Đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng tại một số tỉnh miền bắc giai đoạn 2005 2009

Đặc điểm dịch tễ học bệnh lở mồm long móng tại một số tỉnh miền bắc giai đoạn 2005 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

PHẠM THỊ LAN HƯƠNG

ðẶC ðIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC GIAI ðOẠN 2005-2009

Chuyên ngành: Thú y

Mã số : 60.62.50

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập và hồn thành luận văn tơi đã nhận

được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Cho phép

tơi được bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới:

- TS Tơ Long Thành – Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung Ương

- PGS TS Lê Thị Ngọc Diệp – Giảng viên bộ mơn Nội – Chẩn- Dược-

ðộc chất Khoa Thú y Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

Nhân đây tơi cũng xin gửi lời cảm ơn tới những người thân và bạn bè

đã giúp đỡ tơi trong thời gian thực hiện đề tài này

Hà Nội, ngày 8 tháng 12 năm 2009

Học viên

Phạm Thị Lan Hương

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan toàn bộ kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực cũng như chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ bất kỳ một học

vị nào Các số liệu, thông tin trích dẫn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2009

Tác giả

Phạm Thị Lan Hương

6 Bảng 4.6 Kết quả phát hiện kháng nguyên, định type virus LMLM

ở trâu, bị, lợn tại một số tỉnh miền Bắc giai đoạn 2005-2009

55

7 Bảng 4.7 Kết quả chẩn đốn huyết thanh của trâu bị bằng phương

pháp 3ABC- ELISA bằng bộ CHECKIT FMD- 3ABC-BO-OV

56

8 Bảng 4.8 Kết quả chẩn đốn huyết thanh của lợn bằng phương

pháp 3ABC- ELISA bằng bộ CHECKIT FMD- 3ABC-BO-PO

57

9 Bảng 4.9 Tình hình sử dụng vacxin vơ hoạt nhũ dầu nhị giá

O-Asia1 trong năm 2008 tại một số tỉnh miền Bắc

59

10 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trong huyết thanh

của trâu bị sau khi tiêm vacxin vơ hoạt nhũ dầu nhị giá type O-

Asia1 tại 4 tỉnh miền Bắc, bằng bộ KIT LPB-ELISA của

Pirbright (Anh)

61

11 Bảng 4.11 Diễn biến dịch LMLM ở trâu, bò và lợn tại tỉnh Thái

16 Bảng 4.16 Tỷ lệ tử vong bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn tại tỉnh

Thái Bình giai ñoạn 2005-2009

71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

OIE : Office International des Epizooties

RT-PCR : Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ðẦU………1

1.1 ðặt vấn ñề……….1

1.2 Mục tiêu ñề tài……… 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……… 2

1.4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu………2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI……… 3

2.1 Lịch sử bệnh LMLM………3

2.1.1 Tên gọi……… 3

2.1.2 Khái niệm bệnh LMLM………3

2.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới……… 3

2.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam……… 5

2.2 Các ñặc tính sinh học của virus………6

2.2.1 Hình thái, cấu trúc……….6

2.2.2 Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus………8

2.2.3 ðặc tính nuôi cấy……….12

2.2.4 Sức ñề kháng và sự tồn tại của virus……… 13

2.2.5 ðộc lực của virus……….14

2.2.6 Phân loại virus……….15

2.3 ðặc ñiểm dịch tễ học bệnh LMLM………16

2.3.1 Loài vật mắc bệnh……… 16

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và sự lây lan……… 16

2.3.3 ðường xâm nhập của virus……… 17

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh……….18

2.4 Các biểu hiện đặc trưng của bệnh LMLM……….18

2.4.1 Triệu chứng lâm sàng……… 18

2.4.2 Bệnh tích……….19

2.5 Các phương pháp chẩn đốn bệnh LMLM……….20

2.5.1 Chẩn đốn lâm sàng………20

2.5.2 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm……….21

2.5.2.1 Chẩn đốn virus học……….21

2.5.2.2 Chẩn đốn bằng phản ứng kết hợp bổ thể………21

2.5.2.3 Chẩn đốn bằng các phản ứng trung hịa virus………22

2.5.2.4 Chẩn đốn bằng phản ứng ELISA………22

2.5.2.5 Chẩn đốn bằng kỹ thuật RT-PCR……… 28

2.6 Vacxin phịng bệnh……….28

2.6.1 Vacxxin vơ hoạt formol keo phèn……… 29

2.6.2 Vacxin vơ hoạt nuơi cấy trên mơi trường tế bào……….29

2.6.3 Vacxin nhược độc………29

2.6.4 Vacxin được sản xuất theo cơng nghệ gen……… 30

2.6.5 Những điều cần chú ý khi sử dụng vacxin……… 30

PHẦN III NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….31

3.1 Nội dung nghiên cứu……… 31

3.2 Nguyên liệu………31

3.2.1 Bệnh phẩm……… 31

3.2.2 Hóa chất……… 31

3.2.3 Bộ CHEKIT FMD – 3ABC – BO – OV và bộ CHEKIT FMD – 3ABC – PO của Bommeli Diagnostics (Thuỵ Sĩ) ……… 31

3.2.4 Bộ KIT LPB – ELISA của Pirbright (Anh) ñể phát hiện kháng thể LMLM trong huyết thanh trâu bò ñã tiêm phòng vacxin 3.3 Phương pháp nghiên cứu………32

3.3.1 Phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học phân tích………32

3.3.2 ðịnh lượng các chỉ tiêu dịch tễ……… 32

3.3.2.1 Hệ số năm dịch (HSND)……… 33

3.3.2.2 Tỷ lệ hiện mắc (TLHM)……… 33

3.3.2.3 Tỷ lệ mới mắc……… 33

3.3.2.4 Tỷ lệ tử vong………33

3.3.2.5 Nguy cơ tương ñối………34

3.3.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản……… 34

3.3.4 Phương pháp 3ABC – ELISA……….35

3.3.5 Phương pháp Liquid Phase Blocking ELISA (LPB – ELISA)…… 39

3.4 Xử lý số liệu……… 43

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình chăn nuôi gia súc tại một số tỉnh miền Bắc trong những năm gần ñây……… 44

4.1.1 Tình hình chăn nuôi gia súc tại Hà Nôi……… 44

4.1.2 Tình hình chăn nuôi gia súc tại Thái Bình……… 47

4.1.3 Tình hình chăn nuôi gia súc tại Sơn La……… 49

4.1.4 Tình hình chăn nuôi gia súc tại Lạng SơnẦẦẦ 50

4.2 Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM ở Việt Nam từ năm 2005 ựến 2009 (tắnh ựến tháng 6/2009)ẦẦẦ52

4.3 Kết quả chẩn ựoán, ựịnh typ virus LMLMẦẦẦ.55

4.3.1 Phát hiện kháng nguyên, ựịnh typ virut LMLMẦẦẦ 55

4.3.2 Phát hiện kháng thể virus LMLM do nhiễm tự nhiên trong huyết thanh của trâu, bòẦẦẦ56

4.3.3 Phát hiện kháng thể virus LMLM do nhiễm tự nhiên trong huyết thanh của lợnẦẦẦ 57

4.4 đánh giá hiệu quả của công tác tiêm phòng bệnh LMLMẦẦẦ.58

4.4.1 Tình hình tiêm phòng vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá O-Asia1 cho ựàn gia súc một số tỉnh miền Bắc trong năm 2008ẦẦẦ 58

4.4.2 Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của trâu bò sau khi tiêm vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá O-Asia1ẦẦẦ60

