Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae chủng PV3952

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm khảo sát một số đặc tính sinh học của chủng M. hyopneumoniae PV3952 dùng để sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi địa phương ở lợn. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, huyết thanh học và thử nghiệm trên lợn, chúng tôi đã xác định được các đặc tính về di truyền, khả năng thích nghi và phát triển trên môi trường nhân tạo, độc lực của chủng vi khuẩn nghiên cứu và đặc biệt là khả năng gây đáp ứng miễn dịch của chủng vi khuẩn này trên lợn.

KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE CHỦNG PV3952 Võ Thành Thìn, Đặng Văn Tuấn, Lê Đình Hải Phân viện thú y miền Trung TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo sát số đặc tính sinh học chủng M hyopneumoniae PV3952 dùng để sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi địa phương lợn Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, huyết học thử nghiệm lợn, chúng tơi xác định đặc tính di truyền, khả thích nghi phát triển môi trường nhân tạo, độc lực chủng vi khuẩn nghiên cứu đặc biệt khả gây đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn lợn Kết nghiên cứu cho thấy, chủng M hyopneumoniae PV3952 có đặc điểm di truyền giống với chủng M hyopneumoniae khác phân lập nước ta Chủng vi khuẩn PV3952 có khả thích nghi tốt môi trường Friis ổn định đời cấy chuyển thứ trở Kết nghiên cứu cho thấy, chủng vi khuẩn có độc lực cao lợn thí nghiệm tính độc khơng thay đổi sau nhiều đời ni cấy mơi trường thí nghiệm Ngồi ra, chủng vi khuẩn có khả gây đáp ứng miễn dịch, bảo hộ mạnh ổn định lợn Từ khóa: lợn, M hyopneumoniae, đặc tính sinh học, PCR Some biological features of Mycoplasma hyopneumoniae strain - PV3952 Vo Thanh Thin, Dang Van Tuan, Le Dinh Hai SUMMARY The objective of this study aimed at investigating some biological features of the M hyopneumoniae strain - PV3952 so as to use for vaccine development against the pneumonia in pigs The genetic features, adaptable ability and growth on Friis medium, the pathogenicity as well as ability to induce immune response in pigs of the M hyopneumoniae strain - PV3952 were detected, by using molecular techniques, serological test and experimental infection in pigs The studied results showed that the genetic features of M hyopneumoniae strain - PV3952 were similar to those of other M hyopneumoniae strains isolated in Viet Nam This bacteria also adapted and grew well on the Friis medium and stability from the 5th generation onwards The result of pathogenic tests showed that, the M hyopneumoniae strain - PV3952 was highly virulent bacteria strain in the experimental pigs, and its pathogenicity was not changed through many passage inoculation generations on Friis medium Moreover, the M hyopneumoniae strain - PV3952 was able to induce strongly immune response against porcine pneumonia Keywords: pig, M hyopneumoniae, biological features, PCR I ĐẶT VẤN ĐỀ Mycoplasma hyopneumoniae (M hyopneumoniae) nguyên nhân gây bệnh viêm phổi địa phương lợn (enzootic porcine pneumonia) toàn giới với tỷ lệ mắc bệnh