Nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua lên men bởi lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LƯƠNG NGỌC ANH NÂNG CAO CHẤT LƢỢNG SẢN PHẨM SỮA CHUA LÊN MEN BỞI Lactobacillus acidophilus GIÀU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2018 Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG – HCM Cán hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: PGS TS Phan Ngọc Hòa (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 21 tháng 07 năm 2018 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) PGS TS Lê Thị Thủy Tiên PGS TS Nguyễn Tiến Thắng PGS TS Phan Ngọc Hịa TS Võ Đình Lệ Tâm TS Hoàng Anh Hoàng Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: LƢƠNG NGỌC ANH MSHV: 1570250 Ngày tháng năm sinh: 01/04/1992 Nơi sinh: Bình Thuận Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Nâng cao chất lƣợng sản phẩm sữa chua lên men Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa II NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Luận văn đƣợc thực với mục đích sau: - Nghiên cứu khả kháng oxy hóa dịng vi khuẩn probiotic, cụ thể chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus - Thăm dò ứng dụng, tạo dòng sản phẩm sữa chua có thêm hoạt tính sinh học khả kháng oxy hóa III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/2018 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2018 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cơ hƣớng dẫn, PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng, Cô gợi mở ý tƣởng để định hƣớng xây dựng đề tài nghiên cứu Trong suốt thời gian thực hiện, Cơ tận tình hƣớng dẫn, động viên tinh thần, giúp tơi vƣợt qua trở ngại để hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cơ Khoa Kỹ thuật Hóa học, trƣờng Đại học Bách Khoa truyền dạy kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực luận văn trƣờng Tôi xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè chia sẻ tài liệu lĩnh vực liên quan, nhƣ đóng góp ý kiến để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Xin cảm ơn gia đình động viên tạo điều kiện cho thời gian tập trung vào luận văn Mặc dù có nhiều cố gắng góp ý, giúp đỡ Thầy Cơ, nhiên với kiến thức hạn chế nên luận văn chắn khơng tránh khỏi thiếu sót Kính mong tiếp tục nhận đƣợc góp ý, nhận xét Quý Thầy Cơ ngƣời có quan tâm để luận văn đƣợc hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Lƣơng Ngọc Anh TÓM TẮT LUẬN VĂN Sự rối loạn chuyển hóa cân oxy hóa nguyên nhân nhiều bệnh lý thể Lactobacillus acidophilus giúp giảm stress oxy hóa thiết lập cân hệ sinh thái vi sinh đƣờng ruột Trong nghiên cứu này, Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 sống sót môi trƣờng pH 3, muối mật 0.3%, kháng khuẩn, khử cholesterol sinh acid lactic Sinh khối hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus BK4 de Man - Rogosa - Sharpe (MRS) sucrose 6% đƣợc đại diện phƣơng trình hồi quy theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm Điều kiện lên men tối ƣu đƣợc xác định theo phƣơng pháp Box - Wilson gồm pH 5.1, nhiệt độ 36.6oC 40 Sinh khối đạt 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (tăng 6.4%), tổng lực khử đạt 0.55 ± 0.04 (tăng 37.8%) khả khử 53.63% 1,1 - diphenyl - - picrylhydrazyl (DPPH) (tăng 12.02%) Sau tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10oC, sản phẩm sữa chua lên men Lactobacillus acidophilus BK4 đạt tiêu chuẩn probiotic có