 3.2.4 Vi khuẩn dùng thí nghiệm 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 17 3.3.2 Định lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô HPLC 20 3.3.3 Khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng (P.amarus) 21 v 3.3.3.1 Chuẩn độ vi khuẩn 21 3.3.3.2 Thử tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng (P.amarus) 22 3.3.3.3 Xác định MIC, MBC cao thô Diệp hạ châu đắng (P.amarus) 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 26 4.1.1 Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng (P amarus) 26 4.1.2 Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 27 4.2 Định lượng Phyllanthin Hypophyllanthin caothô HPLC 28 4.3 Khảo sát tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng(P amarus) 30 4.3.1 Thử tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng (P amarus) 30 4.3.2 Kết nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn cao thô 33 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 Tài liệu tham khảo 36 Phụ lục 40 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC: American Type Culture Collection BHI: Brain Heat Infusion Broth CFU: Clony – forming unit DMSO: Dimethyl Sulfoxide DNA: Deoxyribo Nucleic Acid HbsAg: Hepatitis B surface antigen HBV: Hepatitis B Virus HPLC: High-performance liquid chromatography MBC: Minimum Bactericidal Concentration – Nồng độ diệt tối thiểu MHA: Mueller Hinton Agar MIC: Minimum inhibitory concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth TSA: Tryticase – Soy – Agar vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Pha lỗng nồng độ cao thơ Diệp hạ châu đắng môi trường MHA 24 Bảng 3.2 Pha lỗng nồng độ cao thơ Diệp hạ châu đắng môi trường BHI 24 Bảng 4.1 Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng qua hai lần chiết 26 Bảng 4.2 Hàm lượng vật chất khô ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng qua 27 Bảng 4.3 Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô 30 Bảng 4.4 Khả ức chế cao thô Diệp hạ châu đắng 31 Bảng 4.5 Giá trị MIC, MBC cao Diệp hạ châu đắng môi trường BHI 32 viii mA U Phyllanthin 14.849 Hypophyllanthin 13.951 13 14 15 16 17 18 mi Hình 4.2 Sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết bước sóng 280 nm Dựa vào sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllathin chuẩn lưu trữ hệ thống sở liệu Phòng Hợp chất thiên nhiên – Viện Cơng nghệ hóa học, TP Hồ Chí Minh, thấy khoảng thời gian từ phút thứ 13 đến phút thứ 15 khoảng thời gian xuất peak chuẩn Phyllanthin Hypophyllanthin Do so sánh với sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin mẫu cao thô Diệp hạ châu đắng khoảng thời gian tương ứng với thời gian xuất peak chuẩn, có xuất hợp chất kết luận peak xuất khoảng thời gian peak Phyllathin Hypophyllanthin Qua sắc ký đồ thu từ phản ứng HPLC, thấy lần chiết thời gian lưu Phyllanthin Hypophyllanthin có khác biệt lần chiết 1, thời gian lưu có khác biệt so với peak chuẩn so với lần (ở lần chiết 1, hợp chất Phyllanthin Hypo – phyllanthin xuất sắc ký đồ sớm so với lần chiết từ 0,5 đến 0, phút) Điều lần chiết 1, có tượng cột khơng ổn định Như thấy, tính ổn định cột có ảnh hưởng lớn đến kết phản ứng HPLC 29 Dựa hệ thống sở liệu quy trình định lượng, chương trình chạy thực sắc ký đường chuẩn xây dựng Phòng Hợp chất thiên nhiên – Viện Cơng nghệ hóa học, TP Hồ Chí Minh, kết hàm lượng hợp chất Phyllanthin Hypo – phyllanthin cao thô Diệp hạ châu thể Bảng 4.3 Bảng 4.3 Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô Diệp hạ châu đắng Lần chiết Phylanthin (%) Hypophyllanthin (%) 0,308 0,049 0,446 0,136 Qua Bảng 4.3 thấy hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao Diệp hạ châu đắng lần chiết cao lần chiết (Phyllanthin: 0,138 % Hypophyllanthin: 0,087 %) Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết có giá trị thấp kết nghiên cứu Arvind (2006) Srivastava (2008) (Phyllanthin: 0,074 %, Hypophyllanthin: 0,184 %) Sự khác biệt vùng địa lý, khác biệt điều kiện tự nhiên, điều kiện thời tiết, hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin Diệp hạ châu đắng có khác nhau, bên cạnh với dung môi