4.5 Xác ựịnh trình tự gen của các chủng virut LMLM trong những năm gần ựâyẦẦẦ.62

4.6 Một số ựặc ựiểm dịch tế bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn trên ựịa bàn Thái Bình từ năm 2005-2009ẦẦẦ.64

4.6.1 Diễn biến dịchẦẦẦ.64

4.6.2 Hình thái, mức ựộ năm dịchẦẦẦ67

4.6.2.1 Trên trâu bòẦẦẦ 67

4.6.2.2 Trên lợnẦẦẦ68

4.6.3 Tỷ lệ hiện mắcẦẦẦ.69

4.6.3.1 Trên trâu bò……… 69

4.6.3.2 Trên lợn………69

4.6.4 Tỷ lệ tử vong……… 70

4.7 Các giải pháp phòng chống………71

4.7.1 Các giải pháp hành chính………71

4.7.2 Các giải pháp về chuyên môn……….72

4.6.3 Các giải pháp về kỹ thuật………73

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ……….76

5.1 Kết luận……… 76

5.2 ðề nghị……… 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 78

Tiếng Việt……… 78

Tiếng nước ngoài……… 79

PHẦN I MỞ ðẦU

1.1 ðẶT VẤN ðỀ

Bệnh Lở mồm Long móng là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, do virus gây ra và gây thiệt hại kinh tế lớn ñối với ñộng vật có móng guốc chẵn như trâu, bò, dê, cừu, hươu…Tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp bệnh này ở

vị trí số 1 trong bảng A (bảng các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của ñộng vật) Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa ñộng vật mắc bệnh và ñộng vật cảm thụ mà còn gián tiếp qua nhiều ñường kể cả ñường không khí Vì vậy, bệnh dễ phát thành ñại dịch gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng ñến kinh tế

Bệnh có ñặc trưng gây ra các mụn nước và ñể lại những nốt loét trên niêm mạc miệng, mũi, chân, vú… Nó cũng có thể làm thoái hoá cơ tim Mặc

dù tỷ lệ chết ở gia súc trưởng thành không cao, nhưng việc phòng bệnh là rất quan trọng ñối với tất cả các nước trên thế giới vì bệnh có tốc ñộ lây lan nhanh

và mạnh Ngoài ra, còn làm giảm sản lượng thịt, sữa và các sản phẩm khác

Virus gây bệnh LMLM thuộc họ Picronaviridae, giống Apthovirus (Nguyễn Tấn Dũng, 2000) [4], có 7 serotype là O, A, C, Asia1, SAT 1, SAT

2, SAT 3 Trong một serotype có các dưới type Người ta cho rằng có 7 bệnh LMLM vì giữa 7serotype nói trên không có miễn dịch chéo mặc dù triệu chứng lâm sàng hoàn toàn giống nhau Chính vì vậy, chương trình phòng chống bệnh bằng vacxin gặp nhiều khó khăn do sự thay ñổi cấu trúc kháng nguyên, nhiều khi ổ dịch ñã tiêm phòng vacxin vẫn mắc bệnh

Việt Nam ñang là nước ñang phát triển mạnh về mọi mặt, trong ñó việc giao lưu buôn bán ñộng vật và sản phẩm ñộng vật với các nước trên thế

giới ngày càng mở rộng, kéo theo ựó là tình hình dịch bệnh ngày càng mạnh, trong ựó bệnh LMLM gây thiệt hại kinh tế rất lớn

Việc khảo sát tình hình dịch tễ bệnh LMLM và phát hiện sớm bệnh bằng các phương pháp chẩn ựoán trong phòng thắ nghiệm ựã và ựang là những vấn ựề cấp bách góp phần vào việc khống chế và ựi ựến thanh toán bệnh LMLM ở gia súc

Xuất phát từ vấn ựề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài:

Ộ đặc ựiểm dịch tễ học bệnh Lở mồm Long móng tại một số tỉnh miền Bắc giai ựoạn 2005-2009Ợ

1.2 MỤC TIÊU đỀ TÀI

- Khảo sát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam từ năm 2005-2009

- đánh giá hiệu quả công tác tiêm phòng bệnh LMLM tại một số tỉnh miền Bắc

- Xác ựịnh trình tự gen của các chủng virut LMLM trong những năm gần ựây

- Khảo sát tình hình dịch tễ bệnh LMLM ở tỉnh Thái Bình

- đề xuất các giải pháp phòng chống bệnh LMLM

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI

- Xác ựịnh tình hình dịch tễ và ựịnh type virut gây bệnh LMLM ở gia

súc tại một số tỉnh miền Bắc ựể từ ựó lựa chọn vacxin cho phù hợp

- Xác ựịnh trình tự gen của các chủng virut LMLM tại Việt Nam ựể từ

ựó có biện pháp phòng chống bệnh lây lan

1.4 đỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Trâu, bò, lợn ở mọi lứa tuổi trên ựịa bàn một số tỉnh miền Bắc

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI

2.1 LỊCH SỬ BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG

2.1.1 Tên gọi: có nhiều tên gọi theo các tiếng khác nhau như

- Foot and Mouth Disease (FMD)

- Aphetae Epizooticae (tên Latinh)

- Feivre Aphteuse (tên tiếng Pháp)

- Fiebre Aftosa (tên tiếng Tây Ban Nha)

- Hoof and mouth Disease

2.1.2 Khái niệm bệnh LMLM

Bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm của ñộng vật móng guốc chẽ ñôi chẵn như : trâu, bò, lợn, dê, cừu, do một loại virus hướng thượng bì gây ra Bệnh có ñặc ñiểm ñặc trưng là sốt và hình thành mụn nước ở niêm mạc miệng, vành móng, kẽ móng chân và vú của gia súc cảm thụ [9] Có 3 chủng virus chính gây bệnh LMLM là O, A, C Ba chủng SAT 1, SAT 2, SAT3 ñược phân lập ở Châu Phi và chủng Asia1 ñược phân lập ở Châu Á

2.1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới

Bệnh LMLM ñã xảy ra ở nhiều châu lục trên thế giới, ở nhiều nước thuộc châu Á, Châu Phi, châu Mỹ La Tinh và Châu Âu Những mô tả về một

ổ dịch giống như dịch bệnh LMLM ñược Heironymus Fractorius, một tu sĩ người Italia ñưa ra vào năm 1514 Sau ñó, năm 1897, Loeffler và Frosch ñã

xác định được bệnh là do virus gây ra Tuy nhiên mãi đến năm 1920 bệnh LMLM mới được nghiên cứu một cách chi tiết (Andersen, 1980) [15]

Năm 1922, hai nhà khoa học người Pháp Valle và Caree lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus LMLM ở bị gọi là type A và type O (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [9]

Năm 1926, hai nhà khoa học ðức là Waldman và Traut wein đã khẳng định lại kết quả của hai nhà khoa học Pháp và phát hiện thêm một type virus LMLM gây bệnh nữa là type C

Và trong năm 1926, các nhà khoa học Pháp đã xử lý virus bằng formaldehyd nhưng khơng thành cơng Sau đĩ Rimsovski (Nga) đã kết hợp hấp thụ virus bằng hidroxit nhơm, vơ hoạt virus bằng formaldehyd và nhiệt

độ để tạo vacxin và cho kết quả tốt [12]

Vài năm sau, 3 type khác được phát hiện ở miền Nam Châu Phi và được đặt tên là SAT1, SAT2, SAT3, sau đĩ các phịng thí nghiệm Anh đã thơng báo phân lập đươc type thứ 7 và đặt tên là Asia1 [13]

