Báo cáo thực hành môn hoá sinh

Bài báo cáo thực hành môn Hoá sinh dùng tham khảo cho sinh viên các trường Đại Học, Cao Đẳng, Trung cấp…. cách làm các bài báo cáo môn hoá sinh để đạt điểm cao nhất, tốt nhất . Nội dung sơ lược bài báo cáo: Phần mục lục,………………………………………………………………………………………………………………….phần nội dung: mời đọc sơ qua phần mục lục…………………………………………………………………………………….

Báo cáo thực hành hố sinh nhóm MỤC LỤC BÀI NỘI DUNG CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM SINH HĨA ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACI AMIN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL VÀ UREA MÁU XÉT NGHIỆM PROTEIN VÀ BILIRUBINE TRONG MÁU XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU TRANG 12 19 23 26 29 31 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm BÀI CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN TRONG PHÒNG THỰC TẬP SINH HÓA Mục tiêu học tập: Sau học xong sinh viên phải: Trình bày nội qui phòng thí nghiệm sinh hóa Trình bày nguyên tắc cấp cứu phòng thí nghiệm Sử dụng thành thạo số dụng cụ phòng xét nghiệm sinh hóa Lấy bảo quản mẫu bệnh phẩm quy định Hiểu nguyên tắc phương pháp đo quang để áp dụng việc định lượng chất NỘI QUI PHỊNG THỰC TẬP SINH HĨA - Sinh viên (SV) phải đến giờ, vắng mặt phải có giấy xin phép SV đến trễ 10 phút khơng vào phòng thí nghiệm (PTN) - SV khơng tự ý đổi nhóm thực tập - Trước vào PTN, SV phải đọc kỹ lý thuyết thực hành cho buổi thực tập - Trong thực tập SV phải:  Mặc áo blouse có đeo bảng tên  Giữ gìn trật tự  Kiểm tra dụng cụ (thiếu, bể), báo cho cán kỹ thuật 15 phút đầu  Sử dụng dụng cụ nhóm  Khơng rời PTN lúc thực tập, khơng trước quy định  Thực tập xong, SV rửa dụng cụ, ký trả dọn vệ sinh nơi thực tập  Nếu dụng cụ bị mát hay hư bể, nhóm thực tập chịu trách nhiệm làm tờ tự kiểm (xử lý tùy trường hợp cụ thể)  Mỗi sinh viên thực tập làm tường trình kết học tập nộp lại cuối buổi  Kết kỳ thi thực tập tính trên: điểm chuyên cần, thao tác thực tập, kết tường tình thực tập điểm kiểm tra cuối tập  Không tự ý khởi động thiết bị, máy móc PTN  Chú ý: Để đảm bảo an toàn cần nhớ: Báo cáo thực hành hố sinh nhóm - Khơng đổ nước vào acid đậm đặc - Khơng hút hóa chất miệng - Không tự sử dụng thiết bi, máy móc hóa chất chưa phép cán phụ trách CÁC KỸ THUẬT CẤP CỨU CƠ BẢN TRONG PTN SINH HÓA Áp dụng tạm thời chuyển bệnh nhân đến bệnh viện cho trường hợp nhẹ 2.1 Phỏng da - Phỏng da vật nóng - Phỏng nhẹ: Dùng gạc tẩm dung dịch acid piric bão hòa đắp lên - Phỏng nặng: Đắp nhẹ gạc tẩm dung dịch acid piric lên vết phỏng, sau đưa đến bệnh viện Tránh băng chặt tránh dùng vaselin hay thuốc mỡ - Phỏng hóa chất Trước tiên làm trơi hóa chất khỏi da cách ngâm vết vào chậu nước lớn để vòi nước chảy nhẹ Sau dùng hóa chất trung hòa - Phỏng acid: đắp vải mùng tẩm dung dịch Natri bicarbonate 8% - Phỏng kiềm: đắp vải mùng tẩm dung dịch acid piric 3%  Phỏng mắt Acid hay Brom: Tắm mắt tức khắc ly nước đầy bàn tay  chụm lại vốc nước Sau tắm mắt dung dịch Natri bicarbonate 1% Chất kiềm vào mắt: Tắm mắt nước trên, xong tắm tiếp  dung dịch acid boric 1%  Ngộ độc   Chất độc vào miệng: - Acid: súc miệng nhiều lần dung dịch Natri bicarbonate 1% - Kiềm: súc miệng nhiều lần dung dịch acid boric 1% - Các hóa chất khác: súc miệng nhiều lần nước lạnh Nhiễm độc: - Mang nạn nhân để nơi thoáng khí Cho uống ly café đen hay muỗng súp siro cafein - Hô hấp nhân tạo (nếu cần) lúc chuyển đến bệnh viện  Điện giật Báo cáo thực hành hố sinh - nhóm Trước hết ngắt cầu dao điện ở nơi có cầu dao điện, nới rộng quần áo nạn nhân đem nơi thống - Hơ hấp