141006 báo cáo tổng kết 6 tháng nhuận TT

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MƠN HĨA SINH- MIỄN DỊCH V/v Kết học tập lớp tập huấn từ 3/4/2014 đến 3/10/2014 Mục Lục Thời gian, địa điểm 2 Người thực hiện, người hướng dẫn Nội dung học tập Kết học tập Kết luận kiến nghị Phụ lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Phòng thí nghiệm Phụ lục 2: Quy trình xử lý dụng cụ 12 Phụ lục 3: Cách pha loại môi trường nuôi cấy tế bào 14 Phụ lục 4: Quy trình mở giống tế bào 21 Phụ lục 5: Quy trình cất giống tế bào 26 Phụ lục 6: Quy trình trypsin tế bào 33 Phụ lục 7: Quy trình ni cấy sơ phơi lớp (Đối với phơi) Phụ lục 8: Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm 40 47 Phụ lục 9: Quy trình phân lập virus Lở mồm long móng tế bào 49 Phụ lục 10: Quy trình phân lập virus Cúm lợn tế bào Phụ lục 11: Quy trình phân lập Virus trứng 54 62 Phụ Lục 12: Quy trình nhân Virus Cúm tế bào MDCK chai Rouxs Phụ lục 13: Quy trình nhân virus Lở mồm long móng tế bào 79 Phụ lục 14: Quy trình chuẩn độ virus Cúm đĩa tế bào 96 giếng 88 69 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Thời gian, địa điểm Thời gian: 03/04/2014 đến 03/10/2014 Địa điểm: Phòng thí nghiệm mơn Hóa Sinh- Miễn dịch, Viện Thú y Người thực hiện, người hướng dẫn Người thực hiện: BSTY Trần Thị Nhuận Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Viết Không BSTY Phạm Thị Nga Nội dung học tập - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào - Phân lập virus môi trường nuôi cấy tế bào - Nhân giống virus môi trường nuôi cấy tế bào - Xử lý mẫu bệnh phẩm - Phân lập virus trứng Kết học tập 4.1 Những việc làm a Kỹ thuật nuôi cấy tế bào: Cách sử dụng máy móc phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1) Nắm vững thành thạo quy trình ni cấy tế bào: +Quy trình xử lý dụng cụ dùng nuôi cấy tế bào (Theo phụ lục 2) + Tự chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào: MEM1x, PBS- (Theo phụ lục3) + Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 4) +Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5) + Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 6) Thực hành nuôi cấy tế bào dòng: BHK21 chai T25, T75, chai Rouxs Thực hành nuôi cấy tế bào sơ phôi chai T25 (Theo phụ lục 7) Kiến tập quy trình ni cấy tế bào dòng: MDCK, MARC-145 b Xử lý mẫu bệnh phẩm(Theo phụ lục 8) 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm nghi bệnh Lở mồm long móng Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm Giám sát Cúm gia cầm Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm Cúm lợn c Phân lập Virus môi trường nuôi cấy tế bào Thực hành phân lập Virus Lở mồm long móng tế bào BHK21 chai T25 từ mẫu bệnh phẩm thực địa (Theo phụ lục 9) Kiến tập phân lập virus Cúm lợn tế bào MDCK điã 24 giếng từ mẫu swab lò mổ Vạn Phúc (Theo phụ lục 10) d Phân lập Virus trứng (Theo phụ lục 11 ) Chuẩn bị trứng, ấp trứng, soi trứng, đánh dấu buồng hơi, vị trí tiêm Xử lý mẫu Swab Tiêm trứng Theo dõi trứng Thu hoạch nước trứng Check HA e Nhân giống Virus môi trường nuôi cấy tế bào Kiến tập nhân virus Cúm Tế bào MDCK chai Rouxs.