hoạt tính kháng oxy hóa cao Từ khóa: Kháng oxy hóa, Lactobacillus acidophilus, Stress oxy hóa ABSTRACT Lactobacillus acidophilus reduces oxidative stress in the body and restore intestinal microflora balance Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 and BK4 were able to survive in pH 3, 0.3% bile salt, resistant to bacterial, reduce cholesterol and produce lactic acid In this study, we conducted fermentation experiment using Lactobacillus acidophilus BK4 in MRS The glucose content in this medium is replaced by 6% sucrose solution Optimal fermentation conditions were determined by experimental planning method and Box - Wilson method including pH 5.1, temperature at 36.6oC and reaction time in 40 hours At this fermentation conditions, the biomass obtained was 11.59 ± 0.09 log (CFU/ml) (6.4% increase) Lactobacillus acidophilus BK4 showed that reducing power was 0.55 ± 0.04 (37.8% increase) and DPPH radical scavenging activities was 53.63% (12.02% increase) Antioxidant of fermented milk by Lactobacilus acidophilus was improved and maintained for weeks at 10oC Key words: Antioxidant activity, Lactobacillus acidophilus, Stress oxidative i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi thực dƣới hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Thúy Hƣơng Các số liệu, kết luận văn đƣợc trình bày trung thực khách quan Luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu khoa học đƣợc đăng tải tạp chí, hội nghị đƣợc đề cập phần tài liệu tham khảo Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2018 Học viên thực Lƣơng Ngọc Anh ii MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN i LỜI CAM ĐOAN ii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .viii MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Quá trình lên men sản phẩm sữa chua 1.2 Giống Lactobacillus Lactobacillus acidophilus 1.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus 1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.3 Q trình oxy hóa q trình kháng oxy hóa thể .13 1.4 Hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus .16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Địa điểm thời gian thực 21 2.2 Đối tƣợng nghiên cứu .21 2.3 Vật liệu hóa chất 21 2.3.1 Dụng cụ thiết bị 21 2.3.2 Hóa chất 22 2.3.3 Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật .22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .24 2.4.1 Khảo sát đặc tính Lactobacillus acidophilus 25 2.4.2 Tối ƣu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 30 2.4.3 Lên men sữa chua chủng sàng lọc đánh giá ổn định chất lƣợng sản phẩm sữa chua giàu hoạt tính kháng oxy hóa 33 2.5 Phƣơng pháp phân tích thu nhận kết 35 iii 2.5.1 Phƣơng pháp phân tích vi sinh 35 2.5.2 Phƣơng pháp phân tích hóa sinh 36 2.5.3 Phƣơng pháp thăm dò cảm quan 36 2.5.4 Phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm 36 2.5.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 37 3.1 Khảo sát đặc tính Lactobacillus acidophilus 37 3.1.1 Đặc điểm sinh học Lactobacillus acidophilus 37 3.1.2 Hoạt tính probiotic Lactobacillus acidophilus .39 3.2 Tối ƣu hóa điều kiện lên men thu sinh khối Lactobacillus acidophilus giàu hoạt tính kháng oxy hóa 47 3.2.1 Sàng lọc yếu tố .48 3.2.2 Tối ƣu hóa hai hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn hoạt tính kháng oxy hóa ………………………………………………………………………… 50 3.3 Lên men sữa chua chủng vi khuẩn sàng lọc