Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên men bởi lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô hướng dẫn, PGS TS Nguyễn Thúy Hương, Cô gọi mở ý tưởng để định hướng xây dựng đề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực hiện, Cô tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần, giúp tơi vượt qua trở ngại để hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa truyền dạy kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lọi cho tơi suốt q trình học tập thực luận văn trường Tôi xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè chia sẻ tài liệu lĩnh vực liên quan, đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình động viên tạo điều kiện cho thời gian tập trung vào luận văn Mặc dù có nhiều cố gắng góp ý, giúp đỡ Thầy Cơ, nhiên vói kiến thức hạn chế nên luận văn chắn không tránh khỏi thiếu sót Kính mong tiếp tục nhận góp ý, nhận xét Q Thầy Cơ người có quan tâm để luận văn hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Lương Ngọc Anh TÓM TẮT LN VĂN • Sự rối loạn chuyển hóa cân oxy hóa nguyên nhân nhiều bệnh lý thể Lactobacillus acidophilus giúp giảm stress oxy hóa thiết lập cân hệ sinh thái YÌ sinh đường ruột Trong nghiên cứu này, Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 sống sót mơi trường pH 3, muối mật 0.3%, kháng khuẩn, khử cholesterol sinh acid lactic Sinh khối hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus BK4 de Man - Rogosa - Sharpe (MRS) sucrose 6% đại diện phương trinh hồi quy theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm Điều kiện lên men tối ưu xác định theo phương pháp Box - Wilson gồm pH 5.1, nhiệt độ 36.6°c 40 Sinh khối đạt 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (tăng 6.4%), tổng lực khử đạt 0.55 ± 0.04 (tăng 37.8%) khả khử 53.63% 1,1 - diphenyl - - picrylhydrazyl (DPPH) (tăng 12.02%) Sau tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10°c, sản phẩm sữa chua lên men Lactobacillus acidophilus BK4 đạt tiêu chuẩn probiotic có hoạt tính kháng oxy hóa cao Từ khóa: Kháng oxy hóa, Lactobacillus acidophilus, Stress oxy hóa ABSTRACT Lactobacillus acidophilus reduces oxidative stress in the body and restore intestinal microflora balance Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 and BK4 were able to survive in pH 3, 0.3% bile salt, resistant to bacterial, reduce cholesterol and produce lactic acid In this study, we conducted fermentation experiment using Lactobacillus acidophilus BK4 in MRS The glucose content in this medium is replaced by 6% sucrose solution, optimal fermentation conditions were determined by experimental planning method and Box - Wilson method including pH 5.1, temperature at 36.6°c and reaction time in 40 hours At this fermentation conditions, the biomass obtained was 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (6.4% increase) Lactobacillus acidophilus BK4 showed that reducing power was 0.55 ± 0.04 (37.8% increase) and DPPH radical scavenging activities was 53.63% (12.02% increase) Antioxidant of fermented milk by Lactobacilus acidophilus was improved and maintained for weeks at 10°c Key words: Antioxidant activity, Lactobacillus acidophilus, Stress oxidative LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thực hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thúy Hương Các số liệu, kết luận văn trình bày trung thực khách quan Luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu khoa học đăng tải tạp chí, hội nghị đề cập phần tài liệu tham khảo Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2018 Học viên thực Lương Ngọc Anh MUC • LUC • TĨM TẮT LUẬN VĂN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC BẢNG y DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU Chương TÔNG QUAN 1.1 Quá trình lên men sản phẩm sữa chua 1.2 Giống Lactobacillus Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus 1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.3 Q trình oxy hóa q trình kháng oxy hóa th ể 13 1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 21 2.1 Địa điểm thòi gian thực 21 2.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.3 Vật liệu hóa ch ất 21 2.3.1 Dụng cụ thiết b ị 21 2.3.2 Hóa chất 22 2.3.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Khảo sát đặc tính Lactobacillus acidophilus 25 2.4.