sử dụng, phương pháp chiết dẫn đến khác biệt 4.3 Khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương 4.3.1 Thử tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng Sau tiến hành khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC, kết thí nghiệm ghi nhận trình bày Bảng 4.4 30 Bảng 4.4 Khả ức chế (%) cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Khả ức chế đến chủng vi khuẩn khảo sát nồng độ cao thô khác Vi khuẩn 50 25 12,5 6,25 3,25 1,561 Gram + S aureus ++++ ++++ ++++ + - - B subtilis ++++ ++++ ++++ +++ + - S pyogenes ++++ ++++ ++++ +++ + - S typhimurium ++++ ++++ ++++ + + - S flexerneri ++++ ++++ ++++ +++ + - Gram - ++++: ức chế 75 – 100 %, +++: ức chế 50 – 75 %, ++: ức chế 25 – 50 %, +: ức chế < 25 %, -: khơng khả ức chế Gram +: Gram dương, Gram - : Gram âm Qua Bảng 4.4, ghi nhận cao thô Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Ở nồng độ 50 mg/ml đến nồng độ 12,5 mg/ml cao thô Diệp hạ châu đắng ức chế 100 % phát triển chủng vi khuẩn, nồng độ thấp hơn, khả ức chế cao thô giảm dần đến nồng độ 3,125 mg/ml khả ức chế cao thô < 25 % chủng vi khuẩn Riêng S aureus ATCC nồng độ 3,125 mg/ml cao thơ khơng khả ức chế, khả ức chế cao thô S aureus ATCC yếu so với chủng vi khuẩn lại Kết ghi nhận cao thơ Diệp hạ châu đắng có tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Điều phù hợp với kết nghiên cứu Flora Folasade (2008); Đỗ Huy Bích ctv (2004); ETTA ctv (2011) cao thơ Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram dương: S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC Gram âm S typhimurium ATCC, S.flexerneri ATCC Việc phát hoạt tính kháng khuẩn Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn phù hợp với kinh nghiệm dân gian: dùng Diệp hạ châu đắng để trị mụn nhọt, lở loét, trị rối loạn đường ruột, tiêu chảy cho thấy triển vọng việc phòng trị dược liệu tự nhiên 31 4.3.2 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao thô Diệp hạ châu đắng Sau xác định tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng, để xác định xác ức chế vi khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng, thí nghiệm xác định MIC tiến hành kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao thơ Diệp hạ châu đắng trình bày qua Bảng 4.5 Bảng 4.5 Giá trị MIC, MBC cao thô Diệp hạ châu đắng môi trường BHI Vi khuẩn MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) Gram + Gram - S aureus >3,125 12,500 B subtilis 3,125 12,500 S pyogenes 3,125 12,500 S typhimurium 3,125 12,500 S flexerneri 3,125 12,500 Gram +: Gram dương, Gram -: Gram âm Hình 4.3 B subtilis MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MHA (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/ml Hình 4.4 S typhimurium ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MHA (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/m 32 Hình 4.5 S aureus ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml BHI (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/ml Hình 4.6 S pyogenes MBC 12,5 mg/ml NA Khuẩn lạc S pyogenes Hình 4.7 Đối chứng + (bên trái) đối chứng - (bên phải) B subtilis MHA 33 Qua Bảng 4.5, thấy cao thơ Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Kết phù hợp với kết thí nghiệm thử tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng Bên cạnh đó, thấy cao thơ Diệp hạ châu đắng ức chế mạnh S aureus ATCC MIC >3,125 mg/ml, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MIC 3,125 mg/ml, MBC 12,5 mg/ml S aureus ATCC cao thô Diệp hạ châu đắng nghiên cứu cao so với kết nghiên cứu Adegoke ctv (2010): MIC 50 mg/ml, MBC 100 mg/ml Qua cho thấy cao thơ Diệp hạ châu đắng điều chế với dung môi methanol phương pháp chiết lạnh có khả ức chế S aureus ATCC mạnh so với dịch chiết điều chế ethanol nghiên cứu Adegoke ctv (2010) Như thấy phương pháp chiết, dung mơi chiết xuất có ảnh hưởng lớn đến khả kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng S aureus có khả đề kháng nhiều kháng sinh: penicillin (Frank Henry, 2009), tetracyline, trimethoprin + sulfamethazin, chloramphenicol, erythomycin, methicillin, ampicillin, co – trimoxaol, erythromycin, lincomycin