nhân tạo chuyển đến bệnh viện ( trường hợp nặng)  Hỏa hoạn - Ngọn lửa nhỏ: dập tắt khăn, vải bố ướt hay cát Lửa bắt cháy quần áo: lăn vài vòng đất dập tắt ngon lửa bạn lấy vải bố trùm lên chỗ cháy ép sát tắt lửa - Tránh việc chạy hoảng loạn Tóm lại: bị ngộ độc, … SV nên báo với nhân viên phụ trách PTN để chăm sóc kịp thời CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG 3.1 Ống nghiệm – Thường ống hình trụ, làm thủy tinh, thường đặt giá để – Ống nghiệm thường dùng làm phản ứng (nên phân biệt với ống ly tâm) – Khi đun ống lửa đèn cồn cần ý:  Ống nghiệm chứa 1/3 ống nghiệm  Ống nghiệm kẹp gỗ hay kẹp kim loại cầm nghiêng góc 45 Luôn lắc nhẹ ống nghiệm đun  Miệng ống phải quay vào chỗ khơng có người (tránh bắn, người khác)  Không đun trực tiếp ở đáy ống nghiệm mà đun ở nửa phần 3.2 Cốc có mỏ (Becher) - Cốc có mỏ dùng để đựng dung dịch PTN hay để đun, đun phải lót lưới cách nhiệt ở phía dưới, đun xong không để trực tiếp lên vật lạnh (vỡ) - Nhiều hình dạng kích thước (5 ml - lít) khác nhau, chia vạch khơng 3.3 Bình cầu (Ballon) - Có nhiều loại dung tích khác nhau, làm thủy tinh chịu nhiệt - Đáy tròn hay đáy Loại đáy tròn thường dùng đun lắp vào hệ thống chưng cất, đáy dùng chiết tách chất rắn khỏi chất lỏng - Loại bình có vạch để thể tích xác mà dung dịch chiếm gọi bình định mức Bình định mức có nhiều thể tích khác nhau: 25ml, 50ml, 100ml bình định mức dùng để pha nồng độ theo thể tích dung dịch Báo cáo thực hành hố sinh nhóm 3.4 Ống đong - Dùng để đong lượng dịch gần Có dung tích từ 5ml đến lít - Thường làm thủy tinh hay polythylen 3.5 Ống hút (Pipette) - Pipette làm thủy tinh - Trên pipette thường có chia vạch để thể tích dung dịch chứa bên (vd: 5ml, 1ml) loại pipette thể tích (pipette volume) có bầu ở để lượng dung dịch chứa bên - Khi sử dụng ý xem đầu pipette có vạch nhám hay khơng (vạch nhám nhám, khơng màu hay sơn màu vàng, đỏ, xanh…)  Có vạch nhám: hút ta thổi giọt cuối  Không vạch nhám: hút ta không thổi giọt cuối - Trước hút, kiểm tra lại thể tích tên dung dịch cần hút - Dùng ball cao su để hút (không hút miệng) - Khi sử dụng nhớ dùng pipette thẳng đứng, dùng ngón trỏ để, dùng ngón trỏ để điều chỉnh thể tích muốn lấy, ý phải để ống hút ngang với tầm nhìn mắt  Hiện nay, ngồi loại pipette thường có loại Micropipette (pipette tự động):  Có thể dùng để hút xác lượng dung dịch nhỏ (μl)  Có thể điều chỉnh thể tích dung dịch cần lấy cách nhanh chóng, dễ dàng sai số thao tác 3.6 Bình nón (Erlenmeyer) - Bình thủy tinh, hình nón, ùng để chứa dung dịch, hay dùng để chuẩn độ thể tích - Có nhiều kích thước khác nhau: 50ml, 100ml, 200ml 3.7 Ball cao su - Thường làm cao su - Dùng với pipette thủy tinh để tránh hút miệng 3.8 Một số dụng cụ khác:  Cọ ống nghiệm  Lưới tráng Amiant  Phễu lọc  Đũa khuấy thủy tinh hay polyethylen Báo cáo thực hành hoá sinh nhóm Kẹp ống nghiệm  CÁCH LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM 4.1 Chuẩn bị dụng cụ Mẫu máu lấy để phân tích số hóa sinh thường máu tĩnh mạch, có máu động mạch mao mạch Dụng cụ để lấy máu gồm: - Bơm, kim tiêm (loại dùng lần) - Dây thắt (bằng cao su mềm, độ đàn hồi tốt) - Ống đựng bệnh phẩm: ống nghiệm - 10ml, nút phải khô - Chất chống đông sử dụng: Heparin, Natri citrat, Natri oxalat Sự lựa chọn chất chống đơng tùy thuộc vào mục đích xét nghiệm 4.2 Chuẩn bị bệnh nhân Lấy máu vào lúc sáng sớm, nhịn đói 12 tiếng nồng độ chất máu phản ánh trung thực thông số thực bệnh nhân, tránh yếu tố gây sai số Chuẩn bị lấy máu, bệnh nhân nghỉ khoảng 15 - 20 phút, giải thích cho bệnh nhân cách lấy máu để bệnh nhân