Năm 1947 - 1951, Frenkel và cộng sự đã đưa ra phương pháp nuơi cấy virus LLMLM trên tế bào, phương pháp này đã được hồn thiện và dùng trong việc sản xuất vacxin hiện nay [12]

Năm 1952, Brooksky (Anh) đã nghiên cứu hồn thiện phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) và cho rằng cĩ thể sử dụng phản ứng này để chẩn đốn phân biệt các type virus LMLM với nhau Một số phản ứng huyết thanh học khác như KHBT gián tiếp, ngăn trở ngưng kết hồng cầuvv, cũng được sử dụng để chẩn đốn và định type virus LMLM [13]

Năm 1963, Brown và cộng sự thơng báo rằng vacxin chế vơ hoạt bằng acetylthylencimin cĩ hiệu quả tương tự vacxin formalin [12]

Sau chiến tranh thế giới lần thứ II, bệnh LMLM ựã xảy ra ở hầu hết

các nước trên thế giới, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế Nhiều viện nghiên

cứu bệnh LMLM cũng ựược thành lập trên toàn cầu như: Viện Alfort tại Pháp, (năm 1901), viện Pirbright tại Anh, (năm 1924)ẦVào năm 1958, Pirbright trở thành Phòng thắ nghiệm chuẩn của thế giới nghiên cứu về bệnh LMLM (Trắch dẫn theo Lê Thị Kim Oanh, 2001) [7]

Theo thông báo của dịch tễ thế giới (OIE) và tổ chức Nông Lương thế giới (FAO), trong giai ựoạn 1981 Ờ 1985 bệnh LMLM xuất hiện ở hơn 80 quốc gia trên thế giới Năm 1989, dịch LMLM ựã xảy ra ở 51 nước của 4 châu lục: Á, Âu, Phi, Nam Mỹ [26]

2.1.4 Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM ở Việt Nam

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [9] ở Việt Nam, bệnh LMLM ựã xuất hiện từ lâu, ổ dịch LMLM ựầu tiên ở nước ta xảy ra tại Nha Trang năm

1898, sau ựó bệnh ựược phát hiện ở nhiều tỉnh, ựặc biệt là các tỉnh miền Trung, miền Nam và các tỉnh biên giới Năm 1984, bằng phản ứng kết hợp

bổ thể Lombard ựã phát hiện bệnh có ở Nha Trang do virus type O gây lên

Năm 1997, Hoàng Mạnh Lâm [5] và cộng sự ựã tiến hành nghiên cứu một số ựặc ựiểm dịch tễ học bệnh LMLM trên trâu bò ở đắc Lắc và biện pháp phòng trị bệnh

Năm 2000, Nguyễn đăng Khải và cộng sự ựã sử dụng kỹ thuật ELISA

ựể chẩn ựoán và ựịnh type virus LMLM ở nước ta [3]

Năm 2003, Hồ đình Chúc và Ngô Thanh Long ựã sử dụng phương pháp 3ABC- ELISA ựể phát hiện kháng thể của trâu bò bị nhiễm virus LMLM, phân biệt với kháng thể do vacxin LMLM tạo nên

Năm 2004, Tô Long Thành và cộng sự ựã thiết lập ựược phương pháp

RT - PCR ựể chẩn ựoán ựịnh type virus LMLM trong bệnh phẩm thu nhập từ thực ựịa Việt Nam [15]

Năm 2004, Nguyễn Thị Nguyệt [6] đã tiến hành chẩn đốn định type virus gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật RT - PCR, phân lập virus trên mơi trường tế bào, khảo sát khả năng gây bệnh tích tế bào, liều gây nhiễm tế bào của virus LMLM

Lê Văn Phan và cộng sự năm 2004 [8] đã tách dịng và giải trình thành cơng đoạn gene mã hố cho serotype O virus LMLM phân lập tại Quảng Trị, sau khi thiết lập và sử dụng phương pháp RT - PCR để chẩn đốn và định type virus gây bệnh LMLM ở Quảng Trị

2.2 CÁC ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VIRUS

2.2.1 Hình thái, cấu trúc

Virus LMLM là một trong những loại virus nhỏ nhất, kích thước từ

20 - 30mm, hình đa diện cĩ 30 mặt đều, virus cĩ thể qua được các máy lọc Berkefeld, Chamberland và màng lọc Seizt [11]

Hình 2.1 Hình thái và cấu tạo của virus LMLM

Hình 2.1.1: Vi rút

LMLM dưới kính HV

điện tử

Hình 2.1.2: Mơ hình cấu trúc của hạt virion LMLM

Hình 2.1.3: Cấu tạo kháng nguyên

Hạt virus chứa 30% acid nucleic, ñó là một ñoạn ARN chuỗi ñơn (8,4 kb) hợp thành bởi 8000 bazơ và có hệ số sa lắng là 35S, không có tính sinh kháng thể và ñặc tính kháng nguyên nhưng có vai trò trong quá trình gây nhiễm [25] Vỏ capxit của virus có hơn 60 ñơn vị (capsome) Mỗi capsome

có 4 loại Protein cấu trúc giống nhau là VP1, VP2, VP3 và VP4 VP1, VP2

và VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt ñối xứng còn VP4 là protein ở bên trong capxit, kết dính ARN virus với mặt trong của capxit CP1 ở ngoài cùng tham gia vào việc cố ñịnh virus trên những tế bào, ñóng vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, ñồng thời là kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM

Virus LMLM thuộc loại không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng cấu tạo bởi một lớp lipit do ñó chúng có sức ñề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete)

Virus có 7 serotype khác nhau: O, A, C, SAT 1, SAT2, SAT3, Asia1, trong mỗi serotype lại chia thành nhiều subtype Hiện nay, chưa phát hiện thêm serotype nào mới nhưng những serotype của virus LMLM có chứa nhân là ARN nên chúng luôn biến ñổi và tạo nên những subtype mới

Virus LMLM thường giữ những ñặc tính của nó trong khi sinh sản Nhưng cũng có thể trong quá trình nhân lên cao ñộ trong một ổ dịch, một sự biến dị làm nảy sinh ra một biến chủng mới Một số tác giả ñã quan sát sự biến chuyển từ một type này sang một type khác (Manigơ và Lazlo thấy type

A, C biến thành type O, Demnit thấy type O biến thành type C, Malzarot thấy type O biến thành type A5) Do tính chất ña loại này mà có những con vật ñã lành bệnh rồi lại mắc bệnh sau một thời gian ngắn Người ta thấy những con bò, trâu mắc bệnh lại sau 10 ngày, có khi mắc bệnh 3 lần trong 1 tuần (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) [9]

2.2.2 Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus

Các virus thực hiện sự tổng hợp các thành phần của chúng trong tế bào ký chủ và lắp ráp thành các hạt virus mới Từ một virus ban ñầu xâm nhập vào tế bào, sau ñó có hàng trăm, hàng nghìn, hàng triệu virus mới sinh

ra, ta gọi ñó là quá trình nhân lên hay quá trình tái tạo của virus

Quá trình nhân lên bắt ñầu từ lúc một virus hấp thụ lên bề mặt tế bào cho ñến khi virus trưởng thành chui ra khỏi tế bào, thời gian thực hiện quá trình này gọi là thời gian nhân lên của virus Toàn bộ quá trình nhân lên của virus chia thành 5 giai ñoạn:

