KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA CHỦNG TG VÀ V

TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu ”Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V” được thực hiện tại phòng Kỹ thuật, phân xưởng Vi trùng, khu chăn nuôi Thạ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

CHỦNG TG VÀ V

Sinh viên thực hiện : PHẠM NGỌC THÙY LIÊN Ngành : THÚ Y

Lớp : TC03TYTP Niên Khóa : 2003 - 2008

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 6 - 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA

VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

CHỦNG TG VÀ V

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN PHẠM NGỌC THÙY LIÊN

ThS NGUYỄN MẠNH THẮNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 6 - 2009

CẢM TẠ

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:

ThS Trần Thị Bích Liên, giảng viên trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình hướng dẫn, góp ý giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

ThS Lê Công Tiến, trưởng phòng kỹ thuật thuộc Công ty thuốc Thú Y TW đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại phòng kỹ thuật

ThS Nguyễn Mạnh Thắng, cán bộ kỹ thuật thuộc phòng kỹ thuật của Công ty thuốc Thú Y TW đã hết lòng quan tâm chỉ bảo hướng dẫn em trong thời gian thực tập tại Công Ty

Quý thầy cô khoa Chăn nuôi-Thú y của Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM

đã tận tình giảng dạy em trong những năm học vừa qua

Ban Giám đốc Công Ty Thuốc Thú Y TW, các cô chú, anh chị phòng kỹ thuật, phân xưởng vi trùng, khu chăn nuôi Thạnh Lộc thuộc phòng kiểm nghiệm của Công ty thuốc Thú y TW đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian em thực tập tại Công ty

Gia đình, bạn bè đã hết lòng quan tâm, động viên em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu ”Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn

Pasteurella multocida chủng Tg và V” được thực hiện tại phòng Kỹ thuật, phân

xưởng Vi trùng, khu chăn nuôi Thạnh Lộc thuộc phòng Kiểm nghiệm của Công ty thuốc thú y TW, thời gian thực hiện từ 04/8/2008 đến 04/12/2008, nhằm mục đích tìm

hiểu vi khuẩn Pasteurella multocida các chủng Tg và V về đặc điểm hình thái, tính

chất sinh hóa, đặc tính nuôi cấy của các chủng này khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lên men, khảo sát độc lực của các chủng vi khuẩn trên chuột bạch

Đặc tính hình thái của các chủng vi khuẩn được xác định bằng cách nhuộm màu Gram, quan sát trên kính hiển vi điện tử Cấy vi khuẩn trên đĩa petri thạch máu xem khuẩn lạc

Đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn xác định bằng các phản ứng thông thường kết hợp với bộ Kit API 20E của Pháp

Sử dụng môi trường Hottinger để khảo sát đặc tính nuôi cấy của các chủng khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lên men thông qua các thông số như độ đục, nồng độ vi khuẩn và vật chất khô lượng vi khuẩn

Khảo sát độc lực của các chủng trên chuột: tiêm canh khuẩn pha loãng ở mỗi nồng độ 10-5,10-6,10-7,10-8,10-9, 10-10 cho chuột, quan sát theo dõi thời gian chết, số chết

Kết quả thí nghiệm như sau:

- Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V có đặc tính hình thái hoàn

toàn giống nhau, dạng cầu trực khuẩn, Gram âm (-), kích thước nhỏ Trên thạch máu khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục, mặt vồng, rìa gọn Trên thạch máu sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,0 – 1,5mm

- Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V đều có đặc tính sinh hóa giống

nhau Vi khuẩn cho phản ứng dương tính (+) với oxidase, catalase, citrat, VP, indol Phản ứng âm tính (-) với urease, H2S Không làm tan chảy gelatin Lên men đường

manitol, saccharose, glucose, không lên men đường inositol, sorbitol, rhamnose, melibiose, anygladin và arabinose

- Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V phát triển giống nhau khi nuôi

cấy tĩnh Trong hệ thống lên men, chỉ sau 4,5 giờ nuôi cấy nồng độ vi khuẩn đạt được

đã xấp xỉ 30.109CFU/ml

- So sánh với các nghiên cứu đã được công bố về độc lực của vi khuẩn

Pasteurella multocida thì vi khuẩn chủng Tg và V có độc lực tương đối cao đối với

chuột bạch

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh mục các hình ảnh, đồ thị viii

Danh mục các bảng ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA 3

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu 3

2.1.2 Vi khuẩn Pasteurella multocida 3

2.1.2.1 Ðặc điểm hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida 3

2.1.2.2 Sức đề kháng 6

2.1.2.3 Ðặc tính sinh hóa của vi khuẩn 7

2.1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn 9

2.1.2.5 Độc lực của vi khuẩn 12

2.1.2.6 Đặc tính kháng nguyên 14

2.1.2.6.1 Kháng nguyên giáp mô (K) 14

2.1.2.6.2 Kháng nguyên thân (O) 15

2.1.2.6.3 Kháng nguyên protein 15

2.1.2.7 Sự phân bố các serotype gây bệnh thế giới 17

2.2 MỘT SỐ BỆNH DO VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA .21

2.2.1.Bệnh tụ huyết trùng gia cầm (Fowl cholera) 21

2.2.2 Bệnh tụ huyết trùng trâu bò 21

2.2.3 Bệnh tụ huyết trùng heo 23

Chương 3 NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 25

3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 25

3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 25

3.3.1 Giống vi khuẩn 25

3.3.2 Động vật thí nghiệm 25

3.3.3 Môi trường, hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 26

3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa, đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 26

3.4.1.1 Phương pháp khảo sát đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 26

3.4.1.2 Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 26

3.4.1.3 Phương pháp kiểm tra đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 27

3.4.1.3.1 Nuôi cấy tĩnh 27

3.4.1.3.2 Nuôi cấy lên men 27

3.4.1.4 Phương pháp kiểm tra độ đục 27

3.4.1.5 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 28

3.4.1.6 Phương pháp xác định lượng vật chất khô vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 28

3.4.2 Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V trên chuột bạch 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa, đặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 30

4.1.1 Ðặc điểm hình thái, khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella

multocida chủng Tg và V 30

4.1.2 Ðặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 32

4.1.3 Đặc điểm nuôi cấy (Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V ) 35