yên tâm tiến hành lấy máu Nhất số xét nghiệm phân tích rối loạn thăng acid base, tránh tăng thơng khí, dẫn đến kiềm hơ hấp, dẫn đến thơng số định lượng bị sai lệch 4.3 Cách lấy máu 4.3.1 Lấy máu tĩnh mạch Thường lấy máu ở khủy tay Bệnh nhân nằm ngồi, tay duỗi thoải mái vật cứng Dùng dây thắt ở khủy tay 2-3cm, tiêm kim vào tĩnh mạch, kéo nhẹ bơm tiêm kiểm tra xem kim vào tĩnh mạch chưa (nếu có kéo bơm có máu) Bỏ dây thắt lấy máu để tránh tượng ứ máu, làm tăng lượng CO 2, O2 thay đổi thành phần máu 4.3.2 Lấy máu động mạch Lấy máu động mạch phức tạp, gây nguy hiểm cho bệnh nhân, cần bác sĩ, kỹ thuật viên có kinh nghiệm Khi lấy máu động mạch nên để máu tự động chảy vào bơm tiêm (do áp lực động mạch) Nên tráng bơm tiêm heparin 4.3.3 Lấy máu trẻ em Thường lấy máu tồn phần máu mao mạch Vị trí lấy máu thường ở gót chân Dùng khăn ẩm ấm lau vị trí lấy máu, sát khuẩn dùng kim vô khuẩn để lấy Báo cáo thực hành hố sinh nhóm máu Bỏ giọt máu đầu tiên, giọt nên hứng vào ống thủy tinh chứa heparin Máu xét nghiệm sinh hóa gồm ba loại: Máu toàn phần, huyết tương, huyết Máu sau lấy khỏi thể bị đông lại thành phần có ion Ca 2+ Loại bỏ ion Ca2+ máu khơng đơng Các chất loại bỏ ion Ca2+ gọi chất chống đơng máu Có nhiều loại chất chống đông EDTA (muối ethylen diamin tetraacetic acid), kali oxalat, natri citrat EDTA thường dùng cho xét nghiệm huyết học (15mg/ml) Kali oxalat ngày y học sử dụng, natri citrat thường dùng cho xét nghiệm phân tích yếu tố chống đơng (dung dịch 3.28%) Heparin (0,01-0,1ml/ml máu) có chứa chất kháng thrombin kháng yếu tố Xa Heparin thường sủ dụng làm xét nghiệm sinh hóa máu như: phân tích khí máu, phân tích hóa sinh, lâm sàng cấp cứu Máu có chứa chất chống đơng gọi máu tồn phần, ly tâm lấy phần dịch ở gọi huyết tương có chứa yếu tố đông máu Khi máu không chứa chất đông cục máu đơng lại hình thành theo chế đông máu tự nhiên Ly tâm lấy phần dịch ở huyết 4.3.4 Cách lấy huyết Lấy máu vào ống nghiệm, đậy ống nghiệm nút cao su bơng mỡ (bơng gòn khơng thấm nước) để ở nhiệt độ phòng vài Nếu ta cần có huyết nhanh để phân tích cầm ống nghiệm lòng bàn tay để ống nghiệm tủ ấm để cục huyết hình thành cách tự nhiên, tiết huyết nhiều Khi cục máu đông, dùng que thủy tinh nhỏ sợi bạch kim nhẹ nhàng tách phần cục huyết dính vào thành ống Cục huyết co lại nhanh tiết huyết Gạn lấy huyết dùng pipette để hút huyết Nếu huyết lẫn hồng cầu, đem ly tâm lại (300 vòng/ phút phút) lấy phần huyết Một số xét nghiệm cần lấy huyết (định lượng kali, natri) li tâm cục máu đơng hình thành tách cục huyết khỏi dính vào thành ống, thời gian không nên 4.3.5 Cách lấy máu toàn phần hay huyết tương Xét nghiệm máu toàn phần hay huyết tương để tránh loại trừ sai số cso thể gặp hoại huyết ngăn ngừa chất khuếch tán từ hồng cầu vào huyết tương Thường chất chống đông cho sẵn vào ống đựng mẫu máu, cho máu vào cần lắc liên tục để tránh máu đông lại Ly tâm lấy phần dịch ở Báo cáo thực hành hoá sinh nhóm 4.3.6 Bảo quản mẫu máu Thời gian bảo quản cho phép với mẫu huyết huyết tương khoảng 4h ở nhiệt độ phòng 1-2 ngày ở nhiệt độ – 0C Muốn giữ lại mẫu lâu cần để ở nhiệt độ 00C Đối với mẫu để định lượng enzym cần tuân theo quy địnhcụ thể phương pháp định lượng Thực tế có chất tương đối bền vững ở nhiệt độ 20 0C khoảng thời gian dài Cl, K, Na, Mg, Fe, hemoglobin, acid uric, cholesteron, tryglycerid, phosphotid LẤY NƯỚC TIỂU  Chuẩn bị dụng cụ Bình chứa nước tiểu, thường dùng bình thủy tinh có chia độ theo ml, lít…hoặc ống nghiệm thủy tinh 10ml-15ml, rửa sấy khơ có nút  Cách lấy nước tiểu - Với xét nghiệm định tính thơng