cao, gây thiệt hại kinh tế lớn cho tất nước chăn nuôi lợn giới Bệnh viêm phổi M hyopneumoniae làm giảm khả tăng trọng, giảm hiệu suất 26 chuyển hóa thức ăn, tăng chí phí điều trị bệnh (Clark cs., 1991) Bệnh không gây tỷ lệ chết cao, nhiên làm tăng nguy mắc bệnh truyền nhiễm hội khác bệnh Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae loại virus cúm lợn (swine influenza) virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) (Sorensen cs., 1997) Sự bám dính M hyopneumoniae vào tế bào lơng nhung KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 đường hô hấp mở mang trình xâm nhập, phá hoại làm tế bào lơng nhung Sự tế bào có chức chuyên biệt tiết chất nhày dẫn đến việc giảm mạnh chế phòng vệ khơng đặc hiệu màng nhày tác nhân khác, làm tăng nguy nhiễm trùng vật chủ với tác nhân vi khuẩn, virus gây bệnh thứ phát (Blanchard cs., 1992, DeBey Ross, 1994) Do đó, khống chế vi khuẩn M hyopneumoniae biện pháp đặc biệt quan trọng nhằm làm giảm tỷ lệ lợn mắc bệnh, ngăn ngừa bội nhiễm tác nhân thứ phát, qua làm tăng hiệu kinh tế cho người chăn ni Phòng bệnh viêm phổi địa phương lợn bao gồm nhiều biện pháp quản lý chất lượng đàn lợn, cải thiện môi trường chuồng nuôi, sử dụng kháng sinh (Maes cs., 2008) Tuy nhiên, tiêm vacxin để phòng bệnh cho lợn, tăng đề kháng với M hyopneumoniae quan trọng khuyến cáo rộng rãi cho người chăn nuôi (Okamba cs., 2007; Jeong cs., 2016; Park cs., 2016) Ở nước ta, bệnh viêm phổi địa phương mô tả từ năm 1950 (Nguyễn Ngọc Nhiên, 1997) Từ đến nay, có số tác giả nghiên cứu bệnh (Nguyễn Thị Phước Ninh cs., 2008; Lê Văn Lãnh cs., 2012) Kết khảo sát gần Đặng Văn Tuấn cs (2016) cho thấy, tỷ lệ lợn bị nhiễm vi khuẩn M hyopneumoniae nước ta cao, xấp xỉ 70% lợn thịt Một số chủng vi khuẩn M hyopneumoniae phân lập mẫu bệnh phẩm phổi lợn thu thập nhiều vùng khác Việt Nam (Võ Thành Thìn cs., 2016) Một chủng chủng M hyopneumoniae PV3952 lựa chọn nghiên cứu để tiến hành khảo sát tất đặc điểm sinh học nhằm lựa chọn làm chủng sản xuất vacxin phòng bệnh II NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung - Nghiên cứu xác định đặc tính di truyền chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 xác định gen p36, p46, p65 p97 mã hóa yếu tố độc lực - Nghiên cứu khả thích nghi phát triển chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 môi trường Friis - Nghiên cứu độc lực chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 lợn - Nghiên cứu khả gây đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 lợn 2.2 Nguyên liệu - Chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 phân lập từ mẫu bệnh phẩm phổi lợn - Lợn - tuần tuổi khỏe mạnh, khơng có kháng thể kháng M hyopneumoniae Bảng Primer phát gen p36, p46, p65, p97 16S rRNA Trình tự primers F- 5’-GCGGGAAGACCACAAAAACC-3’ R-5’-TTCATAAGCCCGGCGAGAAA-3’ F-5’-GCAGCAGGTTGTGGACAGAC-3’ R-5’-CAGCATTTTCGCCTTCAGGAG-3’ F-5’-GCACTAGGCGATTCGCTAAC-3’ R-5’-TCTGCCAGGAAATTCGCTCTT-3’ F-5’-GGAAATTATGCCTATGAATTCG-3’ R-5’-GTGCTCTGTTAGTTTCTAGTCC-3’ F-5’-TTG ATC CTG GCT CAG G-3’ R- 5’-CTT GTG CGG GYY CCC GTC AAT TC-3’ Gen Sản phẩm PCR (bp) Nguồn p36 423 Nghiên cứu p46 660 Caron cs (2000) p65 503 Nghiên