với tỉ lệ cao (Nguyễn Bữu Châu, 2007) việc điều trị Diệp hạ châu đắng giúp hạn chế sử dụng kháng sinh, tránh tượng kháng kháng sinh, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người môi trường xung quanh 34 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Một số kết luận rút từ kết nghiên cứu khảo sát tính kháng khuẩn cao thơ Diệp hạ châu đắng số vi khuẩn Gram âm Gram dương: - Chiết xuất Diệp hạ châu đắng với cồn methanol phương pháp chiết lạnh thu cao thơ Diệp hạ châu đắng có hiệu suất (3,70 %; 6, 21 %) ẩm độ (13,01 %; 17, 36 %) phù hợp theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam (ẩm độ cao thô không 20 %) - Sử dụng HPLC xác định hàm lượng Phyllanthin (0,308 %; 0,446 %) Hypophyllanthin (0,049 %; 0,136 %) cao thô Diệp hạ châu đắng - Cao thô Diệp hạ châu đắng có khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn khảo sát Cao thô ức chế S aureus ATCC MIC >3,125 mg/ml, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml 5.2 Kiến nghị Thực bào chế cao Diệp hạ châu đắng nhiều loại dung môi khác để chọn dung môi chiết suất cho hiệu suất cao Tiến hành xây dựng đường chuẩn dựa dạng cao điều chế từ Diệp hạ châu đắng: cao đặc, cao lỏng, cao khơ để hồn thiện quy trình xác định hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao điều chế 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cao Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Phương Mai Nguyễn Thị Hương 2002 Dược Điển Việt Nam III Nhà xuất Y học - Hội Đồng Dược Điển, 336, phụ lục 9, 10, 142 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong ctv 2004 Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam, Tập II Nhà xuất Khoa Học Và Kỹ Thuật Đỗ Tất Lợi 2004 Cây thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Huỳnh Kim Diệu 2008 Sử dụng Xuân Hoa (Pseuderanthemun palatiferum) để phòng trị tiêu chảy heo theo mẹ sau cai sữa Luận án tiến sĩ Nông Nghiệp, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Lê Xuân Phương 2001 Vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Xây dựng Hà Nội Ngơ Thế Hùng 1985 Độc tính dược phẩm Nhà xuất Y Học, thành phố Hồ Chí Minh Ngơ Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn 2009 Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng chúng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 101 – 106 Nguyễn Bữu Châu 2007 Kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp Staphylococcus aureus phương pháp MIC Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Kim Loan 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp 11 Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Quang Trung, Phạm Ngọc Thành Trần Thi Huệ 2002 Tạp chí Hóa học, 11 – 16 12 Nguyễn Thị Chính Trương Thị Hòa 2005 Vi sinh vật y học Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội, 53 – 69; 123 – 128 13 Phạm Ngọc Bùng Nguyễn Thị Nga 2004 Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc Nhà xuất y học Hà Nội, 213 – 215; 230 – 234 14 Phùng Quốc Chương 2002 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với số thuốc kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật ni Đắc Lắc Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 15 – 18 15 Trần Thị Ánh Nguyệt 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis Tuyển tập Báo cáo hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng 36 16 Trần Thị Nhã Thi 2011 Đánh giá hiệu điều trị viêm gan, vàng da chó cao đặc chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) Luận văn Cao học, Trường Đại học Nông Lâm 17 Trường đại học Dược Hà Nội 1993 Tài liệu thực tập vi sinh kháng sinh, – 9; 22 – 24 18 Từ Tích Tổ, 2008 Chẩn đốn phòng trị viêm gan, xơ gan ung thư gan Nhà xuất Tổng Hợp Thành phố Hồ Chí Minh, 54 – 131 19 Võ Thị Hoàng Mi 2005 Các phương pháp chuẩn đốn thương hàn thơng dụng Khoa Cơng nghệ sinh học – Đại học Mở Bán công TP.HCM Tài liệu tiếng Anh 20 Adegoke AA., PA Iberi, DA Akinpelu, OA Aiyegoro, CI Mboto Studies on phytochemical screening and antimicrobial potentials of Phyllanthus amarus against multiple antibiotic resistant bacteria International Journal