* Giai ñoạn hấp thụ lên bề mặt tế bào: Do kích thước vô cùng nhỏ

bé của các hạt virus nằm trong dung dịch bao quanh bề mặt tế bào, dung dịch này luôn chuyển ñộng khiến virus va chạm lên bề mặt tế bào Các thụ thể của tế bào có tính ñặc hiệu cao ñối với từng loại virus ñồng thời trên bề mặt của virus cũng có những thụ thể có tính ñặc hiệu ñối với tế bào vật chủ

Quá trình hấp thụ của virus vào tế bào quyết ñịnh bởi mối tương tác giữa thụ thể của virus với thụ thể của tế bào trong ñó lực ñiện ñộng ñóng vai trò chủ yếu Sự hấp thụ này chỉ xảy ra khi hai thụ thể của virus và tế bào hoàn toàn ăn khớp với nhau ðiều này giải thích tại sao mỗi loại virus chỉ có thể hấp thụ và gây nhiễm cho một tế bào nhất ñịnh

* Giai ñoạn xâm nhập của virus vào tế bào: Quá trình xâm nhập

của virus vào tế bào có những giả thiết khác nhau tuỳ theo từng loại virus Với virus ñộng vật, sau khi virus hấp thụ lên bề mặt tế bào, các tế bào tự mọc ra các chân giả bao vây lấy virus rồi khép lại và ñưa virus vào bên trong

tế bào theo kiểu amip bắt mồi hay theo cơ chế thực bào, người ta gọi hiện tượng này là ẩm bào (pinocytose) Sau khi vào tế bào, axit nucleic của virus

ựược giải phóng, người ta gọi hiện tượng này là lột vỏ hay cởi áo virus Axit nucleic ựược giải phóng lập tức bị biến mất trong thời gian khoảng vài phút tới vài giờ

* Giai ựoạn tổng hợp các thành phần của virus: Ngay sau khi virus

xâm nhập vào tế bào vật chủ, sự tổng hợp protein, AND hoặc ARN ựặc trưng của tế bào bị ựình chỉ hoàn toàn và thay vào ựó là quá trình sinh tổng hợp các thành phần của virus dưới sự chỉ huy của mật mã của virus

Virus có hai thành phần chắnh là axit nucleic và protein vỏ capxit Do vậy, phải thực hiện hai quá trình sinh tổng hợp axit nucleic ựể làm nguyên liệu của nhân virus và sinh tổng hợp protein tạo nên vỏ capxit Cơ chất ựể tổng hợp lên hai loại trên là nguyên liệu của tế bào cung cấp, còn virus chỉ ựóng vai trò ựiều khiển Giai ựoạn tổng hợp các thành phần của virus có thể chia ra các giai ựoạn phụ sau:

+ Giai ựoạn sao chép thông tin (bước sao sớm): Hệ thống thông tin di

truyền ựặc trưng ựược chứa trong axit nucleic của virus để sự sao chép thông tin di truyền ựược thành công thì các ARN thông tin phải ựược sao chép trước tiên Thông tin di truyền trong axit nucleic ựược ARN thông tin chuyển sang riboxom trong nguyên sinh chất của tế bào Trên các riboxom, những protein sớm ựược hình thành bằng sự sắp xếp thứ tự của các axit amin Protein sớm ựược tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus gồm 2 loại:

- Protein ức chế: Làm nhiệm vụ kìm hãm và ựình chỉ tất cả các quá trình sinh tổng hợp của tế bào chủ ựể tế bào chủ cung cấp cơ chất cho quá trình nhân lên của virus

- Protein hoạt hoá: là những protein có liên quan tới việc dập khuôn của virus đó là những AND polymeraza, hoạt tắnh của các men này trong

tế bào bị nhiễm virus tăng lên rõ rệt Nó có tác dụng xúc tác trong quá trình tổng hợp axit nucleic

+ Giai ñoạn tổng hợp axit nucleic của virus: Tuỳ theo loại virus chứa AND hay ARN mà quá trình tổng hợp axit nucleic xảy ra có khác nhau và tại các vị trí khác nhau trong tế bào Virus chứa AND tổng hợp trong nhân tế bào (trừ nhóm Poxvirus) Vius chứa ARN tổng hợp trong nguyên sinh chất

tế bào

- Tổng hợp AND: Dưới ảnh hưởng của virus trong tế bào xuất hiện loại men mới ñó là AND- polymeraza, men này ñược tổng hợp trên riboxom của tế bào nhờ ARN thông tin của virus

Sự tổng hợp AND ñược xúc tác nhờ men AND- polymeraza Bằng nhiều thực nghiệm, người ta cũng ñã chứng minh ñược rằng sự tổng hợp AND của virus cũng tuân theo quy luật bổ sung, có nghĩa là từ một phân tử AND mẹ thu ñược 2 phân tử AND con mà trong mỗi phân tử AND con ấy chứa một mạch cũ của mẹ Theo cơ chế này có thể giải thích dưới tác dụng của men AND- polymeraza, chuỗi AND xoắn kép của virus ñược tách làm ñôi, mỗi mạch lại tổng hợp lên một mạch mới theo quy tắc bổ sung Mạch mới tạo ra xoắn vào mạch cũ ñể tạo thành AND mới xoắn kép giống với chuỗi AND xoắn kép lúc ban ñầu của virus

- Tổng hợp ARN: Từ ARN ban ñầu, ña số các virus chứa ARN ñều thực hiện quá trình sao chép thành ARN thông tin, một số khác tự bản thân ARN vừa làm nhiệm vụ thông tin vừa tổng hợp nên AND-polymeraza Dưới xúc tác của men AND-polymeraza, ARN của virus ñược dùng làm khuôn ñể tổng hợp nên sợi mới, sợi mới này ñược gọi là sợi âm (-), còn sợi cũ là sợi dương (+) Hai sợi này xoắn lại với nhau hình thành ARN dạng tái tạo Từ

ARN dạng tái tạo này, các sợi ARN (+) ñược tạo thành, các sợi (+) mới này gọi là ARN dạng trung gian Các sợi ARN trung gian có nhiệm vụ:

- Làm nhiệm vụ thông tin ñể tổng hợp nên protein cấu trúc

- ðược sử dụng làm khuôn mẫu tổng hợp ARN mới

- Làm nguyên liệu tạo nhân virus mới

+ Giai ñoạn tổng hợp protein cấu trúc (protein mới, bước dịch muộn): là giai ñoạn phiên dịch mã của ARN thông tin Các axit amin trước khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein ñã ñược hoạt hoá nhờ hệ thống men ñặc biệt có trong nguyên sinh chất của tế bào Mỗi men có khả năng nhận biết một axit amin tương ứng riêng ðể xúc tác cho phản ứng gắn axit amin này phải nhờ tới một loại ARN khác là ARN vận chuyển ñể tạo thành phức hợp aminoaxit-ARN vận chuyển Ngoài khả năng tác dụng với một men nhất ñịnh và nhận một axit amin tương ứng, ARN vận chuyển còn

có tác dụng tương hỗ với một bộ ba axit amin của ARN thông tin mã hoá cho axit amin ñó ñể xếp ñặt nó vào vị trí tương tứng trên mạch polynucleotit ñang ñược tổng hợp Giai ñoạn này xảy ra trên riboxom của tế bào

Quá trình tổng hợp protein cấu trúc của virus thường xảy ra sau khi tổng hợp axit nucleic

* Giai ñoạn kết hợp các thành phần của virus hay giai ñoạn lắp ráp: Giai ñoạn này thường xảy ra ở gần màng tế bào, axit nucleic và protein

ñược tổng hợp ở các nơi khác nhau trong tế bào ñược dịch chuyển lại gần nhau và kết hợp với nhau hình thành virus hoàn chỉnh mới