cứu p97 318 Adams cs (2005) 16S rRNA 900 Pettersson cs (1996) 27 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 - Mơi trường, hóa chất nuôi cấy vi khuẩn M hyopneumoniae - Kit chiết tách DNA, enzyme hóa chất, sinh phẩm khác cho phản ứng PCR - Kit ELISA IDEXX M hyo (Mỹ) kiểm tra kháng thể kháng M hyopneumoniae 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xác định đặc tính di truyền chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 - Đặc tính di truyền vi khuẩn xác định phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi Pettersson cs (1996) xây dựng phả hệ phần mềm BioEdit DNASTAR (bảng 1) - Xác định gen mã hóa yếu tố độc lực M hyopneumoniae p46 theo Caron cs (2000) p97 theo Adams cs (2005) Các cặp mồi phát gen p65 p36 tự thiết kế sử dụng phần mềm Primer-BLAST NCBI (bảng 1) Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 1,5% có bổ sung ethidium bromide 2.3.2 Phương pháp xác định khả thích nghi phát triển môi trường nhân tạo chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 Chúng dùng phương pháp cấy chuyển chủng M hyopneumoniae PV3952 môi trường Friis 20 đời liên tiếp Đếm số lượng vi khuẩn đời cấy chuyển Pass 1, Pass 5, Pass 10, Pass 15 Pass 20 phương pháp xác định số CCU/ml 2.3.3 Phương pháp xác định độc lực chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 Độc lực chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 xác định theo Opriessnig cs (2004) Kristensen cs (2014) Chủng M hyopneumoniae nuôi 28 môi trường Friis để đạt số lượng 107 CCU/ ml (CCU: color changing unit) gây nhiễm cho lợn với liều x107CCU/con (5ml canh khuẩn) đường tiêm trực tiếp vào khí quản, gây nhiễm lần thứ sau 24 Lợn đối chứng (2 con) tiêm 5ml môi trường Friis/con, lặp lại sau 24 Tất lợn theo dõi đến 28 ngày sau gây nhiễm 2.3.4 Phương pháp xác định đặc tính gây miễn dịch chủng M hyopneumoniae PV3952 Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch vi khuẩn MH lợn cách gây miễn dịch cho lợn với liều vi khuẩn MH bất hoạt formalin Sử dụng liều khác để miễn dịch cho lợn 0,5 x 108 CCU/ con/ tiêm da, x 108 CCU/ con/ tiêm da, x 108 CCU/ con/ tiêm da x 108 CCU/ con/ tiêm da (sử dụng kháng nguyên pha loãng theo số 2) Mỗi liều tiêm cho lợn, nhắc lại sau 14 ngày Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch vi khuẩn MH thông qua phát kháng thể kháng MH huyết lợn lúc 14 ngày 28 ngày sau tiêm miễn dịch phản ứng ELISA, sử dụng kit IDEXX M hyo Ab Test – Mỹ Tất lợn miễn dịch đối chứng thử thách cường độc với chủng vi khuẩn MH PV3952 vào ngày thứ 28 (phương pháp thực kiểm tra độc lực vi khuẩn) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính di truyền vi khuẩn M hyopneumoniae chủng PV3952 Chúng tơi tiến hành giải trình tự đoạn gen 16s rRNA có kích thước 852 bp nằm vùng U1 (10 - 34) đến vùng U5 (924 902) rrnA rrnB operon vi khuẩn M hyopneumoniae chủng PV3952 (mã số ngân hàng gen KY575149) Kết cho thấy trình tự nucleotic gen 16s rRNA chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 tương đồng với chủng khác phân lập Việt Nam giới (hình 1) KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 CGCTAAAATA TTTAGTAGCA AATGGGTGAG TAACACGTAC