đánh giá ổn định chất lƣợng sản phẩm sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa 55 3.3.1 Đánh tiêu chất lƣợng sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56 3.3.2 Đánh giá khả bảo tồn hoạt tính probiotic Lactobacillus acidophilus sản phẩm sữa chua tuần bảo quản .57 3.3.3 Đánh giá khả bảo tồn hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus sản phẩm sữa chua tuần bảo quản .58 3.3.4 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm với số sản phẩm sữa chua probiotic thị trƣờng Việt Nam 58 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 4.1 Kết luận 60 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO v PHỤ LỤC xi iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Khả khử cholesterol Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 sau 150 phút nuôi cấy .43 Bảng 3.2 Khả kháng khuẩn Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 với vi khuẩn thị 44 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng oxy hóa Lactobacillus acidophilus BK4 mơi trƣờng MRS có nồng độ sucrose 6%, 8% 10% .49 Bảng 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y1 50 Bảng 3.5 Bƣớc chuyển động yếu tố hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y1 .52 Bảng 3.6 Thí nghiệm theo hƣớng leo dốc hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y1 .52 Bảng 3.7 Ma trận quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 53 Bảng 3.8 Bƣớc chuyển động yếu tố hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 54 Bảng 3.9 Thí nghiệm theo hƣớng leo dốc hàm mục tiêu hoạt tính kháng oxy hóa Y2 .55 Bảng 3.10 Các tiêu chất lƣợng sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus 56 Bảng 3.11 Mật độ vi khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn khả khử cholesterol sản phẩm sữa chua tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10oC 57 Bảng 3.12 Hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm sữa chua tuần theo dõi bảo quản nhiệt độ 10oC .58 Bảng 3.13 So sánh hoạt tính kháng oxy hóa sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 hai sản phẩm sữa chua probiotic thƣơng mại 59 v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Mối liên hệ stress oxy hóa bệnh tật 15 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .24 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình lên men sữa chua probiotic giàu hoạt tính kháng oxy hóa .33 Hình 3.1 Hình thái đại thể (A), vi thể (B) Lactobacillus acidophilus BK1 37 Hình 3.2 Hình thái đại thể (A), vi thể (B) Lactobacillus acidophilus BK4 37 Hình 3.3 Vòng kháng khuẩn Lactobacillus acidophilus BK4 với Escherichia coli ATCC 8739 (A) Bacillus cereus ATCC 11778 (B) 44 Hình 3.4 Sản phẩm sữa chua Lactobacillus acidophilus BK4 .56 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Deepak, Venkataraman, et al “Optimization of anticancer exopolysaccharide production from probiotic Lactobacillus acidophilus by response surface methodology.” Preparative Biochemistry and Biotechnology 46.3 (2016): 288297 [2] Okafor, Nduka “Fermented foods and their processing.” BiotechnologyVolume VIII: Fundamentals in Biotechnology (2009): 19 [3] Juneja, Vijay K., Ipek Goktepe, and Mohamed Ahmedna Probiotics in food safety and human health CRC Press, 2005 [4] Young Ju Kim, et al “Study on the bacteriocin produced by Lactobacillus GM 7311.” Department of Microbiology college of nature Science Pukyong National