4.1.3.1 Nuôi cấy tĩnh 35

4.1.3.2 Nuôi cấy lên men 36

4.2 Độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V trên chuột 40

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 KẾT LUẬN 43

5.2 ĐỀ NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Trang Hình 2.1: Vi khuẩn Pasteurella multocida dưới kính hiển vi 4

Hình 2.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella multocida trên thạch máu 5

Hình 4.1: Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg trên môi trường thạch máu cừu 31

Hình 4.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng V trên môi trường thạch máu cừu 31

Hình 4.3: Kết quả sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 34

Đồ thị 4.1: Sự phát triển của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V 36

Đồ thị 4.2: Gía trị độ đục theo thời gian nuôi cấy 37

Đồ thị 4.3: Vật chất khô theo thời gian nuôi cấy 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa của Pasteurella multocida 8

Bảng 2.2: Khả năng sống của các chủng vi khuẩn trong môi trường khác nhau 10 Bảng 2.3: Lượng vật chất khô của vi khuẩn trong các môi trường khác nhau 11

Bảng 2.4: Phân bố serotype của 53 chủng Pasteurella multocida phân lập từ gà tại

thống lên men 37 Bảng 4.4: Kết quả đếm số vi khuẩn 38 Bảng 4.5: Lượng vật chất khô xác vi khuẩn 38

Bảng 4.6: Độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg đối với chuột

bạch 40

Bảng 4.7: Độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida chủng V đối với chuột

bạch 41

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn Pasteurella multocida là một trong những vi khuẩn gây bệnh phổ biến

cho gia súc, gia cầm Các bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra thuộc nhóm các bệnh nguy hiểm như bệnh tụ huyết trùng gia cầm, tụ huyết trùng trâu bò, tụ huyết trùng heo

Vi khuẩn Pasteurella multocida đã được nghiên cứu nhiều, tuy nhiên đến nay

bệnh do vi khuẩn này gây ra vẫn xuất hiện thường xuyên tại một số nước Tại Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trên gia súc, gia cầm xảy ra hàng năm, nhất là vào mùa mưa

và vào lúc thời tiết thay đổi đột ngột Bệnh gây nhiều thiệt hại về kinh tế cho các cơ sở chăn nuôi và hộ gia đình

Hiện nay, vùng ôn đới bệnh tụ huyết trùng đã giảm nhiều nhờ công tác vệ sinh

và dùng thuốc phòng trong thức ăn Vùng nhiệt đới bệnh vẫn còn phổ biến và luôn xuất hiện như một bệnh nhiễm trùng huyết và tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ chết cao

Vào đầu những năm 90, Trung tâm nghiên cứu Thú Y Nam Bộ đã phân lập vi

khuẩn Pasteurella multocida chủng Tg và V gây bệnh tụ huyết trùng trên gà và vịt tại

các tỉnh phía Nam và sử dụng những chủng này làm vacxin phòng bệnh

Hiểu biết về vi khuẩn Pasteurella multocida có một tầm quan trọng đặc biệt

trong phòng chống, điều trị và chế tạo vacxin phòng bệnh do vi khuẩn này gây nên

Được sự cho phép của Công ty Thuốc Thú Y Trung Ương, dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Thị Bích Liên và ThS Nguyễn Mạnh Thắng, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida

chủng Tg và V”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

- Khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Pasteurella multocida của

chủng Tg và V để sản xuất vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng gia cầm

1.2.2 Yêu cầu:

- Đánh giá một số đặc điểm hình thái, đặc tính sinh hóa, đặc điểm nuôi cấy của vi

khuẩn Pasteurella multocida của chủng Tg và V

- Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida của chủng Tg và V trên

chuột

Bệnh do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra được Bollinger mô tả lần đầu

tiên vào năm 1878, sau đĩ được Toussaint phân lớp vào năm 1879 Cũng vào năm này Kitt gây nhiễm thành cơng vi khuẩn này cho chuột và bồ câu (Theo Nguyễn Thiên

Thu, 1998) Những năm sau đĩ vi khuẩn Pasteurella multocida và những bệnh do vi

khuẩn này gây ra được nghiên cứu và mô tả kĩ lưỡng hơn Từ lúc phát hiện đến nay vi

khuẩn này cĩ nhiều tên gọi khác nhau như Micrococcus gallicidus, sau đĩ vi khuẩn được gọi tên kèm với tên ký chủ mà ta đã phân lớp được như Pasteurella avicida (hoặc Pasteurella aviseptica), Pasteurella bovicida (hoặc Pasteurella boviseptica) Từ năm 1929 Topley và Wilson đề nghị gọi chung là Pasteurella septica, thuật ngữ này

được sử dụng nhiều tại Anh Từ năm 1939 Rosenbusch và Merchant đưa vào kết quả

nghiên cứu từ 114 chủng đã đưa ra tên gọi Pasteurella multocida, tên gọi này được sử

dụng rộng rãi cho đến tận ngày nay (Rimler và Glisson, 1997)

2.1.2 Vi khuẩn Pasteurella multocida

2.1.2.1 Ðặc điểm hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida

Theo Tơ Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2001), phân loại của vi khuẩn

Pasteurella multocida như sau:

Vi khuẩn Pasteurella multocida mang những đặc tính hình thái chung của loài

như có dạng hình gậy ngắn nhỏ, bắt màu rõ ở hai đầu, Gram âm, không di động, không

hình thành nha bào Vi khuẩn Pasteurella tạo giáp mô rất rõ, có thể xác định đặc tính

này bằng các phương pháp thông thường Giáp mô của vi khuẩn hình thành khi được phát triển trong môi trường cơ bản có thêm 0,05% đường glucose, nuôi cấy ở nhiệt độ

370C trong điều kiện hiếu khí Giáp mô không phát triển được trong môi trường không có đường ở 280C Kích thước vi khuẩn từ 0,6 - 2,5μm x 0,2 - 0,4 μm Kích thước của vi khuẩn có thể thay đổi tùy thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy (vi khuẩn có kích thước nhỏ nếu nuôi cấy ở nhiệt độ thấp) và môi trường nuôi cấy (kích thước của vi khuẩn sẽ to hơn nếu được nuôi cấy trong môi trường giàu chất dinh dưỡng và có thêm đường) Trong canh trùng già vi khuẩn có chiều hướng đa hình thái với hình gậy dài ngắn khác nhau