CTAACCTACC TTTTGGACTG 61 GGATAACCAT TGGAAACAGT GGCTAATACC GGATATGATA AAAATTTGCA TGAATTTTTA 121 TTCAAAGGAG CCTTCAAGCT TCACCAAGAA ATGGGGGTGC GCAACATTAG TTAGTTGGTA 181 GGGTAAAAGC CTACCAAGAC GATGATGTTT AGCGGGGCCA AGAGGTTGTA CCGCCACACT 241 GGGATTGAGA TACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TAAGGAATAT TCCACAATAA 301 GCGAAAGCTT GATGGAGCGA CACAGCGTGC AGGATGAAGT CTTTCGGGAT GTAAACTGCT 361 GTTGTAAGGG AAGAAAAAAC TAGATAGGAA ATGCTCTAGT CTTGACGGTA CCTTATTAGA 421 AAGCGACGGC AAACTATGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACA TAGGTCGCAA GCGTTATCCG 481 GAATTATTGG GCGTAAAGCG TCCGTAGGTT TTTTGTTAAG TTTAAAGTTA AATGCTAAAG 541 CTCAACTTTA GTCCGCTTTA GATACTGGCA AAATAGAATT ATGAAGAGGT TAGCGGAATT 601 CCTAGTGGAG TGGTGGAATA CGTAGATATT AGGAAGAACA CCAATAGGCG AAGGCAGCTA 661 ACTGGTCATA TATTGACACT AAGGGACGAA AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC 721 TGGTAGTCCA CGCCGTAAAC GATGATCATT AGTTGGTGGC AAAAGTCACT AACACAGCTA 781 ACGCGTTAAA TGATCCGCCT GAGTAGTATG CTCGCAAGAG TGAAA./ Hình Cây phả hệ xác định mối quan hệ chủng MH PV3952 dựa vào trình tự nucleotide gen 16s rRNA Ngoài ra, kết kiểm tra gen mã hóa định kháng ngun P36, P46, P65 P97 chủng M hyopneumoniae PV3952 cho thấy, chủng vi khuẩn P36-PCR P65-PCR mang đầy đủ gen Khi điện di sản phẩm PCR agarose cho vạch có kích thước 423bp, 660bp, 503bp 318bp (hình 2) P97-PCR P46-PCR Hình Kết PCR xác định gen mã hóa kháng nguyên M hyopneumoniae PV3952 (giếng 1, 2, 8, 9, 10, 11, 17, 18: mẫu DNA chủng MH PV3952; giếng 3, 7, 12, 16: mẫu DNA đối chứng dương; giếng 4, 6, 13, 15: đối chứng âm; giếng 5, 14: thang chuẩn DNA 100bp) 29 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Vi khuẩn M hyopneumoniae có khả tổng hợp số protein định tính kháng ngun nó, P36, P46, P65 P97 đáng ý (Zhang cs., 1995, Caron cs., 2000) Sau xâm nhập vào thể lợn qua đường hô hấp, vi khuẩn M hyopneumoniae bám dính vào lớp lơng rung đường hô hấp xâm thực bề mặt lớp tế bào biểu mơ lơng rung khí quản, phế quản, tiểu phế quản (Kwon cs., 2002) Quá trình bám dính nhờ vào yếu tố độc lực carbohydrates protein P97 bề mặt tế bào vi khuẩn M hyopneumoniae (Li cs., 2009) Kháng ngun P97 protein màng, đóng vai trò quan trọng chế gây bệnh M hyopneumoniae, giúp vi khuẩn bám vào tế bào lông rung niêm mạc đường hô hấp lợn để gây bệnh Tính gây bệnh mang đặc trưng lồi M hyopneumoniae nhờ kháng nguyên P97 Kháng nguyên bám dính đặc hiệu vào niêm mạc đường hơ hấp lợn mà khơng phải niêm mạc lồi vật chủ khác (Hsu cs., 1997) Kháng nguyên P36 protein có trọng lượng phân tử 36 kDa mã hóa gen L-lactate dehydrogenase có kích thước 942 bp vi khuẩn M hyopneumoniae Đây protein có tính kháng ngun cao, có khả gây đáp ứng miễn dịch nhanh mạnh lợn nhiễm bệnh tự nhiên lợn gây nhiễm thực nghiệm P36 kháng nguyên đặc trưng có lồi M hyopneumoniae, lồi Mycoplasma khác khơng có kháng ngun Do kháng thể kháng protein P36 dùng để phát chủng M hyopneumoniae (Stipkovits et al., 1991) Kháng nguyên P46 mã hóa gen có kích thước 1260bp, kháng ngun P65 mã hóa gen có kích thước 1803bp Đây hai protein bề mặt M hyopneumoniae Những protein có tính kháng ngun cao, có khả gây đáp ứng miễn dịch sớm