of Applied Research in Natural Products, 3: – 12 21 Attur – ur – Rahman, Chouldhany M Iqbal, J Thomson William 2005 Bioassay Techniques For Drug Development The Taylor and Francis – e – Library, 14 – 16 22 Bala Neeraj, A B Aitken Elizabeth, Cusack Andrew and J Steadman Kathryn 2011 Evalution of antibacterial activity of Australian basidiomycetous macrofungi using high – throughput 96 well plate assay Pharmaceutical Biology, 49: – 23 C Chitravadivu, S Manian and K Kalaichelvi 2009 Antimicrobial studies on selected medicinal plants, Erode Region, Tamilnadu, India In Middle-East Journal of Scientific Research, Department of Biotechnology, K.S.Ranagasamy College of Technology, Tiruchengode - 637 215, Tamilnadu, India, pp 147 – 152 24 C Smith Tara 2010 Streptococcus group A Second edition, – 17 25 C Thongson, M P Davidson, W Maharnchanakul and J Weiss 2004 Antibactetrial activity of ultrasound assisted solvent extracted spices Letters in applied microbiology, 39: 401 - 406 26 C.O Gordian and O.A Godswill 2007 Chemicals detected in plants used for Folk Medicine in South Eastern Nigeria In Department of Plant Science and Biotechnology, University of Port Harcourt, Choba, Port Harcourt Nigeria, pp 67 – 72 27 Cimolai Nevial 2009 Streptococcus pyogenes is alive and well BCMJ, 51: 122 – 127 28 D C Mohana, S Satish and K A Raveesha 2008 Antibacterial evaluation of some plant extracts against some Human pathogenic bacteria In Advances in Biological Research, Medical Microbiology Laboratory; Department of Microbiology and Biotechnology, Bangalore University, Jnana Bharathi Campus, Bangalore - 560 056, India; Department of Studies in Microbiology; Department of Studies in Botany, University of Mysore, Manasagangotri, Mysore - 570 006, India, pp 49 – 55 37 29 De Britto A John, Sheeba Gracelin D Steena Herin, Roshan Sebastian 2011 Antibacterial activity of a few medicinal plants against Xanthomonas campestris and Aeromonas hydrophila Journal of Biopesticides, 4: 57 – 60 30 ETTA, Edim Hannah, ELOMA, Nnanke, OKON, Archibong Essien and OFFOR, Ubana 2011 Investigating the effect of a local Herb – P Amarus (Schum and Thonn.) on entero – pathogenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli International Journal of Tropical Medicine and Public Health, 1: 01 – 05 31 Fullá Oelia, Prado Valeria, Durán Claudia, Lagos Rpsanna and M L Myron 2005 Surveillance for antimicrobial resistance profiles among Shigella Species isolated from a semirural community in Northern Adiministrative area of Santiago, Chile Am J Trop Med Hyg., 72: 851 – 854 32 H Havickova F Sisak, H Hradecka, I Rychlik, I Kolackova, R Appiskova 2006 Antibiotic resistance of Salmonella spp isolates from pigs in the Czech Republic Veterinarni Medicina, 303 – 310 33 K Tripatthi Arvind, K Verma Ram, K Gupta Anik, M Gupta Madan and P S Khanuja Suman 2006 Quantitative Determination of Phyllanthin and Hypophy – llanthin in Phyllanthus Species by High-performance Thin Layer Chromatography Phytochem Anal 17: 394 – 397 34 Khan Salim, Al-Qurainy Fahad, Ram Mauji, Ahmad Sayeed and Zainul Abdin Malik 2010 Phyllanthin biosynthesis in Phyllanthus amarus: Schum and Thonn growing at different altitudes In Journal of Medicinal Plants Research, Department of Botany and Microbiology, College of Science, King Saud University, Riyadh, 11451, Kingdom of Saudi Arabia; Centre for Transgenic Plant Development, Department of Biotechnology Faculty of Science, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi, 110062, India; Department of Pharmacognosy and Phytochemistry, Faculty of Pharmacy, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi, 110062, India, pp 041 – 048 35 M Uyub Abdul, N Nwachukwu Ikenna, A Azlan Ahmad and S Fariza Shaida 2010 In-vitro antibacterial activity and cytotoxicity of selected medicinal plant extracts from Penang Island Malaysia on metronidazole resistant Helicobacter pylori and some pathogenic bacteria Ethnobotany Research & Applications, 8: 095 – 106 36 MA Ansari, HM Khan, AA Khan, A Malik, A Sultan, M Shahid, F Shujatullah, A Azam 