Hình 2.1: Vi khuẩn Pasteurella multocida dưới kính hiển vi

Nguồn : Dẫn lại theo Phạm Quang Thái, 2008

Khuẩn lạc của vi khuẩn có nhiều biến thể, hình dạng và kích thước của khuẩn lạc phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy Trên môi trường agar-tryptose có chứa đường thì khuẩn lạc có kích thước khoảng 1mm (đường kính), hơi lồi ở giữa và

có sắc cầu vồng Sắc cầu vồng của khuẩn lạc thấy rõ nếu ta đặt đĩa chênh chếch ra ngoài ánh sáng mặt trời Dưới kính hiển vi lập thể với ánh sáng chiếu xiên thì sắc cầu vồng của khuẩn lạc có màu hơi đỏ, vàng ánh kim, xanh lơ và xanh lá cây Khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn trong môi trường không có máu, không có đường ở 280C

hoặc nuôi cấy yếm khí thì nhỏ hơn và không có màu đỏ, sắc cầu vồng của vi khuẩn chủ yếu là xanh lơ Khuẩn lạc màu cầu vồng rất độc và gây bệnh thể cấp tính, loại khuẩn lạc màu xanh kém độc Vi khuẩn có khuẩn lạc màu cầu vồng tách rời từng tế bào hoặc từng đôi, không ngưng kết với kháng huyết thanh Vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng rời từng tế bào hay từng cặp nhưng cho ngưng kết với kháng huyết thanh Khuẩn lạc màu xám chỉ có chuỗi dài vi khuẩn, không giáp mô, không độc

Vi khuẩn có khuẩn lạc màu cầu vồng đem nuôi cấy có thể cho khuẩn lạc màu xanh, vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh cũng đột biến và sinh khuẩn lạc màu xám Màu của khuẩn lạc có liên quan đến sự hiện diện của giáp mô Những vi khuẩn có độc lực cao thường tạo khuẩn lạc trơn

Hình 2.2: Khuẩn lạc của vi khuẩn Pasteurella multocida trên thạch máu

Nguồn : Dẫn lại theo Phạm Quang Thái, 2008

Khi nuôi cấy dài ngày hoặc để lâu ở nhiệt độ phòng khuẩn lạc trở nên trắng hơn, mọc sâu vào môi trường thạch Theo Rimler (1992) nếu nuôi cấy lâu ngày khuẩn lạc sẽ nhớt và dính, khi cấy chuyển liên tục thì giáp mô của vi khuẩn bị mất, khuẩn lạc nhỏ

đi, không màu và trong suốt Các biến thể khuẩn lạc xù xì của các type chính thống có thể xảy ra ở canh khuẩn già Nămioka và Murata (1961) nghiên cứu các dạng khuẩn

lạc của vi khuẩn Pasteurella multocida cho thấy chủ yếu 2 dạng: dạng có dung quang

màu xanh và dạng có dung quang sắc cầu vồng Những khuẩn lạc có dung quang màu xanh thường không có hoặc ít có giáp mô, vì thế không có độc lực hoặc có ít độc lực, khuẩn lạc dạng R có dung quang màu xanh lơ Các chủng cường độc, mới phân lập có

dung quang mạnh Khi tiêm truyền các chủng Pasteurella multocida qua bồ câu thấy

có sự tăng lên của những vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S

Đặc tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida cũng không cố định, vi

khuẩn trong các bệnh phẩm, các canh khuẩn mới phân lập thường bắt màu lưỡng cực

rõ rệt Cấy truyền nhiều lần làm giảm đặc tính bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn

2.1.2.2 Sức đề kháng

Vi khuẩn Pasteurella multocida được coi là có sức đề kháng kém đối với ngoại

cảnh Nó dễ bị diệt bằng các chất sát trùng thông thường, bởi tia nắng mặt trời, làm khô Đun lên 560C, vi khuẩn Pasteurella multocida bị giết trong 15 phút, ở 600C trong

10 phút Các dung dịch phenol, NaOH và 0,1% benzalkonium chlorua cũng có khả năng diệt vi khuẩn cao Trong sản xuất vacxin người ta dùng dung dịch formol để bất hoạt vi khuẩn với tỷ lệ 0,3% Nobrega (theo trích dẫn của Nguyễn Lương) thấy canh

trùng Pasteurella multocida trong ống hàn kín để ở 170C còn độc sau 2 năm Trong bông thấm đầy máu chuột bị nhiễm bệnh còn có vi khuẩn sống trong 114 giờ, đến 166 giờ tức là lúc bông khô hoàn toàn thì không còn vi khuẩn sống nữa Trên các tiêu bản phết máu còn vi khuẩn sống sau 24 giờ, đến 39 giờ thì không còn nữa Nếu chứa máu nhiễm trùng trong ống thủy tinh và hàn kín để ở phòng lạnh thì vi khuẩn sống tới 221 ngày Theo Dimove (trích dẫn của Nguyễn Lương) thì vi khuẩn chết nhanh trong đất

có độ ẩm dưới 40% Trong đất có độ ẩm 50% và nhiệt độ 200C, vi khuẩn sống được 5

- 6 ngày nếu pH là 5; được 15 - 100 ngày ở pH là 7 và 24 - 85 ngày ở pH là 8 Nếu canh trùng đông khô và hàn kín thì vi khuẩn không mất độc lực ở -230C hay lạnh hơn Trong xác thối, vi khuẩn có thể sống 1 - 3 tháng, trong phân được 14 ngày ở Srilanka,

De Alwis (1992) thấy rằng nếu cấy canh trùng vào thạch mềm (0,75% thạch) bằng cách cấy thẳng thì vi khuẩn có thể sống trong phòng thí nghiệm 1 năm