đặc hiệu lợn cai sữa lợn trưởng thành nhiễm cấp tính giai đoạn đầu nhiễm M hyopneumoniae (Hsu cs., 1997) 3.2 Khả thích nghi phát triển môi trường Friis chủng M hyopneumoniae PV3952 Chúng cấy chuyển chủng M hyopneumoniae PV3952 môi trường Friis 20 đời liên tiếp Lấy mẫu đời cấy chuyển Pass 1, Pass 5, Pass 10, Pass 15, Pass 20 để kiểm tra khả thích nghi phát triển vi khuẩn thơng qua giá trị CCU/ml Kết cho thấy vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 thích nghi tốt mơi trường Friis Vi khuẩn bắt đầu phát triển nhanh sau lần cấy chuyển phát triển ổn định từ đời thứ 10 trở Vi khuẩn phát triển mạnh ổn định sau ngày, số lượng đạt tối thiểu 2,84 x 108 CCU/ml (bảng 2) Bảng Kết theo dõi phát triển M hyopneumoniae PV3952 môi trường Friis Thời gian theo dõi TT Lần cấy chuyển Pass 1,39 x 10 Pass 10 ngày 14 ngày 1,60 x 10 2,87 x 10 2,55 x 104 3,62 x 106 2,10 x 107 4,84 x 107 4,90 x 107 Pass 10 7,90 x 10 2,90 x 10 2,84 x 10 2,84 x 108 Pass 15 7,74 x 106 2,90 x 108 2,90 x 108 2,82 x 108 Pass 20 5,22 x 106 2,84 x 108 2,90 x 108 2,88 x 108 30 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Hình Khả phát triển chủng MH PV3952 môi trường Friis 3.3 Kết xác định độc lực vi khuẩn M hyopneumoniae chủng PV3952 Độc lực lợn chủng M hyopneumoniae PV3952 xác định cách gây nhiễm cho lợn cai sữa (7 -10 kg) Lợn thí nghiệm lựa chọn từ trại chưa có tiền sử bệnh viêm phổi M hyopneumoniae, khơng có kháng thể kháng M hyopneumoniae Canh khuẩn M hyopneumoniae PV3952 môi trường Friis 370C/ – 10 ngày để đạt số lượng 107 CCU/ml sử dụng để gây nhiễm cho lợn với liều x107CCU/con (5ml canh khuẩn) đường tiêm trực tiếp vào khí quản, gây nhiễm lần thứ sau 24 Lợn đối chứng (2 con) tiêm 5ml môi trường Friis/con, lặp lại sau 24 Tất lợn theo dõi đến 28 ngày sau gây nhiễm Hàng ngày, theo dõi biểu lâm sàng lợn chấm điểm: hắt (0 điểm: không hắt hơi, điểm: có hắt hơi, điểm: hắt theo cơn, điểm: hắt dai dẳng, kéo dài); ho (0 điểm: không ho, điểm: có ho, ho tiếng, điểm: ho nhiều theo cơn, điểm: ho dai dẳng, kéo dài) Sau 28 ngày gây nhiễm, tiến hành mổ khám để đánh giá bệnh tích đại thể lấy mẫu xét nghiệm vi thể Điểm số đánh giá riêng lợn thí nghiệm, sau tính giá trị trung bình Kết đánh giá độc lực chủng trình bày bảng Bảng Kết đánh giá độc lực chủng M hyopneumoniae PV3952 lợn Biểu lâm sàng Lợn thí nghiệm Hắt Ho Bệnh tích đại thể (% thể tích phổi viêm) Real-time PCR Lợn thí nghiệm 1,00 1,33 26 + Lợn thí nghiệm 1,10 1,00 24 + Lợn thí nghiệm 1,30 0,96 25 + Lợn đối chứng 0,00 0,00 - Lợn đối chứng 0,00 0,00 - Như vậy, chủng M hyopneumoniae PV3952 có độc lực cao lợn Qua theo dõi 28 ngày sau gây nhiễm cho thấy, có khác biệt nhóm lợn thí nghiệm lợn đối chứng Vi khuẩn có khả gây số triệu chứng lâm sàng bệnh viêm phổi lợn ho, hắt tất lợn gây nhiễm Ngược lại, nhóm lợn đối chứng, lợn khơng thể triệu chứng bệnh viêm phổi, lợn phát triển bình thường (bảng 1) Bệnh tích đại thể lợn gây nhiễm chủng M hyopneumoniae PV3952 có biểu đặc trưng Phổi lợn 31 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 có biểu từ đỏ đến sẫm màu, nhục hóa Các tổn thương phổi xuất thùy đỉnh, thùy tim thùy (Hình A, B, C); tỷ lệ thể tích