University (2001) [5] Trần Thị Ngọc Diệp Nguyễn Thúy Hƣơng “Tổng quan hoạt tính kháng oxi hóa Lactobacillus.” Tạp chí khoa học Trường đại học sư phạm Tp.HCM (2018) [6] Salvetti, Elisa, Sandra Torriani, and Giovanna E Felis “The genus Lactobacillus: a taxonomic update.” Probiotics and antimicrobial proteins 4.4 (2012): 217-226 [7] Tamime, A Y “Fermented milks: a historical food with modern applications– a review.” European Journal of Clinical Nutrition56.S4 (2003): S2 [8] Bergey, David Hendricks, et al Bergey's manual of determinative bacteriology Baltimore: Williams & Wilkins, 1934 [9] Ventura, Marco, et al “Insights into the taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria.” Antonie Van Leeuwenhoek 86.3 (2004): 205-223 [10] Schillinger, U., R Geisen, and W H Holzapfel “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods.” Trends in Food Science & Technology 7.5 (1996): 158-164 [11] Cole, C B., et al ”Effect of probiotic supplements of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium adolescentis 2004 on β – glueosidase and β – glueuronidase activity in the lower gut of rats associated with a human faecal flora.” Journal Microbial ecology in Health and Disease 2.3 (2009): 223-225 [12] Lopez, J “Probiotics in animal nutrition.” Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 13.Special iss (2000): 12-26 [13] Ghany, El, et al “Evaluation of antioxidant and antitumor activities of Lactobacillus acidophilus bacteria isolated from Egyptian infants.” International Journal of Pharmacology 10.5 (2014): 282-288 [14] Phelan, Martha, et al “Casein-derived bioactive peptides: biological effects, industrial uses, safety aspects and regulatory status.” International Dairy Journal 19.11 (2009): 643-654 [15] MacDonald, Ruth S., William H Thornton Jr, and Robert T Marshall “A cell culture model to identify biologically active peptides generated by bacterial hydrolysis of casein.” Journal of dairy science 77.5 (1994): 1167-1175 [16] Varga, László “Health-promoting fermented milks.” (2013): 358-359 [17] Jafarei, Parvaneh, and Maryam Tajabadi Ebrahimi “Lactobacillus acidophilus cell structure and application.” African journal of microbiology research 5.24 (2011): 4033-4042 [18] Koeppel, Katja Natalie, et al “The use of a probiotic in captive cheetahs (Acinonyx jubatus).” Journal of the South African Veterinary Association 77.3 (2006): 127-130 [19] Kos, B V Z E., et al “Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92.” Journal of applied microbiology 94.6 (2003): 981-987 [20] Hamilton-Miller, J M T “The role of probiotics in the treatment and prevention of Helicobacter pylori infection.” International journal of antimicrobial agents 22.4 (2003): 360-366 vi [21] Ouwehand, Arthur C “Antiallergic effects of probiotics.” The Journal of nutrition 137.3 (2007): 794S-797S [22] Siham Abdel-Azeem Ismail, et al “Cultural condition affecting the growth and production of β - galactosidase by Lactobacillus acidophilus NRRL 4495.” Australian Journal of Basic and Applied Sciences 4.10 (2010): 50515058 [23] Hong, Yi-Fan, et al “Lactobacillus acidophilus K301 Inhibits Atherogenesis via Induction of 24 (S), 25-Epoxycholesterol-Mediated ABCA1 and ABCG1 Production and Cholesterol Efflux in Macrophages.” PloS one 11.4 (2016): e0154302 [24] Lee, Yuan Kun, and Seppo Salminen Handbook of probiotics and prebiotics John Wiley & Sons, 2009 [25] Krishnakumar, V., and Gordon, I R., “Probiotics: Challenges and opportunities”, Dairy Industries International, 66.2 (2002): 38-40 [26] Gupta R K et al “Oxydative stress and antioxydants in disease and cancer: A review.” Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 15.11 (2014): 44054409 [27] Sah, B N P., et al “Identification of anticancer peptides from bovine milk proteins and their potential roles in management of cancer: a critical review.” Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 14.2 (2015): 123-138 [28] Hudson, Bertram J Food antioxidants Springer Science & Business Media, 2012 [29] Gan, Ren-You, et al “Antioxidant activity and total phenolic content of medicinal plants associated with prevention and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases.” Journal of Medicinal Plants Research 4.22 (2010): 2438-2444 vii [30] Marazza, José A., et al “Enhancement of the antioxidant capacity of soymilk by fermentation with Lactobacillus rhamnosus.” Journal of Functional Foods 4.3 (2012): 594-601 [31] Elfahri, K R., et al “Anti-colon cancer and antioxidant activities of bovine skim milk fermented by selected Lactobacillus helveticus strains.” Journal of dairy science 99.1 (2016): 31-40 [32] Amdekar, Sarika, et al “Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus regulate inflammatory pathway and improve antioxidant status in collageninduced arthritic rats.” Journal of Interferon & Cytokine Research 33.1 (2013): 1-8 [33] Wu, T Y., et al “Effect of antioxydant activity and aunctional properties of chingshey purple sweet acidophilus, Lactobacillus potato fermented delbrueckii subsp milk lactis, by Lactobacillus and Lactobacillus gasseri strains.” Journal Food Sciences, 77.1 (2012): M 2-8 [34] Zubaidah, Elok, Nawa Aldina, and Fithri Choirun Nisa “Study of antioxydant activity in rice bran and skim milk media fermented by probiotic (Lactobacillus plantarum B2 and Lactobacillus acidophillus)”, Jurnal Teknologi Pertanian 13.2 (2012): 111-118 [35] Zubaidah, Elok, Nawa Aldina, and Fithri Choirun Nisa “Study on Antioxidant Activity of Fermented Rice Bran and Skim Milk by Probiotic Lactic Acid Bacteria (Lactobacillus plantarum J2 and Lactobacillus casei).” Jurnal Teknologi Pertanian 11.1 (2012): 11-17 [36] Ejtahed, Hanie S., et al “Probiotic yogurt improves antioxidant status in type diabetic patients.” Nutrition 28.5 (2012): 539-543 [37] Mousavi, Zeinab E., et al “Effect of fermentation of pomegranate juice by Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus on the antioxidant activity and metabolism of sugars, organic compounds.” Food biotechnology 27.1 (2013): 1-13 viii acids and phenolic [38] Papademas, P., I Parmaxi, and M Aspri “Probiotic, antimicrobial, antioxidant and sensory properties of fermented donkey milk with Lactobacillus fermentum ME-3 and Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356).” BAOJ Microbiol 1.004 (2015) [39] Low, Ray Hu Pin, Ahmad Salihin Baba, and Fatemeh Aboulfazli “Effects of different levels of refined cane sugar and unrefined coconut palm sugar on the survivability of Lactobacillus acidophilus in probiotic ice cream and its sensory and antioxidant properties.” Food Science and Technology Research21.6 (2015): 857-862 [40] Hougaard, Anni B., et al “Free radical formation by Lactobacillus acidophilus NCFM is enhanced by