Sức đề kháng của vi khuẩn Pasteurela multocida đối với kháng sinh cũng được

nghiên cứu nhiều Tùy thuộc vào tình hình dịch tễ, quá trình sử dụng các loại kháng sinh trước đó, vi khuẩn phân lập được sẽ cho kết quả kháng sinh đồ khác nhau Thí dụ

như các chủng vi khuẩn Pasteurela multocida phân lập được tại Indonesia đề kháng

với lincomycin và sulfadiazin, nhạy cảm với ampicillin, trimethoprim, doxyxyclin,

enrofloxacin và gentamycin (Jonas và cs, 2001) Còn vi khuẩn Pasteurella multocida

thuộc serotype A và F gây bệnh phân lập được tại Hungary lại nhạy cảm với penicillin, certiofur, tetracycline và đề kháng với neomyxin (Kardos và Kiss, 2005)

2.1.2.3 Ðặc tính sinh hóa của vi khuẩn

Phản ứng sinh hóa mang tính đặc trưng cho mỗi giống, loài vi khuẩn Do đó phản ứng sinh hóa được dùng để định danh vi khuẩn

Thành phần dinh dưỡng trong môi trường và điều kiện nuôi cấy có thể ảnh hưởng tới đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, vì thế để kết quả sinh hóa được chính xác không nên nuôi cấy vi khuẩn trên những môi trường ức chế, môi trường chọn lọc mà tốt nhất là nuôi cấy vi khuẩn trên những môi trường phổ thông Canh khuẩn sử dụng

để làm các phản ứng sinh hóa cũng phải thuần khiết, không tạp nhiễm, các thao tác trong quá trình làm phản ứng phải đúng kỹ thuật và trong điều kiện vô trùng

Thông thường kết quả lên men carbohydrate của vi khuẩn được đánh giá qua sự sinh acid trong môi trường cơ bản nước pepton 1% có chứa 1% loại đường yêu cầu

Đa số các chủng vi khuẩn thuộc Pasteurella multocida cho kết quả dương tính đối với galactose, glucose, fructose, mannose, sorbitol, xylose và sucrose Pasteurella

multocida còn có thể lên men mannit và maltose Vi khuẩn Pasteurella multocida

không làm tan chảy gelatin, không mọc trên môi trường khoai tây, không làm vón sữa

Các chủng của vi khuẩn Pasteurella multocida có khả năng sinh indol cao Tuy nhiên

thời gian đọc kết quả tùy thuộc vào môi trường sử dụng, nếu dùng môi trường 1% pepton thì vi khuẩn cho phản ứng dương tính sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 370C Nếu dùng môi trường 2% pepton có bổ sung thêm men bia và một số vitamin thì vi

khuẩn Pasteurella multocida cho phản ứng indol dương tính chỉ sau 18 – 24 giờ nuôi

cấy ở nhiệt độ 370C Vi khuẩn Pasteurella multocida sẽ mất đặc tính sinh indol nếu

cấy chuyển nhiều lần trên môi trường nhân tạo, nhưng sẽ có lại đặc tính này nếu tiêm

cho trâu bò Một số chủng thuộc Pasteurella multocida khi bảo quản sau 2 năm có thể

không lên men xylose (De Alwis, 1992)

Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc trên môi trường thạch Mueller-Hinton

không có máu sẽ cho phản ứng oxidase âm tính

Đặc tính sinh hóa của các chủng thuộc Pasteurella multocida phân lập được tại các vùng khác nhau cũng có thể khác nhau Vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập

được tại Việt Nam có đặc tính sinh hoá thông thường như lên men glucose, sucrose

Riêng đường sorbitol có 3 chủng luôn cho phản ứng âm tính, 3 chủng luôn cho phản ứng dương tính, 26 chủng còn lại cho kết quả thay đổi, lúc âm lúc dương Còn các

chủng thuộc Pasteurella multocida phân lập được từ các vùng dịch ở Srilanka thì lại

không có chủng nào lên men đường lactose, salicin, adonitol, inositol và dulcitol

(Phùng Duy Hồng Hà, 1990; Wijewardana, 1994)

Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa của Pasteurella

Pasteurella Tests

(+) : dương tính (-) : âm tính -U : đa phần âm tính

Nguồn: Rimler R.B và Glisson J.R, 1997

Vào năm 1939, Rosenbusch và Merchant (Trích dẫn theo Rimler và Glisson,

1997) đã xếp những phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida thành 3 nhóm dựa trên

sự lên men đường xylose, arabinose và dulcitol Nhóm một là những chủng lên men arabinose và dulcitol nhưng không lên men xylose, nhóm hai lên men xylose nhưng không lên men arabinose và dulcitol, nhóm 3 là những chủng không thuộc 2 nhóm trên

2.1.2.4 Ðặc điểm nuôi cấy của vi khuẩn

Vi khuẩn Pasteurella multocida có khả năng phát triển tốt trong hầu hết các loại môi trường phổ thông Môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella multocida

có thể là môi trường đặc, thể lỏng hoặc bán lỏng Pasteurella multocida thuộc loại vi

khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy nghi

Nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella multocida trên môi trường thạch máu sẽ ức chế sự

xuất hiện của các biến thể và giúp tái tạo giáp mô của vi khuẩn Một số nghiên cứu còn thấy rằng có thể thay máu bằng các chất khác như Haematin, Catalase, Sodium sulfit

và một số chất khác có đặc tính xúc tác phân hủy H2O2 Vi khuẩn Pasteurella

multocida cũng mọc tốt trong môi trường nước thịt, sau một ngày đêm vi khuẩn làm

đục môi trường và canh trùng thuần khiết có mùi tanh rất đặc trưng, vài ngày sau nước thịt trở lên trong, đáy có cặn nhày, lắc khó tan, trên mặt môi trường có lớp màng mỏng khi lắc lớp màng này vỡ ra (Hoàng Đạo Phấn, 1986) Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 370C, pH trong khoảng 7,2 - 7,4 Tuy nhiên vi khuẩn cũng có thể phát triển trong môi trường có giá trị pH từ 6,2 - 9,8 tùy vào thành phần hóa học của môi trường Trong môi trường nuôi cấy nếu có thêm huyết thanh hoặc máu thì vi khuẩn sẽ mọc tốt hơn Cấy chuyển liên tục trong môi trường nhân tạo vi khuẩn mọc yếu đi