phổi viêm 24 - 26% (bảng 3) Trong phổi lợn đối chứng khơng bị tổn thương (hình 4D) B A C D Hình Bệnh tích đại thể phổi lợn gây nhiễm M hyopneumoniae PV3952 Phân tích bệnh tích vi thể cho thấy phổi lợn đối chứng có phế nang mỏng, lòng phế nang rộng sáng (hình 5F) lợn thí nghiệm, phổi sung huyết, mao quản vách phế nang dãn rộng, chứa đầy hồng cầu bắt A D B E màu đỏ rõ, lòng phế nang bị thu hẹp Viêm kẽ phổi, vùng vách ngăn tiểu thùy phổi dãn rộng tăng sinh tế bào viêm Vách phế quản nhăn nheo, lòng phế quản hẹp có chứa hồng cầu (hình 5A, B, C, D, E) C F Hình Bệnh tích đại thể phổi lợn gây nhiễm M hyopneumoniae PV3952 32 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Chúng tiến hành kiểm tra độc lực chủng vi khuẩn đời cấy chuyển Phương pháp gây nhiễm tiến hành mô tả Mỗi đời cấy chuyển chủng, gây nhiễm cho lợn Kết cho thấy, tất đời cấy chuyển, độc lực chủng vi khuẩn không thay đổi Chủng vi khuẩn tất đời cấy chuyển gây triệu chứng lâm sàng bệnh tích đặc trưng bệnh viêm phổi địa phương (bảng 4) Bảng Độc lực chủng M hyopneumoniae PV3952 sau lần cấy chuyển lợn PV3952 Lần cấy chuyển Số lợn gây nhiễm (con) Pass √ √ Pass √ √ Pass 10 √ √ Pass 15 √ √ Pass 20 √ √ Đối chứng Triệu chứng lâm sàng Có Bệnh tích đại thể Khơng Có Khơng √ 3.4 Kết xác định tính gây miễn dịch √ vi khuẩn MH lợn cách gây miễn dịch cho lợn với liều vi khuẩn MH bất hoạt formalin (pha loãng kháng nguyên theo số 2) Kết thể bảng chủng M hyopneumoniae PV3952 Đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch Bảng Kết xác định liều miễn dịch MH lợn Chủng MH Số lợn thí nghiệm (con) PV3952 Đối chứng Liều miễn dịch (CCU / con) Lần Kết ELISA Lần 0,5 x 108 0,5 x 108 Thử thách cường độc 14 ngày 28 ngày Triệu chứng Bệnh tích đại thể Bệnh tích vi thể - - Có Có Có x 10 x 10 - - Có Có Có x 108 x 108 - + Không Không Không x 108 x 108 - + Không Không Không Không tiêm Khơng tiêm - - Có Có Có 8 (-): âm tính với kháng thể kháng MH Kết bảng cho thấy, 14 ngày sau mũi tiêm miễn dịch thứ nhất, khơng có lợn dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn M hyopneumoniae liều tiêm Tuy nhiên, 14 ngày sau mũi tiêm miễn dịch thứ 2, lợn gây miễn dịch với liều x 108 x 108 CCU/ cho kết dương tính Trong với liều tiêm 0,5 x 108 CCU/ x 108 CCU/ con, chủng không gây (+): dương tính với kháng thể kháng MH đáp ứng miễn dịch sau mũi tiêm Lợn đối chứng âm tính với kháng thể kháng vi khuẩn M hyopneumoniae Như vậy, chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 vơ hoạt gây đáp ứng miễn dịch lợn thí nghiệm với liều tối thiểu x 108 CCU/con, nhắc lại sau 14 ngày Liều miễn dịch sử dụng để đánh giá tính ổn định khả gây đáp ứng miễn dịch chủng MH sở để xây dựng liều 33 KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 vacxin nghiên cứu mô tả mục 3.1 Ở đời cấy chuyển, tiêm miễn dịch cho lợn Kết cho thấy, tất lợn tiêm miễn dịch chủng vi khuẩn đời cấy chuyển khác dương tính với kháng thể kháng M hyopneumoniae (bảng 6) Ngồi ra, chúng tơi tiến hành kiểm tra khả gây đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn đời cấy chuyển Pass 1, Pass 5, Pass 10, Pass 15 Pass 20 Phương pháp tiến hành Bảng Kết đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch chủng M hyopneumoniae PV3952 sau lần cấy chuyển lợn Đời cấy chuyển Số lợn thí nghiệm (con) Kết ELISA Pass + (3/3) Pass + (3/3) Pass 10 + (3/3) Pass 15 + (3/3) Pass 20 + (3/3) Đối chứng - (2/2) (+): dương tính IV KẾT LUẬN - Trình tự nucleotid gen 16S rRNA chủng M hyopneumoniae PV3952 tương đồng với chủng M hyopneumoniae khác phân lập Việt Nam mang đầy đủ gen mã hóa yếu tố độc lực P36, P46, P65 P97 - Chủng M hyopneumoniae PV3952 có khả thích nghi, phát triển tốt mơi trường Friis ổn định đời cấy chuyển thứ - Chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 có độc lực cao ổn định cấy chuyển nhiều đời môi trường nhân tạo - Chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 có khả gây đáp ứng miễn dịch tốt ổn định lợn, dùng để làm giống sản xuất vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Văn Lãnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Trịnh Đình Thâu, Đặng Hữu Anh, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Bá Hiên 2012 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh suyễn lợn ứng dụng kỹ thuật semi-nested PCR xác định Mycoplasma hyopneumoniae Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, XIX (2): 13-20 34 Nguyễn Ngọc Nhiên, 1997 Bài giảng Hội chứng bệnh đường hô hấp Mycoplasma khởi phát, dùng cho lớp sau đại học thú y Viện Thú y quốc gia Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Ngọc Tuân, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Bạch Tuyết, 2008 Kháng thể mẹ truyền chống Mycoplasma hyopneumoniae tăng trưởng heo từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 15(1), 26-32 Võ Thành Thìn, Đặng Văn Tuấn, Lê Đình Hải 2016 Phân lập định danh vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae từ mẫu bệnh phẩm lợn Tạp chí Khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam, 8(69), 84-88 Đặng Văn Tuấn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng, Võ Thành Thìn, 2016 Khảo sát kháng thể kháng Mycoplasma hyopneumoniae lợn nuôi số tỉnh Nam Trung Tây Ngun Tạp chí khoa học cơng nghệ nông nghiệp Việt Nam (67), 44-47 Adams, C., Pitzer J & Minion, F C 2005 In vivo expression analysis of the P97 and P102 paralog families of Mycoplasma hyopneumoniae Infect Immun, 73, 7784-7 Blanchard, B., Vena, M M., Cavalier, A., KHOA HỌC KỸ THUẬT THÚ Y TẬP XXV SỐ - 2018 Lannic, J L., Gouranton, J & Cobisch, M 1992 Electron microscopic observation of the respiratory tract of SPF piglets inoculated with Mycoplasma hyopneumoniae Veterinary Microbiology, 30, 329-341 Caron, J., Ouardani, M & Dea, S 2000 Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes J Clin Microbiol, 38, 1390-6 Clark, L., Armstrong, C., Freeman, M., Scheidt, A., Sands-Freeman, L & Knox, K 1991 Investigating the transmission of Mycoplasma hyopneumoniae in a swine herd with enzootic pneumonia Veterinary medicine (USA) 10 Debey, M C & Ross, R F 1994 Ciliostasis and loss of cilia induced by Mycoplasma hyopneumoniae in porcine tracheal organ cultures Infection and Immunity, 62, 5312-5318 11 Hsu, T., Artiushin, S & Minion, F C 1997 Cloning and functional analysis of the P97 swine cilium adhesin