2011 Evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles against MSSA and MRSA on isolates from skin infections Biology and Medicine, 3: 141 – 146 37 Mathur Rashmi 2011 Phytochemical and antimicrobial effect of Phyllanthus niruri on Human pathogenic In International Journal of Drug Discovery and Herbal research (IJDDHR), Dept of Botany, Microbiology lab Govt College, Ajmer (Rajasthan), pp 234 – 238 38 O J Eghafona, N O Akinjogunla, I O Enabulele, C I Mboto, and F O Ogbemudia 2010 Antibacterial activity of ethanolic extracts of Phyllanthus amarus against extended spectrum – lactamase producing Escherichia coli isolated 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 from stool samples of HIV sero-positive patients with or without diarrhoea African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 4: 402 – 407 Olempska-Beer Zofia 2004 Xylanases from Bacillus subtilis expressed in B subtilis Chemical and Technical Assessment, – Oluwafemi Flora and Debiri Folasade 2008 Antimicrobial effect of Phyllanthus amarus and parquetina nigrescens on Salmonella typhi In African Journal of Biomedical Research, Department of Microbiology, University of Agriculture, P.M.B 2240, Abeokuta Ogun State, Nigeria, pp 215 – 219 Padilha da Silva Wladimir, Teresa Destro Maria, Landgraf Mariza, Franco D G M Bernadette 2000 Biochemical characteristics of typical and a typical Staphylococcus aureus in mastitic milk and environmental samples of Brazilian dairy farms Brazilian Journal of Microbiology, 31: 103 – 106 R DeLeo Frank and F Chambers Henry 2009 Reemergence of antibiotic – resistant Staphylococcus aureus in the genomics era The Journal of Clinica Investiga – tion, 119: 2464 – 2474 S Hemalatha and S Shanthi 2010 In vitro characterization of bacteriocin producing Bacillus subtilis from milk samples In African Journal of Microbiology Research, Department of Biotechnology, Vels University, Pallavaram, Chennai 600 117, Tamil Nadu, India, pp 2004 – 2010 Srivastava Vandana, Singh Manju, Malasoni Richa, Shanker Karuna, K Verma Ram, M Gupta Madan, K Gupta Anil, P S Khanuja Suman 2008 Separation and quantification of lignans in Phyllanthus species by a simple chiral densitometricmethod J Sep Sci., 31: 47 – 55 Xiaoxi Chen 2011 Determination of the minimum inhibitory concentrations (MICs) and the minimum bactericidal concentrations (MBCs) for a novel antibiotic African Journal of Microbiology Research, 5: 572 – 575 Y Sultanbawa, A Cusack, M Currie, C Davis 2009 An innovative micropate assay to facilitate the detectio of antimicrobial activity in plant extract J Rapid Meth Auto Microbiol, 17: 519 – 534 Tài lệu internet Andrews, J.M Determination of Minimum Inhibitory Concentrations 2006 http://www.bsac.org.uk/_db/_documents/Chapter_2_Determination_of_MICs_200 29/11/2011 Hồng Hiệp Phòng bệnh gan Diệp hạ châu đắng 2011 http://vnexpress.net/gl/doi-song/2011/04/ 25/11/2011 Nguyễn Thị Nguyệt, Phẩm Minh Thu, Phan Thu Dòng, Trương Thị Xn Liên Tìm hiểu tình hình nhiễm khuẩn kháng kháng sinh thịt gà số điểm giết mổ TP Hồ Chí Minh 2006 http://www.pasteurhcm.org.vn/ng_cuu/HNKH_2006 16/12/2012 50 Phạm Thị Thu Thủy Các bệnh nhiễm trùng liên quan đến gan 2005 http://www.drthuthuy.com/Faq/NhiemTrungLQGan.html 02/12/2012 51 http://www.chem.agilent.com/enUS/Search/Pages/SearchResults.aspx?k=1200+HP LC&a=scope%3a%22English+(U.S.)+Content%22 31/07/2012 39 PHỤ LỤC Hình 1: Phiếu kết kiểm nghiệm lần 40 41 Hình 2: Phiếu kết kiểm nghiệm lần 42 43 ... Viết Tựu, 1985) Ngoài ra, cồn methanol rẻ cồn ethanol, nhiệt độ sôi cồn methanol (65 oC) thấp cồn ethanol (78 oC) nên dịch chiết cồn methanol cô quay bay nhanh cồn ethanol thu cao thơ tồn phần chứa... were 13,01 %; 17,36 %, respectively Phyllanthin and Hypophyllanthin substance of the two extracts were Phyllanthin: 0,308 % and 0,446 %; Hypophyllanthin: 0,049 % and 0,136 % P amarus extracts... thô Diệp hạ châu đắng 25 Hình 4.1 Sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết 28 Hình 4.2 Sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết 29 Hình 4.3 B subtilis ATCC MIC 3,125