Theo tài liệu của OIE (2004) thì môi trường tốt nhất cho vi khuẩn Pasteurella

multocida phát triển là môi trường YPC (yeast extract pepton L-cystine) có thêm

sucrose và sodium sulfit (Na2SO4) và môi trường TSA (Tryptone soy agar), trên môi

trường TSA kích thước của khuẩn lạc sẽ lớn nhất Vi khuẩn Pasteurella multocida còn

có khả năng mọc tốt trong môi trường đậu phụ Tuy nhiên vi khuẩn Pasteurella

multocida không phát triển trên môi trường thạch MacConkey và thạch Citrate

Để vi khuẩn Pasteurella multocida phát triển tốt trong môi trường nhân tạo cần

cho thêm vào một số chất như cysteine, glutamic acid, leucine, methionine, muối vô

cơ, nicotinămide, pantothenate, thiamine và đường Trong đó leucine có tác dụng kích thích tăng trưởng và thiamine có thể thay thế bằng adenine (Jablonski và cs, 1996)

Michael và cộng sự (2002) thấy rằng vi khuẩn Pasteurella multocida phát triển

trong môi trường phổ thông có cho thêm tụy đệm, CaCl2 và MgCl2 thì giống như phát triển trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion) Trong môi trường giàu chất dinh

dưỡng thì các gen liên quan tới quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động rất mạnh

(Michael và cs, 2002; Shivachandra và cs, 2006)

Peter và cộng sự (1996) sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy

chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của vi khuẩn Pasteurella multocida Môi

trường này gồm 17 thành phần, trong đó có cysteine, acid glutamic, leucine,

methionine, muối vô cơ, nicotinămid, pantothenate, thiamine Kết quả là 40/46 chủng

đem thử (chiếm 87%) mọc tốt trong môi trường này trong vòng 10 lần cấy chuyển và

vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không sinh độc tố như lúc đầu

Trong các loại môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm chứa Pasteurella

multocida thì thấy rằng vi khuẩn này có thể duy trì sự sống trong môi trường

Cary-Blair và L-15 (Leubovitz medium N0 15) hơn 15 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng, tuy

nhiên trong sử dụng Cary-Blair làm môi trường vận chuyển (transport medium) thì tốt

hơn còn môi trường L-15 thích hợp hơn khi bảo quản vi khuẩn trong phòng thí nghiệm

(Eiichi, 1997)

Bảng 2.2: Khả năng sống của các chủng vi khuẩn trong môi trường khác nhau

Số chủng sống Loại môi

Nếu nuôi cấy tĩnh vi khuẩn Pasteurella sẽ phát triển theo 4 pha: pha phát triển

chậm (pha thích nghi) kéo dài từ khi cấy tới giờ thứ 8, pha phát triển (pha logarit) bắt

đầu từ giờ thứ 8 tới giờ thứ 14, pha cân bằng bắt đầu từ giờ thứ 14 tới giờ thứ 19, sau

đó là pha suy tàn

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn để làm vacxin người ta thường sử dụng môi trường cơ bản có thêm sucrose, pepton và chất chiết men bia Môi trường Hottinger

cũng rất tốt cho vi khuẩn Pasteurella phát triển Nuôi cấy có sục khí có thể làm tăng

sinh khối vi khuẩn lên gấp 20 lần so với nuôi cấy tĩnh Sục khí bằng hỗn hợp khí có tỷ

lệ CO2 và O2 khác nhau cũng tác dụng như sục khí bằng không khí thường Nhưng nếu sục khí bằng oxy nguyên chất sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn Nuôi cấy động trên máy lắc vi khuẩn cần 12 giờ để đạt tới pha dừng, còn nuôi cấy có sục khí và khuấy đảo liên tục trong fermentor bằng công nghệ lên men hiện đại chỉ cần 5 giờ đã đạt mức phát triển tối đa Trong môi trường Hottinger có bổ sung thêm đường, tụy đệm vi

khuẩn Pasteurella multocida chủng P52 phát triển mạnh và có thể đạt tới nồng độ 50

tỷ CFU/ml (Trần Đình Từ và cs, 2000) Một số phòng thí nghiệm đã thử nghiệm nuôi

cấy vi khuẩn Pasteurella trong nhiều loại môi trường và có thêm một số chất Kết quả

thu được rất đáng khích lệ Tuy nhiên chất lượng vi khuẩn (kháng nguyên) nuôi cấy trong các môi trường khác nhau thì có thể khác nhau Nồng độ vi khuẩn trong một số môi trường rất cao nhưng hoạt tính huyết thanh học của vi khuẩn có thể bị thay đổi

Phòng thí nghiệm của Bain nuôi cấy vi khuẩn Pasteurella trong môi trường phổ

thông có cho thêm một số chất vào thì sinh khối vi khuẩn đạt được như sau:

Bảng 2.3: Lượng vật chất khô của vi khuẩn trong các môi trường khác nhau Loại môi trường Lượng vật chất khô xác vi khuẩn (Gr/lít)

Môi trường phổ thông + chất chiết men

Môi trường phổ thông + chất chiết men

bia + tụy đệm + tiêu hoá gan bằng men

tụy

3,5

Môi trường phổ thông + chất chiết men

Nguồn: Bain và cộng sự, 1982

2.1.2.5 Độc lực của vi khuẩn

Độc tố của canh trùng Pasteurella được biết đến từ thời Pasteur Từ đầu thế kỷ

20 Baldrey đã nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già lên thỏ và cho rằng vi khuẩn có độc tính của lipopolysacchride

Độc lực của Pasteurella multocida rất phức tạp và không ổn định, nó tùy thuộc

vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh Giáp mô của vi khuẩn là yếu tố độc lực quan trọng, nó ảnh hưởng tới khả năng xâm nhập và phát triển của vi khuẩn trong ký chủ Đa phần những vi khuẩn có giáp mô thì độc lực cao, những vi khuẩn không có giáp mô thì độc lực yếu hoặc không có độc lực Tuy nhiên cũng có trường hợp một số chủng vi khuẩn không có giáp mô nhưng vẫn có độc lực cao và một số chủng có giáp

mô thì độc lực lại thấp Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường nhân tạo qua một đêm thì giáp mô của vi khuẩn phát triển đầy đủ, sau đó mất dần đi Một số tác giả còn cho rằng ở nhiều chủng vi khuẩn độc lực có thể phụ thuộc nhiều vào cấu trúc hóa học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng

Đoạn gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein giáp mô của vi khuẩn Pasteurela

multocida thuộc serotype A:1 có chiều dài 16kp gồm 11 gen và được chia làm 3 phần,

mỗi phần có chức năng riêng biệt, phần một chứa 4 gen là hexA, hexB, hexC và hexD (hex: hyaluronic acid export), phần hai chứa 5 gen là hyaA, hyaB, hyaC, hyaD và hyaE

(hya: hyaluronic acid), phần ba chứa 2 gen là phyA và phyB (phy: phospholipid

substitution of hyaluronic acid) (Chung và cs, 1998) Trong khi đó đoạn gen chịu trách

nhiệm tổng hợp protein giáp mô của vi khuẩn Pasteurela multocida thuộc serotype B:2

gồm có 15 gen và cũng được chia ra làm 3 phần: phần 1 và 3 có tổng cộng 6 gen, chịu trách nhiệm vận chuyển polysaccharide giáp mô lên bề mặt tế bào, phần thứ 2 có 9 gen quy định quá trình tổng hợp polysaccharide giáp mô (Boyce và cs, 2004)

Sự có mặt của các gen exbB, exbD và tonB trong tế bào vi khuẩn cũng ảnh

hưởng tới độc lực của Pasteurella multocida (Montserrat và cs, 2002)

Một số nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn

Phùng Duy Hồng Hà (1990) thử nghiệm độc lực của 3 chủng Pasteurella

multocida phân lập tại các tỉnh phía Nam là Tg, V và HL trên chuột và gà vịt Kết quả

cho thấy các chủng có dung quang màu vàng da cam có độc lực rất cao

Rhoades và Rimler (1990) nghiên cứu độc lực của 5 chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida thuộc serotype D Kết quả là 4 chủng có độc lực từ yếu tới trung bình, 1

chủng không độc Khi nhiễm các chủng vi khuẩn này cho gà bằng cách nhỏ mũi thì không thấy xuất hiện triệu chứng bệnh, nhưng khi tiêm vào buồng hơi thì tỷ lệ gây chết phôi cao

Nghiên cứu của Ramdani và Adler (1993) cho thấy một trong những chủng vi

khuẩn Pasteurella multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò là chủng M1404

thuộc serotype B rất độc đối với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/con thì chỉ sau

18 giờ chuột đã có những triệu chứng nhiễm trùng huyết, xuất huyết giống như ở trâu

bò, vì thế chuột bạch thường được sử dụng trong chẩn đoán phòng thí nghiệm

Diallo và cộng sự (1995) nghiên cứu độc lực của 9 phân lập Pasteurella

multocida thuộc serotype A tại Australia Trong 9 phân lập này có 3 phân lập không

chứa plasmid nhưng rất độc đối với chuột, tiêm liều 100CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trong vòng từ 10 - 24 giờ, trong khi đó 3 phân lập chứa 1 plasmid và 3 phân lập chứa 2 plasmid lại không có khả năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn

Blackall và cộng sự (1998) nghiên cứu độc lực của một số chủng vi khuẩn

Pasteurella multocida thuộc serotype B phân lập được cũng tại Australia, độc lực của

các chủng này rất khác nhau, trong đó chỉ vài chủng có độc lực từ cao đến rất cao, các chủng còn lại có độc lực thấp

Mariana và Hirst (2000) phân lập được 13 chủng Pasteurella multocida trên gà

vịt tại Indonesia Trong đó có 5 chủng độc đối với chuột và 2 chủng độc đối với gà Hai chủng độc đối với gà là những chủng vi khuẩn có giáp mô, nhưng chủng không độc và không có giáp mô như chủng Sidoarjo lại có đặc tính sinh miễn dịch cao

Chung và cộng sự (2001) tiến hành đánh giá độc lực của vi khuẩn Pasteurella

multocida chủng X-73, PBA930 và PBA945 thuộc serotype A trên chuột và gà Độc

lực của chủng X-73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia Đối với chuột thì độc lực của chủng PBA930 là thấp nhất

Năm 2001, Goto và cộng sự có nghiên cứu độc lực của vi khuẩn Pasteurella

multocida gây bệnh cho chim cút tại Nhật Bản thì thấy rằng LD50 của vi khuẩn này

đối với chim cút là 4,3.104CFU/con và đối với chuột là 3,9.102CFU/con Vi khuẩn

Pasteurella multocida chủng P-627 phân lập được từ tim và gan vịt trời bị bệnh tại

Hàn quốc có độc lực rất cao đối với vịt nhà (Kwon và Kang, 2003)

Samưal và cộng sự (2003) nhận thấy rằng trong số các chủng Pasteurella

multocida thuộc serotype A:1 phân lập được tại Mỹ có vài chủng gây chết cho vịt

nhưng độc lực đối với vịt đực cao hơn hẳn so với vịt mái

Borrathybay và cộng sự (2003) có nghiên cứu sự liên quan giữa vỏ và độc lực

của vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A dưới kính hiển vi điện tử bằng kỹ thuật đánh dấu Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng PM-18 và X-73 có độ dày trung bình

của vỏ lần lượt là 91,4nm và 50,4nm, hai chủng này có độc lực cao Hai chủng PM-1

và PM-3 có độ dày trung bình của vỏ chỉ là 21,0nm và 29,8nm nên có độc lực thấp

hơn Tuy nhiên cũng có ngoại lệ như vi khuẩn Pasteurella multocida chủng P-1059 có

độ dày trung bình của vỏ lên tới 101,2nm nhưng chỉ có độc lực trung bình Độ dày trung bình của vỏ vi khuẩn tùy thuộc vào số lượng protein kháng nguyên 39kDa Số lượng protein này càng nhiều thì vỏ vi khuẩn càng dày

2.1.2.6 Đặc tính kháng nguyên

Kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng

loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi Cho đến nay, người ta đã xác định được kháng

nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida có 3 loại chính là kháng nguyên giáp mô