(Theo phụ lục 12) Kiến tập nhân virus Lở mồm long móng Tế bào BHK21 chai Rouxs (Theo phụ lục 13) Kiến tập chuẩn độ Virus Cúm đĩa 96 giếng tế bào MDCK (Theo phụ lục 14) f Một số việc khác Tham gia lấy mẫu thực địa Lò mổ Vạn Phúc xã Vạn Phúc huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội 4.2 Những việc chưa làm Phản ứng trung hòa tế bào chưa thực hành 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Kết luận kiến nghị Sau sáu tháng theo học, nhận thấy thân học nhiều điều: từ văn hóa giao tiếp nơi công sở, đến kỹ thuật phòng thí nghiệm, cách bố trí, xếp cơng việc, sử dụng thời gian vào công việc cách hiệu Nhân đây, cho phép gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Viết Không – người Thầy tận tình quan tâm, giúp đỡ, định hướng tạo điều kiện cho nhóm chúng tơi trau dồi kiến thức thực hành kỹ thuật phòng thí nghiệm Cũng cho phép tơi gửi lời cảm ơn tới chị Phạm Thị Nga – người trực tiếp truyền dạy cho kỹ thuật đợt tập huấn kỹ thuật xin gửi lời cảm ơn tới anh, chị mơn Hóa sinh – Miễn dịch tạo điều kiện tận tình bảo, giúp đỡ thời gian theo học môn Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2014 Người thực Trần Thị Nhuận 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Phụ lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Phòng thí nghiệm Nguyên tắc: Trước sử dụng quan sát tình trạng hoạt động máy, sau sử dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi 1.Máy hấp: Có loại máy hấp: Máy hấp chuyên hấp dụng cụ xử lý Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý Cấu tạo máy hấp: Đồng hồ thị áp suất Van áp suất Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian Bình xả nước, van xả nước Cách vệ sinh máy hấp: Sau hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp Kiểm tra van xả áp suất Đảm bảo áp suất Tắt công tắc điện Lấy dụng cụ bẩn vừa hấp Xả máy Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa bên máy Xả nước hết xà phòng Vệ sinh bên ngồi máy hấp Thay nước bình xả nằm giới hạn cho phép Thao tác sử dụng máy hấp: Kiểm tra mực nước bình xả nước, giữ mực nước cho phép 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Lắp khay, giá sắt vào nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2 cm Cho giỏ đựng đồ hấp: dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thơng thống, dụng cụ bao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất Bật cơng tắc cài đặt máy nút điều chỉnh nhiệt độ thời gian ( 1210C/30-45 phút) Ấn nút SET/ START Máy hấp hiển thị chế độ Sterile Muốn xem nhiệt độ máy hấp ấn nút CHECK HEAT Khi lấy đồ hấp khỏi máy hấp phải xả van xả áp đảm bảo áp suất mở máy hấp Tủ sấy Cách sử dụng tủ sấy: Bước 1: Trước mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào tủ sấy, tùy dụng cụ mà sấy nhiệt độ khác nhau, hầu hết dụng cụ hấp 90-1000C/2-3 Bước 3: Đóng tủ sấy, bật cơng tắc máy cài đặt thời gian nhiệt độ Cách cài đẳt thời gian: Giữ nút RAM + TIME, đèn SET màu đỏ, đồng hồ hiển thị thời gian Giữ RAM sau TIME để chỉnh giảm thời gian Giữ RAM sau TEMP để tăng thời gian Sau ấn RAM, thời gian cài đặt Cách cài đặt nhiệt độ: 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Giữ nút RAM + TEMP, đèn SET màu đỏ, đồng hồ hiển thị nhiệt độ Giữ RAM sau TIME để chỉnh giảm nhiệt độ Giữ RAM sau TEMP để tăng nhiệt độ Sau ấn RAM, nhiệt độ cài đặt Bước 4: tủ sấy hoạt động, đèn chế độ heater Chú ý: Khi mở tủ sấy phải tắt công tắc để đảm bảo an toàn cho người sử dụng cung tránh hỏng tủ sấy Trước cho đồ vào sấy phải kiểm tra nhiệt độ thời gian, để q trình hấp đảm bảo an tồn cho dụng cụ sấy khô Cân chân không Cách sử dụng: Bước 1: Cắm nguồn điện Bước 2: Cân hóa chất: Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân Sau đóng cửa, ấn TARE, để đồng hồ thị 0.000 g Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cân xác số lượng cần dùng Bước 3: Tắt cân Ấn nút OFF để tắt máy Bước 4: Vệ sinh cân: Sau cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân Lau bề mặt cân Bước 5: Rút nguồn điện Để cân trạng thái nghỉ 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Kính hiển vi soi ngược Cấu tạo: Thị kính có độ phóng đại khác Vật kính Ốc vĩ cấp Ốc vi cấp Ốc điều chỉnh ánh sáng Cách sử dụng: Bước 1: Cắm nguồn điện Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếp vào nguồn điện 220V gây hỏng máy, qua đổi điện Bước 2: Khởi động máy Bật công tắc đưa máy chế độ hoạt động Xoay ốc điều chỉnh độ sáng đèn lên tối đa Điều chỉnh độ sang đèn thông qua núm điều chỉnh nguồn sáng Bước 3: Soi kính Đặt chai ni tế bào buồng đếm tế bào lên khu vực soi Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh Sau điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh ảnh rõ nét Bước 4:Cho kính nghỉ Vặn núm điều chỉnh ánh sáng Tắt đèn Tắt cơng tắc nguồn Cho vật kính chế độ nghỉrút điện vệ sinh Kính hiển vi 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Máy Ly tâm Cấu tạo: Có Roto Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút Các nút điều chỉnh: Nút cơng tắc máy: ON, OFF Nút chế độ: HIGHT, LOW Đồng hồ thị tốc độ thời gian Nút điều chỉnh tốc độ Nút điều chỉnh thời gian Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa nguyên lý cân Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V Bước 2: Xếp mẫu vào ROTO Khi xếp mẫu phải đảm bảo mẫu cần ly tâm dạng đối xứng cân Dùng cân tiểu ly cần thiết Bước 3: Khởi động máy Đóng nắp máy ly tâm Ấn MAIN cho máy hoạt động Cài đặt vòng quay thời gian: Nếu ly tâm 2.500 vòng ấn HIGHT Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát đồng hồ thị số vòng khoảng cần ly tâm 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME thị máy, chỉnh thời gian cần ly tâm Bước 4: Đưa máy trạng thái nghỉ, Ấn tắt MAIN, rút ổ điện Cabinet Trước sử dụng cabinet: trạng thái khơng hoạt động, chìa khóa cabinet vị trí số 0, cánh cửa tủ vị trí đóng Vơ trùng cabinet 15 phút trước sử dụng: Vặn chìa khóa tủ số 2, ấn nút UV lamp Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất tiếng kêu Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vô trùng tủ 15 phút Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại cách ấn nút UV lamp chìa khóa cabinet vị trí số Cách sử dụng cabinet: Mở cánh cửa tủ cabinet Vặn chìa khóa tủ vị trí số 1, núm quạt gió tự động hoạt động (khơng cần ấn nút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN) Tủ cấy có màng