gene of Mycoplasma hyopneumoniae J Bacteriol, 179, 1317-23 12 Maes, D., Segales, J., Meyns, T., Sibila, M., Pieters, M., & Haesebrouck, F (2008) Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs Veterinary Microbiology, 126(4), 297-309 doi: http://dx.doi.org/10.1016/j vetmic.2007.09.008 13 Jeong, J., Park, C., Choi, K., & Chae, C (2016) A new single-dose bivalent vaccine of porcine circovirus type and Mycoplasma hyopneumoniae elicits protective immunity and improves growth performance under field conditions Veterinary Microbiology, 182, 178-186 doi: http://dx.doi.org/10.1016/j vetmic.2015.11.023 14 Kristensen, C S., Vinther, J., Svensmark, B & Baekbo, P 2014 A field evaluation of t w o vaccines against Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs Acta Vet Scand, 56, 24 15 Kwon, D., Choi, C & Chae, C 2002 Chronologic Localization of Mycoplasma hyopneumoniae in Experimentally Infected Pigs Veterinary Pathology Online, 39, 584587 16 Li, Y Z., Ho, Y P., Chen, S T., Chiou, T W., Li, Z S & Shiuan, D 2009 Proteomic comparative analysis of pathogenic strain 232 and avirulent strain J of Mycoplasma hyopneumoniae Biochemistry (Mosc), 74, 215-20 17 Opriessnig, T., THacker, E L., Yu, S., Fenaux, M., Meng, X J & Halbur, P G 2004 Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type Vet Pathol, 41, 624-40 18 Pettersson, B., Leitner, T., Ronaghi, M., Bolske, G., Uhlen, M & Johansson, K E 1996 Phylogeny of the Mycoplasma mycoides cluster as determined by sequence analysis of the 16S rRNA genes from the two rRNA operons Journal of Bacteriology, 178, 4131-42 19 Simionatto, S., Marchioro, S B., Maes, D & Dellagostin, O A., 2013 Mycoplasma hyopneumoniae: from disease to vaccine development Vet Microbiol, 165, 234-42 20 Sorensen, V., Ahrens, P., Barfod, K., Feenstra, A A., Feld, N C., Friis, N F., Bille-Hansen, V., Jensen, N E & Pedersen, M W., 1997 Mycoplasma hyopneumoniae infection in pigs: Duration of the disease and evaluation of four diagnostic assays Veterinary Microbiology, 54, 23-34 21 Stipkovits, L., Nicolet, J., Haldimann, A & Frey, J 1991 Use of antibodies against the P36 protein of Mycoplasma hyopneumoniae for the identification of M hyopneumoniae strains Mol Cell Probes, 5, 451-7 22 Zhang, Q., Young, T F & Ross, R F 1995 Identification and characterization of a Mycoplasma hyopneumoniae adhesin Infection and Immunity, 63, 1013-9 Ngày nhận 10-2-2018 Ngày phản biện 23-6-2018 Ngày đăng 1-9-2018 35 ... cứu độc lực chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 lợn - Nghiên cứu khả gây đáp ứng miễn dịch chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 lợn 2.2 Nguyên liệu - Chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 phân... cường độc với chủng vi khuẩn MH PV3952 vào ngày thứ 28 (phương pháp thực kiểm tra độc lực vi khuẩn) III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính di truyền vi khuẩn M hyopneumoniae chủng PV3952 Chúng... operon vi khuẩn M hyopneumoniae chủng PV3952 (mã số ngân hàng gen KY575149) Kết cho thấy trình tự nucleotic gen 16s rRNA chủng vi khuẩn M hyopneumoniae PV3952 tương đồng với chủng khác phân lập Vi t