(K) và kháng nguyên thân (O) và các kháng nguyên protein khác

2.1.2.6.1 Kháng nguyên giáp mô (K)

Các nhóm kháng nguyên giáp mô đặc hiệu được xác định bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động do Carter đề xướng Dựa vào sự khác biệt của kháng nguyên

giáp mô người ta chia type huyết thanh của vi khuẩn Pasteurella multocida thành 5

nhóm serogroup là A, B, D, E và F

Giám định sơ bộ các serogroup nhóm D và F có thể thực hiện bằng kỹ thuật khử

bỏ giáp mô bằng một enzym mucopolysaccharidase đặc hiệu, kết quả cho thấy giáp

mô của vi khuẩn thuộc serogroup D có chứa heparin và giáp mô của vi khuẩn thuộc serogroup F có chứa chondroitin sulfate Sự hiện diện của giáp mô còn giúp vi khuẩn chống lại sự thực bào và tác dụng diệt khuẩn của bổ thể

Trong thành phần của giáp mô vi khuẩn còn có polysaccharide Một số nhà nghiên cứu cho rằng polysaccharide liên kết với protein hoặc lipit Polysaccharide có

đặc tính kháng nguyên yếu và không có khả năng tạo được sự bảo hộ trên chuột và thỏ khi thử thách bằng vi khuẩn cường độc Người ta cũng thấy rằng chất chiết giáp mô ở mức độ tinh khiết cao cũng tạo đáp ứng miễn dịch kém và khó khăn Điều này có thể

do sự vắng mặt của các protein có tính sinh miễn dịch cao, thay vào đó là một lượng lớn polysaccharide không có tính sinh miễn dịch Polysaccharide của vi khuẩn

Pasteurella multocida thuộc serotype B:2 chứa monosaccharide arabinose, mannose

và galactose theo tỷ lệ 0,5:2,0:0,8

2.1.2.6.2 Kháng nguyên thân (O)

Kháng nguyên thân lipopolysaccharide của vi khuẩn Pasteurella multocida được

Pirosky thông báo vào năm 1938 Các chủng có nhóm kháng nguyên giáp mô khác nhau có thể có cùng loại kháng nguyên thân Định type kháng nguyên thân được thực hiện bằng kỹ thuật ngưng kết trong ống nghiệm và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch Nămioka và Murata (1961) đã xác định được 12 kháng nguyên thân, ký hiệu từ

1 đến 12 Heddleston và Reber (1972) chia kháng nguyên thân của Pasteurella

multocida thành 16 serotyp ký hiệu từ 1 đến 16 Các kháng nguyên thân này nằm sâu

trong tế bào vi khuẩn và có ảnh hưởng lớn tới phản ứng chéo của các chủng vi khuẩn Lipopolysaccharide là kháng nguyên thân quan trọng, có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao và đóng vai trò quan trọng trong miễn dịch dịch thể (Ruy và Kim,

2000) Lipopolysacchride của vi khuẩn Pasteurella multocida chứa glucose,

2-keto-3-deoxyoctomate, heptose và galactose (ngoại trừ serotype 11) Vi khuẩn thuộc serotype

2 và 5 thì heptose có 2 đồng phân là D-glycero-D-mannoheptose và mannoheptose Trong thành phần lipopolysacchride của các vi khuẩn thuộc serotype 9 còn có rhamnose (Conrad và cs, 1996)

L-glycero-D-Frank và cộng sự (2005) nghiên cứu cấu trúc hóa học của lipopolysaccharide

chiết xuất từ vi khuẩn Pasteurella multocida chủng VP161 và X-73, về cơ bản cấu trúc

hoá học của chất này là giống nhau ở hai chủng trên, chỉ khác nhau về gốc galactose

2.1.2.6.3 Kháng nguyên protein

Các protein của vi khuẩn Pasteurella multocida được coi là những chất có khả

năng sinh miễn dịch cao Trong thành phần của kháng nguyên protein còn có sự hiện diện của polysacchride và lipopolysaccharide

Vi khuẩn Pasteurella multocida có chứa protein màng ngoài (outer membrane

protein - Omp), một số protein màng ngoài có đặc tính kháng nguyên Những năm gần đây có nhiều nghiên cứu về protein màng ngoài mang đặc tính kháng nguyên này

Các protein màng ngoài chủ yếu của vi khuẩn Pasteurella multocida thuộc

serotype A:3 có trọng lượng phân tử là 25kDa, 27kDa, 28 kDa, 37,5kDa, 49kDa và 64kDa, trong đó protein 49kDa có tính kháng nguyên cao nhất (Yue và cs, 1991) Màng ngoài của chủng vi khuẩn Pm-1906 có 9 protein chính với trọng lượng phân tử

từ 25 – 88kDa, trong 9 protein này này thì những protein có trọng lượng phân tử là 28kDa, 30kDa, 37kDa và 44kDa có tính kháng nguyên cao (Pati và cs, 1996; Gatto và

cs, 2002)

Protein màng ngoài của vi khuẩn chủng Pm-656 là protein có trọng lượng phân

tử thay đổi theo nhiệt độ, trọng lượng phân tử chỉ có 28kDa nếu xử lý ở 600C và lên tới 37kDa nếu xử lý ở 1000C (Vasfi và Mittal, 1996)

Khi nghiên cứu protein màng ngoài của 6 chủng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp SDS - PAGE và so sánh với chủng làm vacxin P52 thì Tomer và cộng

sự (2002) thấy rằng: vi khuẩn Pasteurella multocida chủng vacxin P52 có 20 dải băng

polypeptid với trọng lượng phân tử từ 16 - 90 kDa, trong đó các loại polypeptid với trọng lượng phân tử 31, 33 và 37kDa là thành phần chính của màng ngoài Các chủng mới phân lập không có Omp 33kDa, nhưng lại có Omp 39kDa, Omp này không có ở chủng vacxin P52 Omp 37kDa có đặc tính kháng nguyên mạnh cả ở chủng vacxin lẫn chủng phân lập được Đặc tính kháng nguyên của các Omp khác yếu hơn Vi khuẩn