thường: Dùng nước tiểu thời gian ngày, lấy nước tiểu dòng, bỏ phần đầu (dễ có tạp nhiễm bởi dịch nhầy, tế bào bong, vi khuẩn) Một số trường hợp nên lấy vào thời gian thích hợp như: o Viêm tiết niệu nên lấy nước tiểu lúc ngủ dậy o Nghi ngờ glucose niệu lấy nước tiểu sau bữa ăn o Urobilinogen dễ phát khoảng 14-16 - Với xét nghiệm định lượng: Thường thu góp nước tiểu 24h Thường cho thêm vào bình vài giọt thymol rượu 5ml xyanua 4% Đến ấn định cho bệnh nhân tiểu hết, bỏ phần nước tiểu Trong 24 thu tất nước tiểu bệnh nhân vào bình sạch, ý lấy phần nước tiểu bệnh nhân đại tiện Ngày hôm sau vào thứ 24, cho bệnh nhân tiểu lần cuối vào bình Đo thể tích nước tiểu 24h lấy 0.5 lít gửi đến phòng thí nghiệm kèm theo thơng tin sau: thể tích nước tiểu 24h, tên, tuổi, giới tính, chế độ ăn, khối lượng nước uống, thuốc dùng, trạng thái nghỉ ngơi hay hoạt động bệnh nhân, chẩn đoán - Bảo quản mẫu nước tiểu: Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Khi phân tích nước tiểu nên dùng nước tiểu tươi, để ở nhiệt độ phòng Nếu chưa phân tích mấu để mẫu ở – 0C vòng ngày, mục đích phân tích hormon nồng độ thuốc, ở điều kiện không bị phân hủy Nếu cần giữ mẫu ngày để mẫu 00C Nói chung khơng dùng hóa chất để bảo quản LẤY VÀ BẢO QUẢN MỘT SỐ DỊCH KHÁC 6.1 Lấy dịch vị Mục đích để chẩn đốn bệnh dày, phát vi khuẩn gây bệnh Dịch vị lấy sau bệnh nhân nhịn đói 12 Khi bị hẹp mơn vị hay hang vị phải rửa dày từ chiều hôm trước Các thuốc ảnh hưởng đến tiết dịch vị phải ngừng sử dụng 24 trước làm nghiệm pháp Trước đây, dịch vị lấy ống hút Einhorn Dịch vị để chẩn đoán tế bào, nghiên cứu tác dụng HCl, pepsin dịch vị Ngày chẩn đoán bệnh dày thường dùng kỹ thuật nội soi Kỹ thuật cho phép bác sĩ quan sát niêm mạc dày, tình trạng tiết dịch vị lấy dịch vị lấy mẫu niêm mạc dày để phân tích Mẫu dịch vị nên phân tích sau lấy 6.2 Lấy dịch não tủy Là lớp dịch khoang màng nhện bao bọc xung quanh não tủy, ở ống nội tủy, não thất, bảo vệ cho trung ương thần kinh biến đổi áp lực, sang chấn Mỗi thương tổn dù nhỏ não tủy ảnh hưởng đến tính chất dịch não tủy Phân tích biến đối chẩn dốnđược số bệnh thần kinh, theo dõi tiến triển bệnh Lấy dịch não tủy phức tạp đòi hỏi bác sĩ có kinh nghiệm Khi chọc dịch não tủy nên hứng bệnh phẩm vào hai ống nghiệm có nút cao su Trong tường hợp xuất huyết màng não hai ống lẫn máu Trong tường hợp dịch não tủy có lẫn máu chọc phải mạch máu ở có máu, ống hai khơng có Nên tiến hành phân tích mẫu 6.3 Cách lấy sữa Cần lấy mẫu sữa với thời gian khác  Mẫu đầu đươc lấy vào buổi sáng sớm trước lúc cho bú bữa đầu ngày  Mẫu thứ hai lấy lúc cho bú trưa  Mẫu thứ ba lấy vào buổi tối sau cho bú xong bữa tối Khi lấy mẫu nên ghi tuổi sữa (như lấy sữa vào tháng thứ mấy) Có thể lấy mẫu sữa lúc: mẫu đầu lấy trước cho bú, mẫu thứ hai cho bú, mẫu thứ ba lấy sau cho bú, khối lượng lần Báo cáo thực hành hoá sinh nhóm Bảo quản sữa để ở nhiệt độ 0-40C 24 NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG 7.1 Định luật hấp thu ánh sáng: Định luật Beer – Lambert Chiếu chùm tia đơn sắc có bước sóng λ, cường độ I o vào dung dịch màu đồng có nồng độ C, chiều dày lớp dung dịch mà ánh sáng qua Khi qua dung dịch, phần ánh sáng bị hấp thu (I h), phần bị phản xạ (Ip), phần lại I qua dung dịch: Io = Ih + Ip + I Vì Ip nhỏ nên: Io = Ih + I Trên thực nghiệm, Bongueur Lambert chứng minh nêu định luật “Những lớp chất dày đồng điều kiện khác nhau, luôn hấp thu tỉ lệ chùm tia rọi vào lớp chất đó” Beer – Lambert mơ tả liên hệ yếu tố định luật biểu diễn sau: I I = 10-klC hay Io log = klC Io Với k = hệ số hấp thu, phụ thuộc