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 30 2.4.3 Lên men sữa chua chủng sàng lọc đánh giá ổn định chất lượng sản phẩm sữa chua giàu hoạt tính kháng oxy hóa .33 2.5 Phương pháp phân tích thu nhận kết q u ả 35 111 2.5.1 Phương pháp phân tích YĨ sinh 35 2.5.2 Phương pháp phân tích hóa sinh 36 2.5.3 Phương pháp thăm dò cảm quan 36 2.5.4 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 36 2.5.5 Phương pháp xử lý số liệu 36 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Khảo sát đặc tính Lactobacillus acidophilus 37 3.1.1 Đặc điểm sinh học Lactobacillus acidophilus 37 3.1.2 Hoạt tính probiotic Lactobacillus acidophilus 39 3.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 47 3.2.1 Sàng lọc yếu tố 48 3.2.2 Tối ưu hóa hai hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn hoạt tính kháng oxy hóa 50 3.3 Lên men sữa chua chủng vỉ khuẩn sàng lọc đánh giá ổn định chất lượng sản phẩm sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa .55 3.3.1 Đánh tiêu chất lượng sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56 3.3.2 Đánh giá khả bảo toàn hoạt tính probiotic Lactobacillus acidophilus sản phẩm sữa chua tuần bảo quản 57 3.3.3 Đánh giá khả bảo tồn hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus sản phẩm sữa chua tuần bảo quản 58 3.3.4 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm với số sản phẩm sữa chua probiotic thị trường Việt Nam .58 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO V PHỤ LỤC xi IV DANH MUC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Khả khử cholesterol Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 sau 150 phút nuôi cấy 43 Bảng 3.2 Khả kháng khuẩn Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 với vi khuẩn thị 44 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus BK4 mơi trường MRS có nồng độ sucrose 6%, 8% 10% 49 Bảng 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Yi .50 Bảng 3.5 Bước chuyển động Si yếu tố hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Yi.,52 Bảng 3.6 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y ị 52 Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 53 Bảng 3.8 Bước chuyển động Si yếu tố hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 54 Bảng 3.9 Thí nghiệm theo hướng leo dốc hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 55 Bảng 3.10 Các tiêu chất lượng sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56 Bảng 3.11 Mật độ vi khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn khả khử cholesterol sản phẩm sữa chua tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10°c 57 Bảng 3.12 Hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm sữa chua tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10°c 58 Bảng 3.13 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 hai sản phẩm sữa chua probiotic thương mại 59 V DANH MUC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mối liên hệ stress oxy hóa bệnh tật 15 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 24 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình lên men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa 33 Hình 3.1 Hĩnh thái đại thể (A), vi thể (B) Lactobacillus acidophilus BK1 37 Hình 3.2 Hình thái đại thể (A), vi thể (B) Lactobacillus acidophilus BK4 37 Hình 3.3 Vòng kháng khuẩn Lactobacillus acidophilus BK4 với Escherichia coli ATCC 8739 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) 44 Hình 3.4 Sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 56 VI DANH MUC CÁC ĐỒ THI • • Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 môi trường MRS theo thời gian .39 Đồ thị 3.2 Khả chịu pH thấp Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 mơi trường SGJ theo thòi gian 40 Đồ thị 3.3 Khả chịu muối mật Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 môi trường SIF theo thòi gian 42 Đồ thị 3.4 Khả sinh acid lactic Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 môi trường MRS theo thời gian .45 Đồ thị 3.5 Hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 môi trường MRS theo phưong pháp tổng lực khử (A) phương pháp khử DPPH (B) 46 Đồ thị 3.6 Đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus BK4 mơi trường MRS có nồng độ sucrose 6%, 8% 10% 48 vu DANH