Pasteurella multocida chủng vacxin P52 còn có protein màng ngoài có tính kháng

nguyên cao nữa là Omp 87kDa Gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein màng ngoài

này là gen omp87 nằm ở đoạn 9,0kb HindIII trong bộ gen (genome) của vi khuẩn

(Chaudhuri và Goswami, 2001)

Protein màng ngoài của Pasteurella multocida thuộc serotype B:2 có trọng lượng

phân tử 32 kDa chiếm phần lớn, ngoài ra còn có 2 protein màng ngoài khác với số lượng ít hơn là Opm 39kDa và Opm 28kDa Các protein màng ngoài này có khả năng chịu nhiệt tốt

Vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được ở Anh và xứ Wales có protein

màng ngoài là OmpA và OmpH Trọng lượng phân tử của OmpA là 33kDa và có khả

năng thay đổi theo nhiệt, chỉ biến chất khi nhiệt độ lên tới 100oC, không liên kết vơi peptidoglycan Ngược lại, OmpH có trọng lượng phân tử là 39kDa, lại liên kết tương đối chặt với peptidoglycan và không chịu nhiệt, khi nhiệt độ lên tới 600C là có khả năng thay đổi tính chất (Robert và cs, 2003)

Vi khuẩn Pasteurella multocida chủng VP 161 chứa gen hgbB, gen này có chiều

dài 2991bp và quy định tổng hợp protein có trọng lượng phân tử là 111kDa, protein tạo thành tham gia vào quá trình sinh bệnh trong cơ thể vật chủ (Angela và cs, 2004)

Theo Ali và cộng sự (2004), các chủng Pasteurella multocida của gia cầm thuộc

serotype A có protein giáp mô với trọng lượng phân tử là 39kDa, protein này là yếu tố bám dính và đảm nhận chức năng miễn dịch chéo với một số chủng vi khuẩn thuộc serotype khác

Vi khuẩn Pasteurella multocida có 2 loại lipoprotein là GlpQ và PCP, trong đó

GlpQ có hoạt tính enzym và PCP hiện diện trên bề mặt nếu xử lý bằng phương pháp surface immunopricipitation (Miranda và cs, 2004)

2.1.2.7 Sự phân bố các serotype gây bệnh trên thế giới

- Các serotype gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò

Các chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở châu Á thường thuộc serotype B:2 (chủng châu Á) châu Phi thường thuộc serotype E:2 (chủng châu Phi) ở một vài nước như Ai Cập và Sudan tồn tại cả hai chủng Một số nước khác có đa

chủng như Zimbabwe Trong một nghiên cứu 42 chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được tại các vùng khác nhau của Sudan thì có tới 38 chủng (chiếm

90,5%) thuộc serogroup B và chỉ có 4 chủng (chiếm 9,5%) thuộc serogroup E theo phân loại của Carter Dziva và cộng sự (2000) sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu

gián tiếp để định type kháng nguyên vỏ của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập

được tại Zimbabwe Kết quả cho thấy 59,5% thuộc serogroup A, 14% thuộc serogroup

D, 5% thuộc serogruop B và 21,5% chưa định được type Không có phân lập nào thuộc serogroup E và F

Trong 72 chủng vi khuẩn pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng phân lập

được trên trâu bò tại Mexico thì có tới 61% thuộc serogroup A, 25% thuộc serogroup

D và 14% chưa định type Sử dụng phương pháp khuếch tán trên gel thạch để xác định

kháng nguyên thân O thì các chủng thụôc serotype 3 chiếm phần lớn với 77% (Blanco

và cs, 1995)

- Các serotype gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm

Vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm thường thuộc

serogroup A (John và cs, 2000)

Rhoads và cộng sự (1992) thấy các chủng Pasteurella multocida phân lập được

trong các ổ dịch tụ huyết trùng gia cầm tại Utah đều thuộc 3 serotype là A:1; A:3 và

A:4

Đa phần các chủng Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm phân

lập được tại Srilanka đều thuộc serogroup A (52/53 phân lập), trong đó serotype A:1 là

nhiều nhất, sau đó là A:4, chỉ có 1/53 chủng thuộc serotype D:8 (Wijewardana và cs

1994)

Blackall và cs (1998) nghiên cứu cấu trúc quần thể và tính đa dạng kháng

nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida trên gia cầm tại Australia Trong tổng số

81 phân lập được nghiên cứu bằng phương pháp điện di enzyme (enzyme

electrophoresis) thì có tới 56 kết quả điện di khác nhau Các phân lập này thuộc

Bằng kỹ thuật REP-PCR và PFGE, Gunawardana và cộng sự (2000) xác định

rằng phần lớn các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia

cầm phân lập được tại Australia và Việt Nam thuộc serogroup A, trong đó có serotype A:1, A:3, A:4 và A:3,4

Dziva và cộng sự (2000) sử dụng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp để định

type kháng nguyên vỏ của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại

Zimbabwe Kết quả cho thấy 59,5% thuộc serogroup A, 14% thuộc serogroup D, 5% thuộc serogroup B và 21,5% chưa định được type Không có phân lập nào thuộc serogroup E và F

Davies và cộng sự (2003) nghiên cứu tính đa dạng của vi khuẩn Pasteurella

multocida gây bệnh tụ huyết trùng gia cầm tại Anh và xứ Wales trong 13 năm dựa vào

2 protein màng ngoài là OmpA và OmpH Kết quả cho thấy 68% vi khuẩn thuộc serogroup A, 14% vi khuẩn thuộc serogroup F, 5% vi khuẩn thuộc serogroup D, 4% vi khuẩn thuộc serogroup B và 9% vi khuẩn chưa xác định được serogroup Theo kết quả của Robert và cộng sự (2003) thì vi khuẩn thuộc serogroup A tại Anh và xứ Wale chiếm tỷ lệ còn cao hơn, tới 94%

Bảng 2 5: Serogroup và OMP của 100 phân lập P multocida tại Anh và xứ Wales

Kiểu OMP Serogroup

Trong 111 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại Texas (Mỹ)

thì có tới 92% thuộc serogroup A và 8% thuộc serogroup D Các kháng nguyên thân

chủ yếu là 12, 3, tiếp theo là 1, 2, 6, 7, 10, 13 và 16 Nếu định danh theo cả kháng