antioxidants and decreased by catalase.” Food Research International 79 (2016): 81-87 [41] Liu, Qi, et al “Yield improvement of exopolysaccharides by screening of the Lactobacillus acidophilus ATCC and optimization of the fermentation and extraction conditions.” EXCLI journal 15 (2016): 119-133 [42] Nazari, Fermix, et al “Antioxidant Effect of Lactobacillus acidophilus as a probiotic at different time intervals.” Avicenna Journal of Clinical Microbiology and Infection 3.1 (2016) [43] Jianmin, Li, Cao Li, and Han Sihai “Effect of Lactobacillus acidophilus 1878 on slgA content in the intestinal mucous and antioxidant capacity of broiler chicks.” Animal Husbandry and Feed Science 9.4 (2017): 213-215 [44] Chen, Ronghao, et al “Comparative Evaluation of the Antioxidant Capacities, Organic Acids, and Volatiles of Papaya Juices Fermented by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus plantarum.” Journal of Food Quality 2018 (2018) [45] Padghan, P V., Bimlesh Mann, and Rajan Sharma “In-vivo studies of antioxidant activity of fermented milk (Lassi) by Lactobacillus acidophilus and standard dahi culture.” Journal Phytochemistry 7.2 (2018): 25-30 ix of Pharmacognosy and [46] Zhou, J., et al “Analysis of the microflora in Tibetan Kefir grains using denaturing gradient gel electrophoresis.” Food Microbiology 26 (2009): 770775 [47] Shokryazdan, Parisa, et al “Probiotic potential of Lactobacillus strains with antimicrobial activity against some human pathogenic strains.” BioMed research international 2014 (2014) [48] Liong, M T., and N P Shah “Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains.” Journal of dairy science 88.1 (2005): 55-66 [49] Chang, Lee-Wen, et al “Antioxidant activity of sesame coat.” Food chemistry 78.3 (2002): 347-354 [50] TCVN 7030:2002 Sữa chua – Quy định kỹ thuật Bộ Khoa học Công nghệ Môi trƣờng [51] Harry T L and Hildegarde H “Đánh giá cảm quan thực phẩm.” Nguyễn Hoàng Dũng, Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2007 [52] TCVN 5860 – 1994 Sữa trùng Bộ Khoa học Công nghệ Môi trƣờng [53] Bùi Minh Trí “Xác suất thống kê quy hoạch thực nghiệm.” Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, 2005 [54] Akolkar S K et al “Lactase production from Lactobacillus acidophilus.” World Journal of Microbiology and Biotechnology 21.7 (2005): 1119-1122 [55] Shobharani, P., and Prakash, M Halami “Cenllular fatty acid profile ad H+/ATPase activity to assess acid tolerance of Bacillus sp for prtential probiotic functional attributes.” Applied microbiology and biotechnology 98.21 (2014): 9045-9058 [56] Cotter, Paul D., and Colin Hill “Surviving the acid test: responses of grampositive bacteria to low pH.” Microbiology and Molecular Biology Reviews 67.3 (2003): 429-453 x PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đƣờng cong sinh trƣởng chủng Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3, BK4 [MT01] theo thời gian Thời điểm (Giờ) 10 10 10 10 Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ tế bào điểm tế bào điểm tế bào điểm tế bào điểm tế bào (log (Giờ) (log (Giờ) (log (Giờ) ((log (Giờ) (log CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) BK1 4.7 12 9.25 24 9.98 36 9.92 48 9.84 4.96 14 9.46 26 9.95 38 9.87 50 9.82 16 28 40 52 5.56 9.57 10.0 9.89 9.8 18 30 42 54 6.51 9.68 10.02 9.92 9.93 7.89 20 9.75 32 9.97 44 9.85 56 9.9 8.76 22 9.84 34 10.01 46 9.82 58 