vào chất chất màu dung mơi, bước sóng chùm tia nhiệt độ I = T (Transmittance) = Độ truyền quang, độ thấu quang ( %) Io I = D (OD = Densite optique) = Mật độ quang dung dịch Log Io D = Log 100%T D = klC Chú ý: Định luật Beer – Lambert với chùm tia đơn sắc Theo công thức trên, điều kiện, k l không đổi, ta nhận thấy mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch Do đó, so sánh nồng độ chưa biết dung dịch với nồng độ mẫu, ta có: D = klC D Do = klCo Do C C Co C = = Co Do Báo cáo thực hành hố sinh nhóm BÀI LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY A ĐẠI CƯƠNG Lipid thuộc nhóm hợp chất khơng tan tan nước & dung môi phân cực, dễ tan dung môi hữu (không phân cực) : Cloroform, methanol, ether, benzen… Nhũ tương dầu nước nhũ tương khơng bền, cho thêm chất nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật, protein… nhũ tương bền Thủy phân chất béo môi trường kiềm mạnh như: NaOH, KOH đun nóng cho xà phòng & glycerol (gọi xà phòng hóa) Lipid đóng vai trò quan trọng việc tham gia cấu tạo mô động vật, cung cấp lượng cho thể Lipid thức ăn đưa vào thể (chủ yếu Triglycerid) nhờ men tiêu hóa: Lipase & men khác thủy phân để tạo thành chất: acid béo, glycerol, sphingozin, cholesterol số sản phẩm thủy phân khơng hồn thành mono & diglycerid Những sản phẩm lại tổng hợp lại thành Lipid tế bào ruột vào hệ tuần hoàn, phần lớn theo đường bạch huyết dạng kết hợp Lipoprotein – chất ở máu, tác dụng men Lippoprotein lipase lại phân hủy thành sản phẩm glycerol, acid béo… Acid béo thối hóa theo đường  oxy hóa tạo thành mẫu acetyl coenzym A Quá trình xảy chủ yếu ở gan Một phần acetyl coenzym A vào chu trình Krebs tạo thành CO & H2O Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetyl coezym A tích tụ lại để tạo thành sản phẩm acid aceto acetic, acid  hydroxy butyric & aceton; chất có tên chung Cetonic (thể Ceton) Sự gia tăng chất Ceton máu gây tượng nhiễm acid đồng thời kéo theo xuất chất qua nước tiểu B CÁC THÍ NGHIỆM: thí nhiệm THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT TÍNH HỊA TAN Cho vào ống nghiệm: Dầu ăn Nước cất Ethar (hay alcol) Ống giọt 1ml Ống giọt 1ml 23 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Aceton Lắc kỹ Kết quả: Biện luận: - Ống 1: Dầu có tỉ trọng nhỏ nước, nên mặt nước - Ống 2: Dầu tan dung môi hữu tạo thành nhũ tương bền THÍ NGHIỆM 2: SỰ NHŨ TƯƠNG HĨA Nhũ tương hóa nước nhũ tương không bền, cho thêm chất làm nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật, protein, Na2CO3, lecithin… nhũ tương bền Cho vào ống nhiệm: Nước cất Dầu ăn Na2CO3 10% Xà phòng Ống 10ml giọt 10 giọt Ống 10ml giọt 10 giọt 24 Báo cáo thực hành hoá sinh nhóm Lắc mạnh – Để yên phút - Nhận xét ống giải thích tượng xảy 25 Báo cáo thực hành hoá sinh nhóm Kết quả: THÍ NGHIỆM 3: TÌM THỂ CETON TRONG NƯỚC TIỂU Nguyên tắc: Sodium nitroprussiat tác dụng với chất ceton cho phức chất màu tím, phản ứng xảy mơi trường kiềm Ceton + Na nitroprussiat OH  phức chất có màu tím Thuốc thử: - Sodium nitroprussiat 10% nước – Bảo quản tối dung dịch mau chuyển sang màu xanh ve, phải pha lại - Acid acetic kết tinh - NH4OH đậm đặc Tiến hành: Cho vào ống nghiệm: - Nước tiểu: 10 giọt - Acid acetic đậm đặc: giọt - Sodium nitrioprussiat 10% : giọt Trộn đều, hút 0,5 ml NH4OH đậm đặc – nghiêng ống nghiệm 450 – nhỏ cẩn thận giọt theo thành ống Quan sát: sau vài phút có ceton thấy vòng tím ở mặt phân cách hai dung dịch Kết quả: 26 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Bình thường khơng ceton nước tiểu 27 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm BÀI XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL, UREA TRONG MÁU A ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU Glucose có nguồn gốc từ thức ăn tân tạo từ acid amin sản phẩm thoái hoá Lipid gan đảm nhiệm tổng hợp Mục đích việc xét nghiệm Glucose giúp ta chẩn đoán theo dõi bệnh tiểu đường Phương pháp ENZYMATIC (End point) NGUYÊN TẮC Glucose huyết bị oxy hoá bởi phân hoá tố Glucose Oxydase cho Gluconic Acid H2O2 hợp với Phenol 4-aminoantipyrine có diện Peroxidase cho màu đỏ tím Phản ứng tóm tắt sau: Glucose + O2 + H2O Glucose oxidase H2O2 + Phenol + 4-aminoantipyrin Gluconic acid + H2O2 Peroxidase Red quinone + H 2O MẪU THỬ: 2.1 Huyết không tiêu huyết – Mới lấy 2.2 Có thể dùng Huyết tương (lấy với kháng đơng Heparin Fluoride) 2.3 Dịch não tuỷ THUỐC THỬ: Dạng KIT có sẵn Bao gồm: - Reagent (R1)  Phosphate Buffer pH 7.4  Phenol  Glucose Oxidase  Peroxidase  4-aminoantipyrin - Glucose standard: 100 mg% - g/L – 5.56 mmol/L 4.KỸ THUẬT: Nước cất Reagent Glucose standard Huyết Blank 1000 µl Reagent blank Standard blank Sample 1000 µl 1000 µl 10 µl 1000 µl 10 µl 28 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Trộn – Đọc kết ở máy quang phổ kế sau 30 phút (nếu để ở tº 20ºC - tº 25ºC) sau 10 phút (nếu để ở tº 37ºC) – Dùng ống B = ED để chỉnh máy Màu bền vòng 60 phút (bước sóng = 500 nm 490 nm) Có thể đo %T – Abs – C Nếu đo %T or Abs: Ta dùng công thức tính kết quả: x n = mg% (hoặc g/L mmol/L) *GHI CHÚ: Nếu tính mg% n 100 Nếu tính g/L n Nếu tính mmol/L n 5.56 KẾT QUẢ Phương pháp Enzymatic: 75 - 115 mg% hay (4,2 – 6,4 mmol/L) TRỊ SỐ BÌNH THƯỜNG 29 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm BÀI XÉT NGHIỆM PROTEIN VÀ BILIRUBIN TRONG MÁU A XÉT NGHIỆM PROTEIN TRONG MÁU Protein có nguồn gốc ngoại sinh từ thức ăn nguồn gốc nội sinh từ gan hệ thống nội mạc võng mô Trong thể Protein giữ nhiệm vụ nhiệm vụ: Dinh dưỡng – Chuyên chở - Đặc biệt – Sinh lý Xét nghiệm Protein total tỉ số A/G giúp ta việc chẩn đoán theo dõi trường hợp nước, bệnh gan thận PHƯƠNG PHÁP SO MÀU (PHẢN ỨNG BIURET) Nguyên tắc Trong mội trường kiềm , Biuret có nhóm CO – NH, giống liên kết peptid) kết hợp với Cu2+ phức chất màu tím hồng Tương tự trường hợp protein Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein có dung dịch (huyết thanh) Do đó, ta định lượng protein cách đọc mật độ quang máy quang phổ kế ở bước sóng λ = 530nm Thuốc thử - DD protein mẫu 6,25 g/l (0,625g): cân 6,25g Albumin trứng pha nước cất vừa đủ 100ml - Thuốc thử Gornall (Biuret): CuSO4 : 1,5g Tartrat Kalium Natrium: 6g Nước cất: 500ml Lắc cho tan, thêm vào 300ml dd NaOH 2,5 N – lắc Thêm 1g Kali Iodua lắc cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 1000ml Tiến hành Dùng ống ngiệm: Ống R Ống S Ống U Mono Reagent 1000µl 1000µl 1000µl Huyết 20 µl Standard 20 µl ủ 37 30 phút Trộn để ở nhiệt độ PTN 20 phút Đọc mật độ quang (D) ở bước sóng λ = 530nm Kết - Tính nồng độ protein toàn phần huyết (g/l) : D (thử) X 6,25 x D0 (chuẩn) = 0,1 30 g/l Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Biện luận : Giá trị bình trường protein tồn phần huyết : 65 – 85 g/l Như vậy, kết bình thường 31 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm BÀI XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU Nước tiểu dịch tiết quan trọng thể, có nhiệm vụ đào thải chất độc, cặn bã trình chuyển hố chất thể ngồi Sự thay đổi tính chất lý hố thành phần hoá học nước tiểu phản ảnh rõ rối loạn chuyển hoá chất hoạt động quan nội tạng GAN – THẬN Xét nghiệm nước tiểu giúp ta chẩn đoán theo dõi bệnh GAN – THẬN – TUYẾN NỘI TIẾT, trường hợp nhiễm trùng, thai nghén… Lượng nước tiểu tiết tuỳ thuộc vào yếu tố:  Huyết áp (nước tiểu nhiều, nước tiểu ít)  Các kích thích tố  Ăn uống I TÍNH CHẤT VẬT LÝ THỂ TÍCH 1.1 Bình thường: từ 600 đến 2000 ml (Thay đổi theo khí hậu, hoạt động ăn uống) 1.2Trị số tăng: bệnh tiểu đường, đái tháo nhạt (do di truyền) 1.3Trị số giảm: tiêu chảy ói mửa, máu, sốt xuất huyết, viêm thận ngộ độc cấp Hg, suy tim nặng… MÀU SẮC 2.1 Bình thường: có màu vàng nhạt (vàng rơm hay vàng chanh) 2.2 Bệnh lý:  Màu đỏ tiểu máu, tiểu Hb, sạn  Vàng đậm viêm gan, vàng da tắc mật  Đỏ nước rửa thịt viêm cầu thận cấp  Trắng đục, lợn cợn nhiễm trùng tiểu  Trắng sữa tiểu dưỡng chấp PH NƯỚC TIỂU 3.1 Bình thường: 4.7 đến (Trung bình 6) Thay đổi theo chế độ ăn: nhiều thịt acid, nhiều rau kiềm 3.2 Bệnh lý:  pH acid: bệnh tiểu đường nặng có nhiều Ketone  pH kiềm: nhiễm trùng tiểu, viêm bàng quang TỈ TRỌNG 4.1 Bình thường: 1.003 đến 1.030 (Thay đổi tuỳ thuộc vào chất hoà tan) 4.2Tăng: bệnh tiểu đường trường hợp nước II THÀNH PHẦN HOÁ HỌC 32 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm NHỮNG CHẤT VƠ CƠ 1.1 NaCl: – 11g/ nước tiểu 24 1.2 K+ , Ca++ , Mg++ 1.3 Phosphat: (anion định pH nước tiểu) 1.4 Sulfate: 2.5 g/ nước tiểu 24 NHỮNG CHẤT HỮU CƠ Bình thường 2.1 Ure: 15 - 35g/ nước tiểu 24 2.2 Ammoniac: (bài tiết dạng muối Ammonium) ( bệnh suy gan nhiễm trùng nặng) 2.3 Creatin Creatinin: 1.6 - 2g/ nước tiểu 24 2.4 Uric acid: 0.5 - 0.8g/ nước tiểu 24 2.5 Acid amin: (chứa đủ 20 acid amin thể) Mỗi ngày tiết khoảng 3g NHỮNG CHẤT HỮU CƠ Bất thường 3.1 Protein: 30 - 200 mg/ nước tiểu 24 (Thay đổi đứng lâu, lao động nặng)  Tăng bệnh thận: nhiễm mỡ, viêm cấp hay mạn, viêm ngộ độc Hg, Pb – Trong bệnh nhiễm trùng, tim mạch, u não – Trong sốt nhiễm trùng, động kinh, sỏi… 3.2 Glucose: 100 mg/ nước tiểu 24 (Thay đổi theo chế độ ăn nhiều chất ngọt)  Tăng bệnh tiểu đường tuỵ tiểu đường thận 3.3 Ketone (Aceton): - 15 mg/ nước tiểu 24  Tăng bệnh tiểu đường, nhịn đói lâu ngày 3.4 Bilirubin: tăng vàng da viêm gan, tắc mật 3.5 Máu Hb: xuất viêm cầu thận cấp, sỏi, chấn thương đường tiểu (Hb xuất vàng da tiêu huyết, sốt rét) 3.6 Bence Jone Protein: xuất trường hợp u tuỷ xương, ung thư hạch bạch huyết, ung thư máu, bệnh Hodgkin III PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU 10 THƠNG SỐ - Trình bày ngun tắc hoạt động chung máy PTNT - Biết cách vận hành máy để đo mẫu nước tiểu bệnh nhân - Đánh giá kết sau PTNT máy NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY PTNT Nguyên tắc hoạt động chung máy PTNT 33 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Máy PTNT tự đơng máy quang kế sử dụng để đo bán định lượng 10 thông số nước tiểu cách sử dụng nhúng nước tiểu Các bóng đèn phát ánh sáng sử dụng nguồn sáng thời gian đo tối ưu hóa để phản ứng hóa học sựu tạo màu xảy vùng phản ứng thuốc thử Đầu đo máy chứa bóng đèn có bước sóng khác Que thử đặt ở vị trí cố định đầu đo di chuyển miếng đệm thuốc thử, vị trí “ tham chiếu” – nơi hệ thống quang học bắt đầu hoạt động Trong q trình đo, máy kiểm tra vị trí thử thử đầu đo cách thực kiểm tra cách xác dòng ánh sáng khúc xạ đo Nếu que thử đặt thiếu xác đầu đo, máy thơng báo tín hiệu lỗi “ Strip problem – rest” Nguyên nhân phản ứng xét nghiệm riêng biệt thử: Que thử 10 thông số cung cấp testh thử glucose, bilirubin, ceton, tỷ trọng, máu, pH, protein, urobilinogen, nitrit, bạch cầu nước tiểu Test cung cấp thơng tin liên quan tới tình trạng chuyển hóa đường, chức gan, thận, thằng kiềm toan nhiễm trùng đường tiểu Các vùng phản ứng que thử sẵn