lọc khí: khí qua màng lọc đèn bật xanh Chỉ làm việc đèn xanh Quá trình thao tác cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng khơng khí từ ngồi vào gây tạp nhiễm Vệ sinh cabinet sau sử dụng: Thu dọn sẽ, không để lại dụng cụ thí nghiệm cabinet Tắt quạt gió AS, vặn chìa khóa cabinet vị trí 10 Quan sát kính hiển vi soi ngược hình dạng tế bào, mức độ phát triển, tỷ lệ tế bào bám đáy Tế bào BHK21 sau nuôi cấy ngày: tỷ lệ bám đáy 100%, tế bào lớp, tế bào có dạng hình đa giác, xếp thành thảm Bước 3: Loại bỏ mơi trường ni: Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai Dùng pipet 5ml hút bỏ mơi trường Bước 4: Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết mơi trường sót lại Cách tiến hành: Thêm vào bình ni 15ml PBS- vào chai nuôi T75 Lắc ngang chai, hút bỏ PBS- Rửa tế bào lần với PBS- Bước 5: Trypsin tế bào Mục đích: tách tế bào khỏi đáy chai Cách tiến hành: Dùng pipet hút 3ml Trypsin cho vào mặt chai khơng có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để tế bào đồng pha tách Quan sát tế bào sau trypsin kính hiển vi tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời tiến hành dừng trypsin Thời gian trypsin tế bào BHK21 :5-10 phút Bước 6: Trung hòa trypsin Mục đích: Dừng q trình trypsin Cách tiến hành: Vỗ mạnh chai đập chai nuôi để tế bào tách hồn tồn (tránh làm mơi trường bắn lên thành bình) Dùng pipet hút 7ml mơi trường MEM10% cho vào chai T75 để trung hòa trypsin Dùng pipet đảo môi trường, tưới lên mặt tế bào bám đáy, lắc nhiều lần để bong hết tế bào bám dính đáy chai Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm Bước 7: Ly tâm đánh tan cặn Mục đích: thu cặn tế bào Cách tiến hành: Cho ống fancol 50 ml chứa huyễn dịch tế bào đem ly tâm 700vòng/phút 10 phút Sau ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch phía trên, giữ lại cặn tế bào Hút 20 ml môi trường MEM5% cho vào ống, dùng pipet đảo rà đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào Bước 8: Đếm tế bào Mục đích: xác định lượng tế bào có 1ml huyễn dịch Cách tiến hành: Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl mơi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha lỗng 10 lần với 100µl trypan blue Dùng pipet hút lượng huyễn dịch tế bào sau nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào Đếm sô tế bào buồng đếm: Đếm tế bào góc, góc có 16 vng nhỏ, đếm số tế bào nằm khung 16 ô vuông nhỏ Đếm tế bào riêng lẻ đám tế bào Đếm theo hình zic zắc Đếm tế bào có kích thước tương đồng Không đếm tế bào chết bắt màu xanh, đếm tế bào sống Ước lượng số tế bào 1ml: số tế bào/1ml = (số tế bào đếm 4góc/4 )x x độ pha loãng tế bào x 104 Kết quả: Số tế bào BHK21 /1ml = (66/4) x2 x 105 = 3,3 106 cell Tổng số tế bào 20 ml huyễn dịch là: 66 106 cell Mỗi chai Rouxs cho 18.106 cell để sau ngày, tỷ lệ bám đáy 100% Vậy số ml huyễn dịch tế bào cho vào chai Rouxs 18 10 : 3,3 106 = 5,5 ml Bước 10: Ra chai nuôi Mục đích: Tiếp tục ni tế bào, để tế bào nhân lên Cách tiến hành: Hơ miệng chai Rouxs lửa đèn cồn Dùng pipet điện hút 90ml MEM10% cho vào chai Rouxs Dùng pipet lấy 5,5ml huyễn dịch cho vào chai nuôi Lắc nhẹ nhàng để tế bào trải khắp mặt đáy