Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khôNghiên cứu xác định các độc tố gây tiêu chảy acid okadaic, dinophysistoxin1, dinophysistoxin2 trong một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở biển Việt Nam bằng sắc ký lỏng khô
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI DƯỢC HÀ NỘI • HỌC • • • TỐNG THỊ THANH VƯỢNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DIN OPHYSISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT X ~ Ẵ 9 SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIÉN SĨ DƯỢC HỌC • • • HÀ NỘI, NĂM 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI DƯỢC HÀ NỘI • HỌC • • • TỐNG THỊ THANH VƯỢNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DIN OPHY SISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIÉN SĨ DƯỢC HỌC • • • CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 9720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chi PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tống Thị T hanh Vượng i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình hiệu nhiều cá nhân tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Lê Đình Chi, giảng viên mơn Hố phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện trưởng Việm Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, hai người thầy, tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, cho kiến thức quý báu động viên tơi tâm hồn thành luận án GS.TS T hái Nguyễn H ùng Thu, nguyên Hiệu phó, trưởng chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội người thầy động viên, dẫn đóng góp ý kiến q báu cho tơi hoàn thành luận án Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội Ban L ãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án thời gian quy định Các thầy, cô Bộ mơn Hố phân tích - Độc chất Phịng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tơi q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Gia đình người thân chia sẻ, động viên tơi có đủ nghị lực, tâm hồn thành luận án Tác giả luận án Tống Thị T hanh Vượng ii MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG TỔNG Q U AN 1.1 ĐỘC TỐ SINH VẬT BIỂN 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Tóm tắt q trình nghiên cứu số nhóm độc tố tảo đơnbào gây độc cho người 1.2 NGUỒN GỐC, CẤU TRÚC HỐ HỌC, ĐỘC TÍNH VÀ QUY ĐỊNH KIỂM SỐT ĐỘC TỐ DSP 1.2.1 Nguồn gốc độc tố D SP 1.2.2 Cấu trúc hoá học độc tố D SP 1.2.3 Cơ ch ế tác dụng, độc tính độc tố D SP 10 1.2.4 Ngộ độc cho người độc tố D SP 11 1.2.5 Quy định kiểm soát độc tố D SP 12 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ DSP 16 1.3.1 Các phương pháp xử lý m ẫu để chiết độc tố nhóm acid okadaic 16 1.3.1.1 Lựa chọn dung môi để chiết độc tố nhóm OA từ nhuyễn th ể 17 1.3.1.2 Các phương pháp làm dịch chiết ban đầu 18 1.3.1.3 Các phương pháp thuỷ phân mẫu làm sau thuỷ phân 20 1.3.2 Các phương pháp sinh học để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 21 iii 1.3.2.1 Các phương pháp định lượng sinh học in vivo 21 1.3.2.2 Các phương pháp định lượng qua gây độc tế bào 22 1.3.2.3 Các phương pháp hoá sin h 23 1.3.3 Các phương pháp hoá lý để phân tích độc tố nhóm acid okadaic 24 1.3.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 24 1.3.3.2 Điện di mao quản 26 1.3.3 Sắc ký khí 27 1.4 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHĨM ACID OKADAIC 27 1.4.1 Các đặc trưng khối phổ độc tố nhóm O A 27 1.4.1.1 Khối phổ OA kỹ thuật EI C I 27 1.4.1.2 Khối phổ OA kỹ thuật FAB 28 1.4.1.3 Khối phổ OA kỹ thuật ESI 29 1.4.1.4 Khối phổ dạng ester O A 34 1.4.2 Phân tích định tính, định lượng độc tố nhóm OA LC - MS/M S 36 1.4.2.1 Kỹ thuật ion hoá 36 1.4.2.2 Lựa chọn phân tích khối 37 1.4.2.3 Điều kiện sắc k ý 38 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG TH IẾ T BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯ ƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U 43 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ 43 2.1.1 Dung mơi, hố chất chất chuẩn 43 2.1.1.1 Chất chuẩn 43 iv 2.1.1.2 Dung mơi, hố chất 43 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích 43 2.1.2.1 Thiết bị phân tích 43 2.1.2.2 Dụng cụ phân tích 44 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45 2.2.1 Mẫu nhuyễn thể lấy địa phương 45 2.2.2 Mẫu thêm chuẩn 45 2.2.3 Mẫu chuẩn nhuyễn thể có chứa độc tố 45 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời OA, DTX1, DTX2 