9.94 9.93 60 BK2 12 24 36 48 4.4 9.61 10.63 10.8 10.78 4.64 14 10.07 26 10.81 38 10.75 50 10.74 5.11 16 10.24 28 10.74 40 10.83 52 10.81 5.95 18 10.37 30 10.76 42 10.88 54 10.79 7.84 20 10.44 32 10.76 44 10.68 56 10.75 8.75 22 10.54 34 10.81 46 10.77 58 10.82 10.75 60 BK3 4.3 12 9.22 24 9.75 36 9.75 48 9.69 4.63 14 9.44 26 9.74 38 9.69 50 9.77 5.6 16 9.57 28 9.66 40 9.79 52 9.65 18 30 42 54 7.02 9.65 9.61 9.69 9.63 20 32 44 56 8.17 9.72 9.66 9,.62 9.75 8.95 22 9.86 34 9.68 46 9.72 58 9.64 9.62 60 BK4 5.22 8.26 10.89 10.97 10.92 12 24 36 48 5.45 9.87 10.85 10.98 10.85 14 26 38 50 6.23 10.14 10.92 10.84 10.88 16 28 40 52 7.64 10.38 10.87 10.91 10.89 18 30 42 54 7.96 10.65 10.82 10.94 10.83 20 32 44 56 7.99 10.79 10.93 10.9 10.76 22 34 46 58 10.8 60 xi Phụ lục 2: Khả chịu pH thấp chủng Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 [MT03] theo thời gian Chủng vi khuẩn BK1 BK2 BK3 BK4 Nghiệm thức pH 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 6.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 6.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 6.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 6.0 Mật độ tế bào (log (CFU/ml)) phút 30 phút 60 phút 90 phút 8.19 ± 0.04a 8.29 ± 0.07a 8.08 ± 0.09a 8.31 ± 0.15a 8.36 ± 0.13a 8.17 ± 0.03a 8.15 ± 0.09a 7.94 ± 0.02a 8.00 ± 0.02a 7.93 ± 0.05a 7.90 ± 0.02a 8.12 ± 0.03a 6.36 ± 0.09a 6.46 ± 0.04a 6.19 ± 0.05a 5.92 ± 0.02a 5.72 ± 0.02a 7.13 ± 0.07a 6.62 ± 0.06a 6.50 ± 0.02a 6.45 ± 0.04a 6.47 ± 0.02a 6.36 ± 0.05a 6.59 ± 0.08a 8.85 ± 0.04b 8.48 ± 0.17a 8.35 ± 0.14a 8.48 ± 0.15b 8.45 ± 0.09 8.81 ± 0.10b 8.27 ± 0.07a 8.39 ± 0.02b 8.16 ± 0.07b 8.14 ± 0.07 8.08 ± 0.02b 8.25 ± 0.07 6.35 ± 0.06a 6.47 ± 0.08a 6.26 ± 0.05 5.94 ± 0.04a 5.73 ± 0.05a 7.26 ± 0.06a 6.67 ± 0.09a 6.50 ± 0.02a 6.51 ± 0.06a 6.67 ± 0.03a 6.41 ± 0.07a 6.64 ± 0.04a 8.54 ± 0.17 8.59 ± 0.11a 9.01 ± 0.18b 9.03 ± 0.08b 8.48 ± 0.09 9.13 ± 0.04c 8.21 ± 0.12a 8.36 ± 0.09b 8.31 ± 0.07c 8.12 ± 0.11 8.22 ± 0.04c 8.37 ± 0.08b 6.48 ± 0.08a 6.44 ± 0.04a 6.26 ± 0.02 5.92 ± 0.03a 5.76 ± 0.01 7.48 ± 0.08b 6.70 ± 0.01a 6.65 ± 0.02b 6.65 ± 0.01b 6.73 ± 0.03a 6.62 ± 0.02a 7.07 ± 0.03b 8.40 ± 0.17aA 8.53 ± 0.19aA 9.11 ± 0.16bB 8.88 ± 0.09bB 8.79 ± 0.08bB 9.21 ± 0.08cB 8.24 ± 0.07aA 8.43 ± 0.08bA 8.41 ± 0.06cA 8.30 ± 0.02bA 8.38 ± 0.08dA 8.55 ± 0.09cB 6.54 ± 0.07aA 6.47 ± 0.04aA 6.32 ± 0.02bB 6.17 ± 0.04bB 5.81 ± 0.03bB 7.88 ± 0.07cB 6.71 ± 0.01aA 6.71 ± 0.03bB 7.57 ± 0.05cB 6.98 ± 0.04bB 6.96 ± 0.02bB 7.73 ± 0.07cB Phụ lục 3: Khả chịu muối mật chủng Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 [MT04] theo thời gian Chủng vi khuẩn BK1 BK2 BK3 BK4 Phần trăm muối mật (%) 0.3 0.3 0.3 0.3 Mật độ tế bào (log (CFU/ml)) giờ 6.28 ± 0.02a 6.35 ± 0.03a 5.53 ± 0.04a 5.55 ± 0.03a 5.74 ± 0.02a 5.75 ± 0.02a 6.16 ± 0.01a 6.17 ± 0.01a 6.77 ± 0.04b 6.67 ± 0.05b 5.61 ± 0.02b 5.6 ± 0.03a 5.79 ± 0.01a 5.74 ± 0.01a 6.2 ± 0.03a 6.22 ± 0.05a 6.96 ± 0.03cA 7.53 ± 0.05cB 5.7 ± 0.03cA 5.66 ± 0.04bA 5.89 ± 0.03bA 5.88 ± 0.02bA 6.26 ± 0.01bA 6.27 ± 0.02bA xii Khả sống sót (%) 100 100 100 100 Phụ lục 4: Thể tích NaOH 0.2N hàm lƣợng acid lactic ∑a (oT) tạo chủng Lactobacillus acidophilus BK1, BK2, BK3 BK4 theo thời gian Chủng vi khuẩn BK1 BK2 BK3 BK4 ĐC 24 (giờ) 4.58 ± 0.1a 4.22 ± 0.1a 4.75 ± 0.05a 8.27 ± 0.15a 2.95 ± 0.05a BK1 BK2 BK3 BK4 24 (giờ) 2.94 ± 0.1aA 2.28 ± 0.1aA 3.27 ± 0.05aA 9.57 ± 0.19aB VNaOH 0.2 (ml) 48 (giờ) 72 (giờ) a 4.70 ± 0.13 7.77 ± 0.15b 4.92 ± 0.13b 5.58 ± 0.16b 5.25 ± 0.13b 4.71 ± 0.1a 7.73 ± 0.15b 8.23 ± 0.15a 2.88 ± 0.08a 2.92 ± 0.08a ∑a (oT) 48 (giờ) 72 (giờ) aA 3.27 ± 0.1 8.73 ± 0.1bA 3.6 ± 0.1bA 4.8 ± 0.1bB 4.26 ± 0.1bB 3.24 ± 0.1aC 8.97 ± 0.36bC 9.57 ± 0.1aD 96 (giờ) 2.97 ± 0.06c 4.47 ± 0.15a 4.25 ± 0.05c 8.47 ± 0.15a 2.93 ± 0.08a 96 (giờ) 0.06 ± 0.1cA 2.76 ± 0.1aB 2.37 ± 0.1cB 9.96 ± 0.1aC Phụ lục 5: Hoạt tính kháng oxy hóa chủng Lactobacillus acidophilus Mẫu thí nghiệm Nội bào BK1 Ngoại bào Nội bào BK2 Ngoại bào Nội bào BK3 Ngoại bào Nội bào BK4 Ngoại bào ĐC + ĐC Mẫu thí nghiệm Nội bào BK1 Ngoại bào Nội bào BK2 Ngoại bào Nội bào BK3 Ngoại bào Nội bào BK4 Ngoại bào ĐC + ĐC - Tổng lực khử (OD700) 0.11 ± 0.02A 0.37 ± 0.03B 0.14 ± 0.01A 0.45 ± 0.03B 0.17 ± 0.01A 0.43 ± 0.01B 0.18 ± 0.01A 0.43 ± 0.02B 0.92 ± 0.02C 0.07 ± 0.01D Năng lực khử DPPH (OD517) 2.34 ± 0.02A 1.06 ± 0.2B 2.27 ± 0.2A 1.14 ± 0.05B 2.29 ± 0.15A 1.07 ± 0.08 B 2.28 ± 0.08A 1.13 ± 0.04B 0.19 ± 0.03C 2.35 ± 0.02A xiii Phần trăm kháng oxy hóa (%) 11.96 40.22 15.22 48.91 18.48 46.74 19.57 46.74 100 7.61 Hiệu suất khử DPPH (%) 0.43 54.59 3.4 51.49 2.55 54.47 2.98 51.92 91.92 Phụ lục 6: Đƣờng cong sinh trƣởng chủng Lactobacillus acidophilus BK4 [MT01] với sucrose 6%, 8% 10% theo thời gian Thời điểm (Giờ) 10 10 10 10 Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ Thời Mật độ tế bào điểm tế bào điểm tế bào điểm tế bào điểm tế bào (log (Giờ) (log (Giờ) (log (Giờ) (log (Giờ) (log CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) CFU/ml) [MT01] sucrose 6% 5.42 8.96 11.38 11.47 11.22 12 24 36 48 5.7 10.12 11.3 11.48 11.35 14 26 38 50 7.51 10.64 11.41 11.44 11.35 16 28 40 52 8.58 11.08 11.43 11.32 11.29 18 30 42 54 8.72 11.38 11.42 11.34 11.33 20 32 44 56 8.77 11.39 11.43 11.3 11.26 22 34 46 58 11.23 60 [MT01] sucrose 8% 5.45 8.84 10.96 9.91 9.24 12 24 36 48 5.52 9.98 11.02 9.89 9.19 14 26 38 50 7.02 10.35 10.92 9.57 9.25 16 28 40 52 8.01 10.66 10.84 9.44 9.28 18 30 42 54 8.22 10.9 10.43 9.32 9.28 20 32 44 56 8.28 10.98 10.28 9.29 9.3 22 34 46 58 9.32 60 [MT01] sucrose 10% 5.4 8.73 8.72 6.31 5.99 12 24 36 48 5.49 9.05 7.69 6.3 6.03 14 26 38 50 5.61 9.81 7.01 6.29 6.06 16 28 40 52 6.91 10.57 6.27 6.11 5.93 18 30 42 54 8.02 10.62 6.38 6.03 5.81 20 32 44 56 8.39 10.18 6.19 5.97 5.68 22 34 46 58 5.52 60 [MT01] 5.22 8.26 10.89 10.97 10.92 12 24 36 48 5.45 9.87 10.85 10.98 10.85 14 26 38 50 6.23 10.14 10.92 10.84 10.88 16 28 40 52 7.64 10.38 10.87 10.91 10.89 18 30 42 54 7.96 10.65 10.82 10.94 10.83 20 32 44 56 7.99 10.79 10.93 10.9 10.76 22 34 46 58 10.8 60 xiv Phụ lục 7: Tối ƣu hóa hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn Y1 hoạt tính kháng oxy hóa Y2 A Các mức thí nghiệm quy hoạch thực nghiệm hàm mục tiêu Y1 Y2 Các nhân tố Z1 (pH) Z2 (oC) Z3 (giờ) Các mức thí nghiệm Mức dƣới Mức sở Mức -1 4.5 5.5 6.5 o o 31 C 37 C 43oC 20 30 40 Khoảng biến thiên 1.0 6oC 10 B Các số liệu dùng kiểm định phƣơng trình hồi quy hàm mục tiêu Y1 Y2 Số liệu Phƣơng sai tái Phƣơng sai dƣ Độ lệch quân phƣơng Số thí nghiệm tiến hành Số hệ số ý nghĩa Tiêu chuẩn t-Student Tiêu chuẩn Fisher Ký hiệu S2th S2du Sbi N N’ t0.05 Ftb F Y1 0.000057 0.001042 0.0027 4.303 19.16 18.28 Y2 0.0017 0.0116 0.015 4.303 19.25 6.82 Chú thích: Kết tính theo giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3) abcd giá trị trung bình hàng, sai khác ký tự có ý nghĩa thống kê (p