sàng để sử dụng để lấy từ chai đựng que thử Sau sử dụng, que thử phải bỏ Thao tác phải tuân thủ cách xác, thời gian xác cần thiết kết khách quan Que thử phải giữ chai đậy nắp, nước tiểu phải lấy – lắc khơng quay ly tâm - pH: dựa có mặt chất thị màu: đỏ methyl xanh bromothymol Màu thay đổi từ cam, vàng, xanh - Tỷ trọng: với có mặt cảu cation, proton giải phóng bởi thuốc thử hỗn hợp, tạo nên thay đổi màu chất thị Bromothylmol có màu xanh da trời sang màu xanh sang màu vàng - Glucose: test xảy nhờ enzym glucose peroxydase Xét nghiệm không bị ảnh hưởng bởi tỷ trọng, pH nước tiểu diện thể ceton Sản phẩm tạo phức màu thay đổi từ màu xanh màu nâu - Protein: xét nghiệm dựa nguyên tắc thay đổi nồng độ protein phụ thuộc vào chất thị pH Với môt pH định, xuất màu xanh chứng tỏ có diện protein - Ceton: phản ứng acetoacetic acid với Nitroprusside cho màu hồng - Bilirubin : nguyên tắc xét nghiệm dựa kết hợp bilirubin với diazodtizedbdichcholoroanilin môi trường acid mạnh 34 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm - Urobilinogen: xét nghiệm dựa nguyên tắc muối diazonium phản ứng tức với urobilinogen để tạo nên chất azo có màu đỏ Sẽ khơng có màu màu nhạt màu nồng độ urobilinogen bình thường 1mg% (17µmol/L) thấy mẫu bình thường - Máu: hoạt động Hemoglobin giống peroxydase, phân giải disopropybenzen dihydroperoside Phản ứng xảy cho màu thay đổi từ cam xanh - Nitrit: phản ứng thể có mặt nitrit, phát cách gián tiếp vi khuẩn tạo nên nitrit có nước tiểu đổi màu từ hồng đến đỏ thử Ngay màu hồng nhạt dẫn có ý nghĩa có mặt vi khuẩn nước tiểu - Bạch cầu: xét nghiệm thể có mặt men esterase có bạch cầu hạt Các enzym esterase có tác dụng thủy phân este indoxyl indoxyl giải phóng phản ứng với muối diazonium sản phẩm màu tím * Độ nhạy vùng thử: Glucose – mmol/L (75 – 125 mg/dl) Bilirubin – 14 µmol/L (0,4 – 0,8mg/dl) Ceton 0,5 – 1mmol/L (5 – 10mg/dl) Máu 150 – 620tg/L (0,015 – 0,062 mg/dl) Protein 0,15 – 0,3g/L (15 – 30 mg/dl) Nitrit 13 – 22 umol/L (0,06 – 0,1mg/dl) Bạch cầu -15 TB/uL CÁCH SỬ DỤNG: BƯỚC Bật công tắc máy, thử nghiệm thực hình lên chữ READY FOR TEST ( Lưu ý: loại que thử phải phù hợp với máy) Lấy que thử từ chai đựng que thử đậy nắp lại Nhúng sâu que thử vào mẫu nước tiểu cần thử lấy lên Ấn nút xanh máy ngón tay trái Đồng thời thấm giọt nước tiểu dư cách dựng nghiêng que thử lên giấy thấm mềm Đặt que thử lên bàn thử theo hướng vị trí Khay thử tự động kéo vào bên máy PTNT Chú ý bước thao tác nhanh vòng 10 giây 35 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm Khi thử nghiệm kết thúc, bỏ que thử sử dụng, lau khay thử thấy cần giấy mềm Ghi kết 36 Báo cáo thực hành hố sinh nhóm TÀI LIỆU THAM KHẢO Các kỹ thuật phòng thí nghiệm Hướng dẫn sử dụng máy CLINITEK 50 – BAYER Hướng dẫn sử dụng máy đo đường máu – ROCHE Hóa sinh lâm sang, ĐH Y Dược TP.HCM, 2005 Giáo trình hóa sinh, ĐH Y Dược TP.HCM, 2005 Thực tập Hóa sinh học, ĐH Y Dược Hà Nội, 2003 Thực tập sinh hóa học – ĐH Y Dược TP.HCM 37 ...Báo cáo th c hành hố sinh nhóm BÀI CÁC KỸ THUẬT VÀ KỸ NĂNG CƠ BẢN TRONG PHÒNG TH C TẬP SINH HÓA Mục tiêu học tập: Sau học xong sinh viên phải: Trình bày nội qui phòng th nghiệm sinh hóa Trình... tùy trường hợp cụ th )  Mỗi sinh viên th c tập làm tường trình kết học tập nộp lại cuối buổi  Kết kỳ thi th c tập tính trên: điểm chuyên cần, thao tác th c tập, kết tường tình th c tập điểm kiểm... đến lít - Th ờng làm th y tinh hay polythylen 3.5 Ống hút (Pipette) - Pipette làm th y tinh - Trên pipette th ờng có chia vạch để th tích dung dịch chứa bên (vd: 5ml, 1ml) loại pipette th tích