chai ni Đậy nắp cao su (khơng đóng chặt nắp chai) giấy bạc, chuyển vào tủ ấm CO2 Bước 11: Vệ sinh cabinet sau sử dụng Thu dọn rác, Chuyển dụng cụ vừa thao tác khỏi cabinet Dùng giấy lau xịt cồn lau Cabinet Đóng cửa Cabinet, bật UV 30 phút Bước 12: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tế bào tủ ấm 370C, 5% CO2 Nhân giống virus 2.1 Nguyên vật liệu a Virus Lở mồm long móng ổn định qua lần cấy chuyển đảm bảo yêu cầu giống Virus Virus lấy từ tủ lạnh (-800C) cho vào hộp đá để nhiệt độ giảm cách từ từ, tránh gây chết virus b Tế bào BHK21 chai Rouxs bám đáy 100% sau ngày ni cấy c Mơi trường hóa chất Mơi trường PBSMEM1%FBS Số lượng 200ml 100ml d Dụng cụ hấp sấy vơ trùng Dụng cụ Type 200µl có lọc Type 1000µl có lọc e.Máy móc, thiết bị Số lượng hộp hộp Thiết bị Pipet nhựa Pipet điện Pipet 1000P Số lượng 01 01 2.2 Các bước tiến hành Bước 1: Vô trùng Cabinet 30-60 phút Bước 2: Hút bỏ môi trường Dùng pipet điện hút hết môi trường chai Rouxs Trước hút lắc nhẹ để loại bỏ tế bào chết Bước 3: Rửa tế bào Mục đích: Loại bỏ tế bào chết, huyết thanh, sản phẩm trình trao đổi chất Thực hiện: Cho vào chai 20-25 ml PBS-, lắc nhẹ hút bỏ Bước 4: Gây nhiễm Virus Mục đích: Nhân virus tế bào Thực hiện: Virus lấy từ hộp đá, đơng tan pha lỗng 100ml MEM1x Cho vào chai Rouxs 10 – 15 ml huyễn dịch virus pha loãng Pha loãng virus phụ thuộc vào giống Ủ tủ ấm 370C, 5% CO2 Bước 5: Bổ sung môi trường Mục đích: Để tế bào trì thời gian định để virus nhân lên Thực hiện: Bổ sung vào chai rouxs 70ml MEM1% Bước 6: Theo dõi tế bào sau gây nhiễm ngày Để tủ ấm 370C, 5% CO2 Sau ngày Thu hoạch Virus 3.1 Nguyên vật liệu a Các chai rouxs CPE 4+: tế bào co tròn riêng rẽ, lên trên, vài tế bào bám đáy b.Dụng cụ hấp sấy vô trùng Dụng cụ Chai schoot lít Fancol 50ml Type 200µl Số lượng 01 10 01 c Máy móc, thiết bị Thiết bị Pipet nhựa đầu lọc Pipet điện cabinet Pipet 200µl Cloramin1% Số lượng 01 01 01 xô 3.2 Các bước thực Bước 1: Vô trùng Cabinet 60 phút Bước 2: Làm bong hết tế bào bám đáy Vỗ bên hông chai, lắc ngang chai để tế bào bám đáy bong hết để thu hết lượng virus Bước 3: Thu huyễn dịch virus Dùng pipet điện hút huyễn dịch virus chai Rouxs cho vào ông fancol 50ml vô trùng Trước hút nên tráng lại mặt chai để loại bỏ hết tế bào bám mặt chai ni Bước 4: Ly tâm thu dịch Ly tâm tốc độ 3000-4000 vòng/ phút 10 phút Hút dịch trên, cho vào chai schoot lít Bảo quản (-300C) Bước 5: Vệ sinh Cabinet sau sử dụng Chai Rouxs, đồ bẩn đêm hấp 1210C 20 phút Ống Fancol ngâm vào Cloramin Vệ sinh Cabinet cloramin, sau lau cồn, bật đèn tím vô trùng 30 phút Phụ lục 14: Quy trình chuẩn độ virus Cúm đĩa tế bào 96 giếng Trypsin tế bào MDCK đĩa 96 giếng 1.1.Nguyên vật liệu: a.Tế bào: Tế bào MDCK nuôi cấy ngày 140508, P15 Tế bào phát triển, tỉ lệ bám đáy 95 - 100% b Mơi trường, hóa chất, sinh phẩm: MEM1x: Thành phần: NaHCO3……………… 2,2g MEM bột…… 9,53g Gentamycin…………… 50µg HCl 1N …………………6ml Nước cất vơ trùng vừa đủ lít MEM 10% Thành phần: MEM1x……………….100ml FBS…………………….10ml PBS: Thành phần: PBS bột ………………… 9,55 gam Nước cất vơ trùng vừa đủ …….1 lít Trypsin – EDTA 10ml trypsin EDTA / ống ly tâm 15ml c Dụng cụ an toàn sinh