- Với các virus dạng trần (chỉ có axit nucleic và capxit): các phân tử protein va chạm với nhau thường xuyên, nếu có những va chạm ñúng thì sẽ kết hợp chặt chẽ với nhau ñể tạo thành một vòng cung protein capxit và axit nucleic

Cùng một lúc có hàng nghìn, hàng triệu virus ñược lắp ráp theo kiểu này

- Với các virus có vỏ (có axit nucleic, capxit và vỏ ngoài) cũng lắp ráp giống như trên nhưng vỏ ngoài của virus không phải do quá trình sinh tổng hợp mà thành mà do dưới tác ñộng của virus, màng của nhân tế bào hay màng tế bào ñã có những biến ñổi ñặc trưng với virus mà khi ñi quanh virus chúng khoác luôn lớp màng này ñể tạo thành vỏ của virus

* Giai ñoạn giải phóng virus khỏi tế bào: Sau khi hình thành virus

mới, những virus mới này chui ra khỏi tế bào theo những cơ chế sau:

+ Cơ chế nổ tung:

- Dưới tác dụng của men, màng tế bào bị phá vỡ, tế bào bị tan hoàn toàn và các virus ồ ạt cùng một lúc chui ra khỏi tế bào và tiếp tục xâm nhập vào các tế bào lành

- Sau khi kết thúc sự nhân lên của virus, dưới tác ñộng của virus, màng

tế bào chịu một sức tải quá lớn nên bị phá vỡ và virus chui ra khỏi tế bào

+ Cơ chế từ từ: Virus tiết ra một số men chọc thủng một số lỗ trên màng tế bào và cứ theo những lỗ ñó virus từ từ chui ra khỏi tế bào Theo cơ chế này tế bào bị nhiễm không bị phá huỷ, các chức năng cơ bản của nó vẫn giữ vững trong một thời gian

Ngoài 2 cơ chế chủ yếu trên, một số loại virus còn có thể truyền từ tế bào bị nhiễm sang tế bào lành mà không cần chui ra môi trường bên ngoài (nhóm virus Herpes và nhóm virus ñậu) Giữa tế bào bị nhiễm và tế bào lành hình thành một cầu nối nguyên sinh chất, các hạt virus có thể chui qua cầu nối này mà không cần ra ngoài

2.2.3 ðặc tính nuôi cấy

Virus LMLM có tính hướng thượng bì, do ñó thường nuôi cấy virus trên

- Thượng bì lưỡi bò trưởng thành (tổ chức thích hợp nhất), sau nhiều lần tiếp ñời, ñộng lực của virus vẫn giữ ñược ñối với bò và ñộng vật thí nghiệm (Graves and Cunliffe, 1960, Hendeson, 1952, Korn, 1957) [11]

- Tổ chức da sống (thượng bì), như tổ chức da của thai lợn, bò, chuột con

- ðộng vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trưởng thành Nhưng khi nuôi cấy trên những ñộng vật này thì virus hay bị biến ñổi và thường mất ñặc tính gây bệnh

- Ngoài ra, theo Nguyễn Tiến Dũng (2000) [4] còn có thể nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức, tế bào lấy từ tuyến yên của bò, lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có ñộ nhạy tương ñương, trong ñó

tế bào dòng thận chuột Hamster BHK - 21 là mẫn cảm nhất, tạo ra bệnh tích

tế bào ñiển hình

2.2.4 Sức ñề kháng và sự tồn tại của virus

Virus LMLM là virus không có vỏ bọc, do ñó chúng có sức ñề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…) nhưng lại mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, axit, formol…(Nguyễn Tiến Dũng, 2000) [4]

Theo A.I.Donaldson (2000) [1], virus LMLM khá bền vững trong ñiều kiện tự nhiên Virus LMLM thích nghi nhất với pH trong khoảng 7,2 – 7,6 nhưng có thể tồn tại với pH 6,7- 9,5 nếu nhiệt ñộ giảm xuống 40C hoặc thấp hơn (Donaldson) Ở pH < 5 hay pH > 11 virus bị vô hoạt rất nhanh Vì vậy, trên thực tế không nên dùng cồn ñể làm chất khử trùng Khi virus ở trong các dịch tự nhiên ñang khô ñi như ở trong phân, nước tiểu hay rơm rạ, chất ñộn chuồng thì tính gây bệnh của virus tương ñối bền vững với tác ñộng

vô hoạt

Ở nhiệt ñộ 600C – 700C virus sẽ bị chết sau 5 - 15 phút, ñun sôi 1000C virus chết ngay Ngược lại ở nhiệt ñộ thấp như trong tủ lạnh, virus có thể ñược bảo tồn 425 ngày

- ðối với hoá chất, virus LMLM có sức ñề kháng mạnh với những

chất sát trùng thông thường: Crezon 3% sau 6 giờ virus vẫn còn ñộc lực, clorofoc 1% sau 20 ngày virus vẫn còn ñộc lực Vì thế phải dùng những chất sát trùng mạnh, xút 1% diệt virus trong 1 - 10 phút, tốt nhất là dùng nước vôi tôi 5 - 10%, formon 2% diệt trong 6 giờ [10]

Một vài ví dụ về sự tồn tại của virus trong tự nhiên:

Nước thải chuồng trại

17-210C 4-130C

thể thấy nhiều dạng bệnh khác nhau Hơn nữa, nói ñến tính kháng nguyên và tính ñộc lực của virus LMLM là 2 phạm trù hoàn toàn ñộc lập nhau, một chủng virus có cùng một kháng tính nguyên nhưng lần này hoặc nơi này thì chỉ gây bệnh cho lợn, nhưng lần khác hay nơi khác thì chỉ gây bệnh cho bò, hoặc gây bệnh cho cả hai loài ðiều này ñúng với cả 7 type kháng nguyên ñã nói ở trên

2.2.6 Phân loại virus

Theo hệ thống phân loại mới nhất do hội nghị quốc tế về virus học lần thứ 11 tại Sydney, Australia năm 1999 quy ñịnh thì virus LMLM ñược phân loại như sau:

Virus LMLM thuộc họ Picornaviridae, giống Aphthovirus Virus LMLM gồm 7 serotype là O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3

Người ta phân biệt các type, các subtype, các biến chủng và các biến chủng trội theo mức ñộ sinh miễn dịch chéo Hiện nay có trên 80 subtype ñã biết, cụ thể một số subtype như sau: type A có 32 , type O có 11, type C có

5, type SAT1 có 7, type SAT2 có 3, type SAT3 có 4 subtype, Asia1 có 3 subtype, một số trong ñó không cho miễn dịch chéo với nhau

Các subtype mới xuất hiện ngày càng nhiều và mang tính ngẫu nhiên, không theo quy luật Tuy vậy, tại một thời ñiểm cụ thể, chỉ có một subtype nhất ñịnh gây bệnh tại các khu vực mà bệnh LMLM là bệnh nội vùng [30] Tầm quan trọng của một subtype ở chỗ là một vacxin chỉ có thể sản xuất sử dụng cho một vùng do subtype cụ thể xuất hiện tại nơi ñó Người ta ñã chứng minh trong một ổ dịch phát ra, lúc ñầu do 1 chủng (type) virus hoặc dưới chủng (subtype) virus gây nên, sau ñó cũng trong ổ dịch ñó người ta lại phân lập ñược chủng virus hoặc dưới chủng virus LMLM khác ðiều này

ñược giải thích do virus LMLM rất dễ biến ñổi ñể thích nghi tồn tại và phát triển thông qua ñộng vật cảm thụ [14]