nhuyễn thể 46 2.3.1.1 Khảo sát xây dựng điều kiện khối phổ 46 2.3.1.2 Khảo sát xây dựng điều kiện sắc ký 47 2.3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết độc tố từ mẫu nhuyễn thể 48 2.3.1.4 Khảo sát điều kiện thuỷ phân để phân tích độc tố toàn phần 48 2.3.1.5 Thẩm định phương pháp 49 2.3.2 Lấy mẫu nhuyễn thể bảo quản m ẫu 51 2.3.2.1 Lựa chọn số lượng cá thể cho mẫu nhuyễn thể 51 2.3.2.2 Khảo sát điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể 51 2.3.3 Phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể biện giải kết 51 2.3.3.1 Tiến hành phân tích mẫu thực 51 2.3.3.2 Các tiêu chí đánh giá kết phân tích độc tố nhuyễn thể 52 2.3.3.3 Các hướng biện giải, bàn luận kết 52 v CHƯƠNG K ẾT QUẢ NGHIÊN C Ứ U 53 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 53 3.1.1 Khảo sát thiết lập điều kiện phân tích OA, DTX1 DTX2 M S 53 3.1.1.1 Điều kiện detector M S/M S 53 3.1.1.2 Điều kiện sắc k ý 59 3.1.2 Khảo sát thiết lập điều kiện xử lý mẫu để chiết OA, DTX1 DTX2 từ nhuyễn thể 65 3.1.2.1 Đồng m ẫu 65 3.1.2.2 Lựa chọn dung môi chiết độc tố 65 3.1.2.3 Lựa chọn thể tích dung mơi chiết 67 3.1.2.4 Khảo sát điều kiện làm dịch chiết 68 3.1.2.5 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố dạng tự 73 3.1.2.6 Khảo sát thiết lập điều kiện thuỷ phân để phân tích OA, DTX1 DTX2 toàn phần nhuyễn thể 74 3.1.3 Khảo sát thiết lập điều kiện bảo quản nhuyễn thể 79 3.1.3.1 Đánh giá độ ổn định độc tố nhuyễn thể số điều kiện nhiệt độ 79 3.1.3.2 Điều kiện bảo quản mẫu nhuyễn thể 82 3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 82 3.2.1 Điều kiện phương pháp thẩm định 82 3.2.1.1 Phương pháp phân tích độc tố tự cột Cortecs 82 3.2.1.2 Phương pháp phân tích độc tố tự toàn phần cột Zorbax 84 3.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích độc tố cột Cortecs 85 vi 3.2.2.1 Độ đặc hiệu 85 3.2.2.2 Độ thích hợp hệ thống 87 3.2.2.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc 88 3.2.2.4 Độ xác 88 3.2.2.5 Độ 91 3.2.2.6 Độ nhậy 92 3.2.3 Thẩm định phân tích độc tố tự tồn phần cột Zorbax 94 3.2.3.1 Độ đặc hiệu 94 3.2.3.2 Độ thích hợp hệ thống 96 3.2.3.3 Độ tuyến tính khoảng nồng độ làm việc 97 3.2.3.4 Độ xác phân tích độc tố tự 98 3.2.3.5 Độ xác xác định độc tố toàn phần 101 3.2.3.6 Độ phân tích độc tố tự 103 3.2.3.7 Độ phân tích độc tố tồn phần 104 3.2.3.8 Độ nhậy 104 3.3 PHÂN TÍCH OA, DTX1 VÀ DTX2 TRONG MẪU NHUYỄN THỂ 107 3.3.1 Lấy mẫu nhuyễn thể phân tích độc tố 107 3.3.2 Kết phân tích độc tố mẫu nhuyễn thể 109 3.3.2.1 Kết phát độc tố tự 109 3.3.2.2 Kết phát độc tố sau thuỷ phân 111 3.3.3 Sự phân bố mẫu phát có độc tố 113 3.3.3.1 Phân bố mẫu có độc tố theo loại nhuyễn thể 113 3.3.3.2 Phân bố mẫu có độc tố theo địa điểm lấy m ẫu 116 vii 3.3.3.3 Phân bố mẫu có độc tố theo thời điểm lấy m ẫu 119 CHƯƠNG BÀN LU ẬN 122 4.1 BÀN LUẬN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐƯỢC XÂY DỰNG 122 4.1.1 Điều kiện phân tích độc tố LC - MS/M S 122 4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu nhuyễn thể 126 4.1.2.1 Cỡ mẫu nhuyễn thể 126 4.1.2.2 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tự 126 4.1.2.3 Điều kiện xử lý m ẫu để phân tích độc tố tồn phần 127 4.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ TRONG NHUYỄN THỂ 129 4.2.1 Loại độc tố phát được, tỷ lệ xuất mức độ hàm lượng nhuyễn thể 129 4.2.2 Dao động xuất độc tố nhuyễn thể yếu tố ảnh hưởng 131 4.3 NGUY CƠ ẢNH HƯỞNG TỚI SỨC KHOẺ VÀ HƯỚNG KIỂM SỐT ĐỘC TỐ NHĨM OA TRONG NHUYỄN THỂ TRONG TƯƠNG LAI 140 KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị 142 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii ... ĐỊNH CÁC ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY ACID OKADAIC, DIN OPHY SISTOXIN-1, DINOPHYSISTOXIN-2 TRONG MỘT SỐ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Ở BIỂN VIỆT NAM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIÉN SĨ DƯỢC HỌC • • • CHUYÊN... nhóm acid okadaic 24 1.3.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao 24 1.3.3.2 Điện di mao quản 26 1.3.3 Sắc ký khí 27 1.4 ỨNG DỤNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ TRONG PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ NHĨM ACID. .. độc thuỷ sinh vật vỏ cứng (Amnesic Shellfish Poisoning) AZA Azaspiracid AZP Ngộ độc azaspiracid thuỷ sinh vật vỏ cứng (Azaspiracid Shellfish Poisoning BAP 1-bromoacetylpyren BNNVPTNT Bộ nông nghiệp