học Mũ, quần áo, trang, găng tay Chai xịt cồn 700 d.Dụng cụ hấp, sấy: STT Vật liệu Số lượng Cốc đựng thủy tinh 01 Ống ly tâm 15 01 Chai nuôi tế bào T25 01 Khay đựng dụng cụ 01 Hộp type 5ml 01 Hộp type 200µl 01 Hộp giấy lau 01 e.Máy móc, thiết bị STT Vật liệu Số lượng Pipet 5ml 01 Pipet 100- 1000µl 01 Cabinet 01 Máy ly tâm 01 Tủ ấm CO2 01 Tủ lạnh 40C 01 Tủ lạnh -200C 01 Buồng đếm tế bào 01 Kính hiển vi soi ngược 01 4.2.Các bước thực Bước 1: Chuẩn bị Cabinet đưa mơi trường nhiệt độ phòng Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet 30-45 phút Chuyển môi trường nhiệt độ phòng Bước 2: Loại bỏ mơi trường ni: Mục đích: loại bỏ tế bào chết Cách tiến hành: Lắc nhẹ chai nuôi Dùng pipet 5ml hút bỏ mơi trường Bước 3: Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết mơi trường sót lại Cách tiến hành: Thêm vào bình ni 5ml PBS- vào chai nuôi T25 Rửa tế bào lần với PBS- Bước 4: Trypsin tế bào Mục đích: tách tế bào khỏi đáy bình Cách tiến hành: Dùng pipet hút 1ml Trypsin cho vào mặt chai khơng có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để tế bào đồng pha tách Quan sát tế bào sau trypsin kính hiển vi tế bào bắt đầu co tròn lại, tách rời tiến hành dừng trypsin Bước 5: Trung hòa trypsin Mục đích: Dừng q trình trypsin Cách tiến hành: Vỗ mạnh chai đập chai ni để tế bào tách hồn tồn (tránh làm mơi trường bắn lên thành bình) Dùng pipet hút 3ml môi trường MEM10% cho vào chai nuôi để trung hòa trypsin Dùng pipet đảo mơi trường, tưới lên mặt tế bào bám đáy, lắc nhiều lần để bong hết tế bào bám dính đáy chai Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 15ml Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm Bước 6: Ly tâm đánh tan cặn Mục đích: thu cặn tế bào Cách tiến hành: Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700vòng/phút 10 phút Dùng pipet hút hết dung dịch phía trên, giữ lại cặn tế bào Hút 4ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo rà đáy ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào Bước 7: Đếm tế bào Mục đích: xác định lượng tế bào có 1ml huyễn dịch Cách tiến hành: Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10% : Hút 900µl mơi trường MEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha lỗng 10 lần với 100µl trypan blue Dùng pipet hút lượng huyễn dịch tế bào sau nhuộm nhỏ từ từ vào buồng đếm tế bào Đếm sô tế bào buồng đếm: Đếm tế bào góc, góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm khung 16 ô vuông nhỏ Đếm tế bào riêng lẻ đám tế bào Đếm theo hình zic zắc Đếm tế bào có kích thước tương đồng Không đếm tế bào chết bắt màu xanh, đếm tế bào sống Ước lượng số tế bào 1ml: số tế bào/1ml = (số tế bào đếm 4góc/4 )x x độ pha lỗng tế bào x 104 Ra đĩa 96 giếng với mật độ 106 cell/đĩa Bước 10: Ra đĩa ni Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên Cách tiến hành: Ra đĩa với mật độ 106cell/đĩa Đổ huyễn dịch tế bào pha loãng máng Dùng pipet đa kênh đảo trước cho vào giếng Dùng pipet đa kênh hút huyễn dịch tế bào pha lỗng MEM10% cho vào giếng 100µl Quan sát kính hiển vi soi ngược sau đĩa Bước 11: Theo dõi phát triển tế bào Nuôi tế bào tủ ấm 300C, 5% CO2 Bước 12: Vệ sinh Cabinet