2.3 ðẶC ðIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH LMLM

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

- Vật nuôi: Tất cả các ñộng vật móng guốc chẽ ñôi bao gồm trâu bò,

dê, cừu, lợn và hưu là những ñộng vật cảm nhiễm tự nhiên với virus LMLM ðộng vật non mẫn cảm hơn với ñộng vật trưởng thành Ngựa và các ñộng vật thuộc loài một móng khác không cảm nhiễm với bệnh

- ðộng vật hoang dã: Voi, lạc ñà, lợn rừng, bò rừng, sơn dương, nhiều loại gặm nhấm và loài nhai lại hoang dã mẫn cảm với bệnh là nguồn bệnh trong thiên nhiên

- Người cũng có thể bị ảnh hưởng bởi bệnh qua việc tiếp xúc với gia súc bị bệnh nhưng tỷ lệ này là rất hiếm Triệu chứng của người mắc bệnh này bao gồm: sốt, nôn mửa

- Trong phòng thí nghiệm: Có thể gây bệnh cho bê, chuột nhắt trắng, chuột xám, thỏ, chuột lang Khía da bàn chân chuột rồi xát bệnh phẩm có chứa virus lên, sau 12-24h chỗ chà xát có nổi mụn nhỏ màu ñỏ, thuỷ thũng, ñau, sau 2-3 ngày có thể nhiễm trùng toàn thân và có nhiều mụn ở niêm mạc mồm, lưỡi, lợi

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh và sự lây lan

Ở cơ thể bệnh súc, virus có nhiều trong các bệnh tích ñặc hiệu, các mụn nước, dịch của mụn và màng bọc mụn Virus có nhiều nhất trong dịch lâm ba của những mụn sơ phát Virus có ở trong máu, nội tạng Virus tồn tại

ở trong nước dãi, nước tiểu, phân, sữa, nước mắt, nước mũi, nhiều nhất khi mụn ở miệng vỡ và có thể kéo dài ñến 11 - 13 ngày Trước khi có triệu

chứng, các chất bài tiết ñã truyền ñược bệnh nhất là khi cơn sốt cao nhất với vai trò chính là nước bọt ( trước khi có triệu chứng trong nước bọt của bò có tới 102- 103 ID50/ml cho chuột nhắt con Còn khi xuất hiện triệu chứng thì tăng lên tới 104,5- 106 ID50/ml ) Tường, nền, máng ăn, ñộn lót chuồng, rơm

cỏ, các ñồ vật dụng cụ chăn nuôi và chuồng nuôi súc vật bệnh ñều có thể chứa virus

Ở lợn, virus khi trú rất nhiều ở vùng hầu, họng Chính vì vậy mà khả năng thải virus qua ñường hô hấp ở lợn là rất lớn (lớn hơn từ 1000 ñến 3000 lần so với bò)

Từ những chất chứa trên, bệnh có thể lây lan trực tiếp do tiếp xúc giữa ñộng vật bệnh và ñộng vật cảm nhiễm Bệnh có thể lây gián tiếp qua thức

ăn, nước uống, ñồ vật dụng cụ chăn nuôi bị nhiễm trùng, quần áo tay chân người chăn nuôi

Chó, mèo, gà, chim muông không mắc bệnh nhưng có thể mang mầm bệnh từ nơi này sang nơi khác

Một yếu tố tự nhiên cũng có thể làm lây lan dịch bệnh ñó là gió Gió

có thể mang mầm bệnh ñi xa hàng trăm cây số

2.3.3 ðường xâm nhập của virus

- Trong thiên nhiên, virus xâm nhập qua ñường hô hấp, tiêu hoá, qua các vết thương Ngoài ra, ñường sinh dục là ñường xâm nhập phụ

- Trong phòng thí nghiệm, ñường tiêm nội bì có hiệu quả nhất Với bò

và lợn, người ta hay tiêm virus vào nội bì niêm mạc lưỡi, với chuột lang, tiêm vào nội bì gan bàn chân Những ñường tiêm khác như tiêm bắp thịt, dưới da, tĩnh mạch cho kết quả không chắc chắn và ñòi hỏi liều virus cao hơn

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1978) [9], virus LMLM có tính hướng thượng bì, sinh sản chủ yếu trong các tế bào thượng bì niêm mạc và da, phần lớn là ở những tế bào thượng bì non Khi virus xâm nhập vào cơ thể, nó nhân lên trước tiên ở trong lớp thượng bì của nơi xâm nhập Trong quá trình nhân lên ở ñây, virus gây huỷ hoại các tế bào thượng bì và hình thành mụn nước sơ phát Sau ñó, virus chứa trong dịch lâm ba và sẽ tiến vào máu, phủ tạng Khi virus vào máu sẽ gây sốt, cuối giai ñoạn sốt, virus nhân lên và gây

ra các mụn nước thứ phát ở nơi những tế bào thượng bì ñang phân chia mạnh như niêm mạc, xoang miệng, vành móng, kẽ móng, ñầu vú bò sữa, mõm lợn Mụn nước phát triển to dần ra, nhô lên nhưng không bao giờ sinh

mủ khi không có vi trùng kế phát

Sau khi mụn vỡ, những vết tích trên thượng bì ñược lấp bằng nhanh chóng, không ñể lại sẹo do tế bào của lớp Manpighi vẫn nguyên vẹn Mụn nước chỉ loét khi nhiễm khuẩn kế phát, vi khuẩn sinh mủ, gây hoại tử xâm nhập gây bệnh lý cục bộ ăn sâu vào trong, có khi gây bại huyết, con vật có thể chết

2.4 CÁC BIỂU HIỆN ðẶC TRƯNG CỦA BỆNH LMLM

2.4.1 Triệu chứng lâm sàng

- Ở trâu bò: Sau một thời gian nung bệnh từ 3 – 6 ngày, triệu chứng

ñầu tiên là gia súc sốt cao 40- 410 C kéo dài trong 2 ñến 3 ngày Sau ñó, nhiệt ñộ cơ thể hạ xuống, con vật hay nhai lại, tiết nhiều nước bọt, hay chép miệng, niêm mạc miệng, lợi và lưỡi hình thành mụn nước bên trong, mụn lan nhanh ra ngoài môi và trên bề mặt lưỡi, xung quanh lợi và ñặc biệt ở trên phần lợi giả của hàm trên và ñầu lưỡi ðồng thời với mụn nước ở miệng, mụn nước ở chân cũng xuất hiện, ñặc biệt là ở kẽ móng và vành móng

Nếu có sự xâm nhập của vi khuẩn kế phát vào bệnh tích sẽ làm cho vết thương nặng hơn và gây trở ngại cho việc ñiều trị Sảy thai và vô sinh là hậu quả phổ biến, sản lượng sữa giảm và thậm chí gây lên viêm vú Gia súc non mẫn cảm hơn gia súc trưởng thành, bê, nghé có tỷ lệ chết cao, có thể chết mà không có triệu chứng ñiển hình

- Ở lợn: Thời gian nung bệnh từ 2- 12 ngày, nhiều triệu trứng lâm

sàng giống như loài nhai lại ðầu tiên lợn có biểu hiện ñi lại khó khăn, khập khiễng hoặc không muốn di chuyển, hay nằm hoặc ngồi bằng khớp chân trước Con vật kém ăn hoặc bỏ ăn, có hoặc không chảy nước dãi Mụn nước nổi nên quanh mũi, sống mũi, niêm mạc miệng (thường không phổ biến), ñầu vú hay quanh bầu vú