MUC CÁC KÍ HIẼU VÀ CHỮ VIẾT TẮT • • CFU Colony Forming Unit EPS Exopolysaccharide FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations GRAS Generally Recognized As Safe DPPH 1,1 - diphenyl - - picrylhydrazyl LAB Lactic Acid Bacteria MRS de Man - Rogosa - Sharpe MT Môi trường OD Optical Density SGJ Simulated Gastric Juice SIF Simulated Intestinal Fluid RNS Reaxtive Nitrogen Species ROS Reactive Oxygen Species TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam V lll MỞ ĐÀU Sữa nguồn thực phẩm quý giá cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sức khỏe người Ngày 01/06/2001, Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) khởi xướng ngày Sữa giới nhằm khuyến khích tiêu thụ sữa ngày phần chế độ ăn uống lành mạnh Trong trình sử dụng, người đa dạng hóa nhiều sản phẩm từ sữa phơ mai, bơ, kem, sữa lên men, nâng cấp chúng từ sản phẩm truyền thống trở thành sản phẩm đại sản xuất theo dây chuyền công nghiệp Trong đó, sữa chua sản phẩm q trình lên men lactic vi khuẩn lactic vói mục đích ban đầu tăng cường hương vị kéo dài thòi gian bảo quản sữa [1] Các vi khuẩn lactic thông qua trình lên men nâng cao chất lượng số lượng protein, chất béo, vitamin, khoáng chất sữa, giúp tăng cường hệ thống miễn dịch, hỗ trợ hệ xương, giúp hệ tiêu hóa hấp thu dưỡng chất tốt [2] Đặc biệt, vi khuẩn lactic công nhận probiotic, bổ sung vào thể cải thiện toàn diện sức khỏe người Các probiotic củng cố thành ruột, cân hệ vi khuẩn đường ruột, giảm rối loạn liên quan đến đường tiêu hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa bệnh dị ứng, nhiễm khuẩn, làm chậm trình phát triển ung thư hỗ trợ sức khỏe tim mạch [1] Lactobacillus acidophilus vi khuẩn lactic thương mại hóa chế biến thực phẩm Các chủng Lactobacillus acidophilus đưa vào sản phẩm sữa Mỹ Đức vào năm cuối thập niên 1960 nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm [3] Ngoài hoạt tính điển hình probiotic, Lactobacillus acidophilus có khả sinh enzyme lactase, giúp giảm triệu chứng không dung nạp lactose sữa động vật khả khử cholesterol máu [4] Ngày nay, môi trường sống người trở nên ô nhiễm tác động trực tiếp hóa chất, khói thuốc, xạ, hay gián tiếp thông qua thực phẩm, chí dùng số dược phẩm chữa bệnh trở thành tác nhân gây stress oxy hóa cho thể Trạng thái stress oxy hóa làm thối hóa tế bào, gây ung thư gây bệnh lý thể viêm nhiễm quan, bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, thối hóa mắt, biểu sớm tượng lão hóa da 3.3.2 Đánh giá khà băo lồn hoạt tính probiotic Lactobacillus acidophilus sàn phắni sũa chua tuần bão quan Đối với sổn phàm sửa chua, mật độ vi khuẩn iMCtơbaàUus acidophilus BK4 đạt 11.67 ± 0.08 log (CFU/ml) (báng 3.10), đạt tiêu chuần probiotic sừa lcn men cua HAO (mật độ vi khuẩn 10* CHU/ml ) [25) Lactobacillus acidophilus BK4 sản phàm van có kha nâng khántỉ lại hai chủng vi khuân chi thị Escherichia cult ATCC 8739 Bacillus cereus ATCC 11778, thê luện qua dường kính vòng kháng khuân rộng 8.33 ± 0.58 Dim 7.33 ± 0.58 IIII1) Một chi tiêu quan trọng khác cua Lactobacillus acidophilus BK4 kha khư cholesterol Tương tự hoạt tính kháng khuân, khư cholesterol ốn định, đạt 36.92% Mặc khác, giai doạn tuần bao quan nhiệt độ 10°c dưỡng kính vòng kháng khn kha khư cholesterol cùa vi khuân tri (p>0.05) Mật độ vi khuân sau lên men 11.67 ± 0.08 log (cru/ml) tuần thứ 11.62 ± 0.04 log (CFU/ml), khơng có khác biệt (p>0.05) (bang 3.11) Mật dộ vi khuân san phàm van tri ơn định trẽn 10s CFU/ml Bang 11 Mật độ vi khuân, hoạt tính kháng khuân kha khư cholesterol săn phàm sừa chua tuần theo dõi bao quan Ư nhiệt độ I0°c D n g kính vòng kháng khn D - (1 T ỹ lệ giâm gian ( m n i ) _ cholesterol (tu ần) Bacillus cereus Escherichia coli ATCC (%) r Thòi ATGC 11778 7.33 ± 0.58' 7.67 ± 0.58“ 7.33 ± 0.58' 7.33 ± 0.58' 7.33 ± 0.58' 7.33 ± 0.58' 7.0 ± 0' 7.0 ± “ 7.0 ± “ 8739 8.33 ± 0.58“ 8.33 ±0.58“ 8.33 ± 0.58“ 7.67 ± 0.58“ 7.67 ±0.58“ 7.33 ± 0.58“ 7.33 ± 0.58“ 7.33 ± 0.58“ 7.33 ± 0.58“ 36.92 36.88 36.83 36.8 36.81 36.7 36.74 3669 36.62 Mật độ vi khuân (log (CFU/ml)) 11.67 ±0.08“ II.66 ±0.07“ 11.63 ±0.04“ 11.64 ± 0.03“ 11.66 ±0.05“ 11.65 ± 0.02“ "l 1.65 ±0.07“ 11.63 ±0.05“ 11.62 ±0.04“ Két quà lính theo giá (rị trung binh ± dộ lệch chuẩn (n=3) ‘‘là giá trị trung bình cột, sai khúc kỷ tự có ỷ nghĩa thông kê (p