sau sử dụng 2.Gây nhiễm Virus cúm 2.1 Nguyên vật liệu a Đĩa 96 giếng nuôi cấy tế bào MDCK sau ngày tỷ lệ bám đáy 100%, tế bào mọc lớp, đẹp b Mơi trường, hóa chất MEM1x làm ấm nhiệt độ phòng c Dụng cụ hấp sấy Dụng cụ Type 200µl có lọc Type 1000µl có lọc Máng có nắp Số lượng hộp hộp 01 d Máy móc Máy móc Pipet 200µl Pipet 1000µl Pipet đa kênh Máy Vortex Số lượng 01 01 01 01 5.2.2 Các bước thực Bước 1: Pha loãng Virus theo hệ số 10 -Virus bảo quản tủ (-800C) mang cho vào hộp đá, không đông tan nhiều lần làm giảm hiệu giá Virus - Có cách pha loãng Virus Cách 1: pha loãng đĩa Cách : pha loãng ống (eppendorf, ống tube…) Chuẩn bị ống để pha loãng hấp sấy vơ trùng Dùng đầu type 1000µl có lọc cho vào ống 900µl mơi trường MEM1x Vortex tube đựng Virus ban đầu Hút 100µl Virus từ tube cho vào ống số Đảo pipet từ 5-10 lần để lấy hết lượng virus Sau cho lên Vortex Tiếp tục dùng pipet đảo vài lần Cuối hút 100µl huyễn dịch Virus pha loãng 10-1 từ ống sang ống thứ Cũng tiến hành làm ống 1, ta Virus pha loãng nồng độ 10 -2 Cứ làm đến nồng độ muốn pha loãng cuối Bước 2: Rửa tế bào Mục đích: Loại bỏ tế bào chết, huyết thanh, sản phẩm trình trao đổi chất Thực hiện: Đổ môi trường nuôi cấy giếng, đổ dứt khoát tránh làm vương vãi mơi trường Có thể dùng kim hút chân khơng vơ trùng để hút bỏ môi trường Dùng pipet đa kênh cho vào giếng 200µl MEM1x Rửa 1-2 lần MEM1x đầu type không chạm xuống đáy giếng, cho môi trường vào thành giếng, nhả nhẹ nhàng để không làm ảnh hưởng tới tế bào Bước 3: Gây nhiễm virus Loại bỏ môi trường MEM1x để rửa tế bào giếng Cho 100µl mơi trường MEM1x vào giếng đối chứng tế bào Cho 100µl Virus pha lỗng vào giếng Ở nồng độ pha loãng gây nhiễm cho giếng Cho Virus pha loãng nồng độ thấp đến nồng độ cao Ủ đĩa tế bào gây nhiễm virus tủ ấm 370C Bước 4: Bổ sung môi trường MEM1x Dùng pipet đa kênh cho thêm vào giếng 100µl mơi trường MEM1x Bước 5: Quan sát tế bào sau gây nhiễm kính hiển vi Mục đích: xem tế bào có bị khơ, bị phản ứng hay khơng Bước 6: Nuôi tủ ấm 370C, 5% CO2 Theo dõi ngày Chuẩn độ hiệu giá Virus 3.1 Mục đích: Xác định hiệu giá virus vào bệnh tích tế bào 3.2 Đọc kết CPE Bệnh tích tế bào (CPE): tế bào co tròn lên Theo dõi tế bào sau gây nhiễm virus ngày Đánh giá : (++): tế bào chết 0-50% (+++): Tế bào chết 50-70% (++++): Tế bào chết 70-100% (+/-) : nghi ngờ, có đám nhỏ tế bào bị phá hủy, co tròn lên LogTCID50 = (X0 + d/2) – d x (≤ ri/n) Trong đó: X0 Log bậc pha loãng virus cao d log bậc pha lỗng ri số giếng tế bào âm tính bậc pha loãng n số giếng tế bào gây nhiễm bậc pha loãng ... 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Nuôi tế bào 370C, 5%CO2 Hàng ngày theo dõi tế bào kính hiển vi soi ngược 25 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận. .. 1N ……….6ml 16 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT c Vật liệu hấp vô trùng: STT Vật liệu Số lượng Giấy lau 01 Máng cân 01 Cục khuấy từ 01 Thìa cân 01 Chai Schott lít... màng lọc Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS, 20% DMSO: Lấy ống fancol 50ml vô trùng 26 141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT Dùng pipet hút 3 ,6 ml MEM10% Thay đầu