Trên lợn, các triệu chứng lâm sàng của LMLM không thể phân biệt ñược với các bệnh có mụn nước khác như viêm miệng mụn nước, ngoại ban

có mụn nước, và các bệnh mụn nước ở lợn (Callis, P.D Kercher, 1986) [18]

2.4.2 Bệnh tích

Bệnh tích bên trong chủ yếu là hoại tử

các cơ bắp, trong ñó chủ yếu là cơ tim tạo ra

cái gọi là tim vằn hổ Khi mổ ñộng vật, chúng

ta thấy mặt ngoài của tim có các vết xuất huyết

có vệt như da hổ nên gọi là tim vằn hổ ðây là

bệnh tích có ý nghĩa quan trọng trong việc

Nếu nặng gia súc có thể bị chết Tỷ lệ chết cao thường thấy ở gia súc non Khi con vật chết do biến chứng thì thấy các bệnh tích mưng mủ, hoại

tử, nhất là ở các ngón chân, thối xương, thối gân Nếu không bị bội nhiễm

hoặc biến chứng thì dần dần gia súc hồi phục nhưng cịn để lại các di chứng

là các vết sẹo ở miệng, vú, vành mĩng

2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ðỐN BỆNH LMLM

Việc xác định chính xác bệnh LMLM là quan trọng bậc nhất ở tất cả các nước, ngay cả những nước cĩ dịch địa phương hoặc những nước, những vùng thực tế khơng cĩ bệnh Phát hiện sớm ra bệnh gĩp phần quan trọng trong việc đưa ra các biện pháp khống chế và tiêu diệt bệnh và giảm thiệt hại

do bệnh gây nên Việc xác định các serotype, subtype gây bệnh LMLM ở các vùng, các địa phương cĩ ý nghĩa quyết định trong chương trình phịng chống bệnh bằng vacxin

Theo các tác giả J.B Brooksby (1982) [17], J.I Callis và P.D.Mc Kercher (1986) [18], Dimitradis I (1991) [20], Ferris N.P và cộng sự (1988) [21], Have P (1987) [24], Kitching P (1989) [27] và nhiều tác giả khác thì việc chẩn đốn, xác định bệnh LMLM bằng các phương pháp sau:

2.5.1 Chẩn đốn lâm sàng

Việc chẩn đốn lâm sàng bệnh LMLM cĩ thể thực hiện trong trường hợp bệnh xảy ra tại khu vực đã được xác định là cĩ dịch LMLM Các triệu chứng của bệnh là sự xuất hiện các mụn nước trong khoang miệng (lưỡi, lợi), quanh mũi, vành tiếp giáp da với mĩng chân, kẽ chân và các đầu vú (đối với bị sữa) Kèm theo các triệu chứng trên là hiện tượng con vật bị què

do bị đau chân gây khĩ khăn trong khi di chuyển

ðối với lợn da trắng, cĩ thể xuất hiện các vệt đen trên mĩng chân màu trắng Thơng thường lợn mắc bệnh thường dễ bị tụt mĩng chân hơn bị Tuy nhiên, việc chẩn đốn lâm sàng thường dễ bị nhầm với các bệnh khác như: Viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở lợn, bệnh ngoại ban (exantheme),

bệnh dịch tả trâu bị, bệnh tiêu chảy do siêu trùng ở bị Mặc khác cần phải chú ý rằng khơng phải tất cả số gia súc mắc bệnh đều cĩ biểu hiện lâm sàng

rõ rệt Do vậy, cần kết hợp với số liệu dịch tễ để chẩn đốn

2.5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm

Tại những nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, triệu chứng lâm sàng chỉ cĩ tính chất định hướng trong chẩn đốn và nhất thiết phải dùng biện pháp chẩn đốn bằng xét nghiệm trong phịng thí nghiệm để khẳng định bệnh

Bệnh phẩm thích hợp để phân lập virus LMLM là chất biểu mơ và dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ Lượng tối thiểu phải từ 3-5 g

tổ chức tươi ðể phát hiện kháng thể thì bệnh phẩm là máu những con nghi mắc bệnh với lượng 3-5 ml, để máu đơng chắt lấy huyết thanh Bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ lạnh

2.5.2.1 Chẩn đốn virus học

Dùng huyễn dịch bệnh phẩm (mụn nước, biểu mơ ) nuơi cấy trên tế bào mẫn cảm (tế bào thận bê, BHK- 21 ), tiêm cho động vật thí nghiệm (chuột lang, bê vv ), tiêm nội bì lưỡi bị trưởng thành, rồi theo dõi sự biến đổi của tế bào hoặc triệu chứng, bệnh tích của động vật thí nghiệm, để xác định bên trong bệnh phẩm cĩ chứa virus LMLM khơng

2.5.2.2 Chẩn đốn bằng phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)

Phản ứng KHBT được thực hiện nhờ hệ thống dung huyết và hệ thống dung khuẩn với sự tham gia bổ thể Bởi vì, sự dung khuẩn mắt thường khơng nhìn thấy được, do vậy phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả qua quan sát bằng mắt thường

2.5.2.3.Chẩn đốn bằng các phản ứng trung hồ virus

Trong cơ thể động vật mắc bệnh, virus gây bệnh kích thích sản sinh ra

kháng thể tương ứng, kháng thể này cĩ khả nămg trung hồ chính virus kích

thích sinh ra nĩ, làm virus khơng cịn khả năng gây bệnh thí nghiệm và phá

huỷ tế bào mẫn cảm

Căn cứ vào cĩ hay khơng cĩ sự biến đổi tế bào sau khi cấy hỗn hợp

kháng nguyên – kháng thể, để xác định con vật khơng hay cĩ bị bệnh và bị

bệnh do type virus LMLM nào

Phản ứng trung hồ virus thường rất nhạy và đặc hiệu, chỉ cần 2- 3

ngày là cĩ kết quả nhưng nếu lượng huyết thanh ít, hiệu giá thấp, dương tính

giả cĩ thể xảy ra

2.5.2.4 Chẩn đốn bằng phản ứng ELISA

ðây là một phương pháp cĩ độ nhạy và độ chính xác cao (Crowther,

Abu Elzein, 1979) [19], (Hamblin và cs, 1987) [22], Have và cs, 1983) [23],

Roeder và Le Blanc Smith, 1986) [29]

a Nguyên lý:

Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym

cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào

Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng

thể gắn enzym khơng bị rửa trơi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi

cĩ màu trong quang phổ kế thì sẽ định lượng được mức độ phản ứng

b Phân loại phản ứng ELISA : được phân thành ba loại chính như sau

- Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): dùng kháng thể gắn

enzym để xác định kháng nguyên nghi cố định trên đĩa chuyên dụng

- Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): dùng kháng nguyên chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi

- Phản ứng Sandwich ELISA gồm 2 loại:

+ Phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp (direct Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể gắn emzym

+ Phản ứng Sandwich ELLISA gián tiếp (indirect Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể nghi, sau đĩ kháng thể nghi được nhận diện bằng kháng kháng thể lồi gắn enzym

c Ứng dụng phản ứng ELISA trong chẩn đốn bệnh LMLM:

Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên virus LMLM:

Phương pháp ELISA thường được sử dụng để xác định sự cĩ mặt của kháng nguyên virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm lấy từ gia súc bị nghi ngờ nhiễm virus

Kháng nguyên của virus LMLM cĩ thể xác định bằng phương pháp ELISA trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ hay dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ

Cịn mẫu được lấy từ nơi chứa ít virus hay chất lượng mẫu khơng đảm bảo thì trước khi định type virus bằng phương pháp ELISA sẽ tiến hành nuơi cấy virus trên mơi trường tế bào sau đĩ phân lập virus từ mơi trường nuơi cấy

Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM:

Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để phát hiện và giám định các serotype của virus LMLM trong huyết thanh gia súc Trong phản ứng, mỗi đĩa ELISA chỉ làm với một type virus LMLM chuẩn, để phát hiện kháng thể nghi trong huyết thanh của gia súc cần chẩn đốn

Cĩ thể sử dụng cả ba phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus LMLM Nhưng hiện nay phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp thường được sử dụng phổ biến hơn cả Bởi vì, kĩ thuật ELISA này cĩ thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thơng thường khác do cĩ tính đặc hiệu rất cao, rất nhạy lại kinh tế vì nhiều ứng dụng:

- Trong chẩn đốn phát hiện bệnh, với phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp chúng ta cĩ thể phát hiện và định type kháng nguyên virus LMLM

từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ, dịch tiết hay cĩ thể phát hiện kháng thể và giám định serotype virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm huyết thanh

- ðối với gia súc đã tiêm phịng vacxin, để đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gia súc sau tiêm phịng cũng như hiệu quả sử dụng vacxin người ta cũng sử dụng phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp để định lượng kháng thể kháng virus LMLM

Phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA)

Trong chẩn đốn huyết thanh học, phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp được sử dụng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA) Phương pháp này được nghiên cứu và đưa ra lần đầu tiên bởi Hamblin và cộng sự vào năm 1986 ðộ nhậy của phản ứng LPB - ELISA tương đương với phản ứng trung hồ virus nhưng lại khơng phải nuơi cấy tế bào trong xét nghiệm Do đĩ, đây là một phương pháp xét nghiệm hiệu quả, an tồn và ít tốn kém hơn so với phương pháp trung hồ virus rất nhiều

Kỹ thuật chẩn đốn này cho kết quả nhanh trong vịng 3 – 4 giờ, khơng phụ thuộc mơi trường mơ, tỷ lệ phần trăm dương tính giả thấp Do cĩ thể sử dụng kháng nguyên vơ hoạt nên xét nghiệm được với số lượng chủng virus nhiều hơn

Hiện nay, để thuận lợi cho việc chẩn đốn tại các phịng thí nghiệm, người ta đã sản xuất ra các bộ KIT chẩn đốn dựa trên kỹ thuật LPB - ELISA Các thành phần và nguyên liệu cho phản ứng vẫn cĩ thể thực hiện được xét nghiệm dễ dàng Cĩ hai loại bộ KIT đã được sản xuất là bộ KIT LPB - ELISA bao gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 7 serotype virus và

bộ KIT LPB - ELISA phát hiện 3 hoặc 4 serotype virus LMLM Hiện bộ KIT LPB - ELISA chẩn đốn đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4 serotype virus O, A, C và Asia1

d Ứng dụng phương pháp NSP – ELISA (Non Structural Protein ELISA)

Trong chẩn đốn phân biệt kháng thể trong huyết thanh của gia súc do

bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc

do tiêm phịng vacxin

Phương pháp NSP - ELISA dựa trên nguyên lý sau: Sau khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo thành các hạt virus mới, vừa tạo ra các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới

mà chỉ đĩng vai trị các men giúp cho quá trình nhân lên Các thành phần kết

hợp thành bản thân các hạt virus cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên

cấu trúc (SP) Các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới

cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên khơng cấu trúc (NSP)

Trong đĩ một số kháng nguyên khơng cấu trúc cĩ khả năng kích thích gia súc tạo ra kháng thể với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh gia súc (nhất là trâu bị) đã nhiễm bệnh Cịn gia súc được tiêm phịng vacxin, đặc biệt những vacxin vơ hoạt cĩ độ tinh khiết cao (đã được loại bỏ những kháng nguyên khơng cấu trúc) sẽ chỉ sản sinh kháng thể khơng đặc hiệu chống virus LMLM chứ khơng cĩ kháng thể kháng lại kháng nguyên khơng

cấu trúc Vì vậy, việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên khơng cấu trúc cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM

Phương pháp NSP – ELISA được sử dụng chẩn đốn cho nhiều loại gia súc như trâu bị, dê, cừu Kháng nguyên khơng cấu trúc xuất hiện sớm nhất sau 8 ngày nhiễm virus ở trâu bị và 10 ngày ở dê cừu Với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên khơng cấu trúc của virus LMLM chúng ta cĩ thể xác định được động vật nhiễm virus LMLM với bất

kỳ serotype nào, cả những con chưa tiêm hay đã tiêm phịng vacxin, những con khơng cĩ triệu trứng lâm sàng, thậm chí cả ngay khi ổ dịch nổ ra 1 năm

Phương pháp NSP – ELISA hồn tồn nhạy khi sử dụng chẩn đốn cho một đàn gia súc với số lượng lớn Nhiều bộ KIT chẩn đốn dựa trên kĩ thuật NSP – ELISA của các hãng khác nhau trên thế giới đã được sản xuất

và sử dụng Nhưng đến 10/2001 sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) đã chính thức cơng nhận ba bộ KIT chẩn đốn

cĩ độ chính xác và đặc hiệu cao trong chẩn đốn xác định gia súc nhiễm bệnh LMLM là:

CHEKIT- FMD - 3ABC của Bommeli Diagnostics

FMDV NSP ELISA của UBI

Ceditest FMDV - NS của Cedi Diagnostics

của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phịng vacxin

Phương pháp NSP – ELISA (Non - Structural Protein ELISA)

Những năm trước đây tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) vẫn cịn chưa cĩ hướng dẫn quy trình chính thức để phân biệt gia súc bị nhiễm virus (sau khi

đã lành bệnh) với gia súc đã tiêm phịng vacxin LMLM Các phương pháp

huyết thanh học chính thức được hướng dẫn chỉ để định lượng kháng thể kháng protein cấu trúc (Structural proteins – SP) của virus LMLM, nhưng khơng thể phân biệt kháng thể tạo ra do gia súc nhiễm bệnh LMLM hay do tiêm phịng vacxin Tìm các phương pháp huyết thanh học cĩ thể phân biệt kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM với kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc được tiêm phịng vacxin là trọng tâm nghiên cứu trong nhiều thập niên qua

Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu và tìm ra được một phương pháp phát hiện được kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM, kể cả những con vật đã được tiêm phịng vacxin ðây là phương pháp ELISA định lượng kháng thể kháng kháng nguyên khơng cấu trúc (Non-structural Proteins - NSP) của virus LMLM trong huyết thanh gia súc Phương pháp này được gọi là phương pháp NSP – ELISA

Phương pháp 3ABC – ELISA

Một trong những phương pháp chẩn đốn dựa vào việc xác định kháng nguyên khơng cấu trúc được sử dụng rộng rãi trên thế giới và đem lại hiệu quả cao là phương pháp 3ABC – ELISA Phương pháp chẩn đốn này nhằm xác định kháng nguyên khơng cấu trúc 3ABC của virus LMLM 3ABC được xác định là một trong những kháng nguyên cĩ khả năng kích thích gia súc sinh đáp ứng miễn dịch cao nhất Phương pháp 3ABC – ELISA được Bergmann cùng các cộng sự nghiên cứu, đưa ra lần đầu tiên vào năm

1993 đã thu được nhiều thành cơng khi ứng dụng rộng rãi ở Nam Mỹ

Bộ KIT thương mại được xây dựng dựa trên kĩ thuật 3ABC – ELISA được sử dụng phổ biến trong các phịng thí nghiệm này là bộ CHEKIT – FMD –

3ABC của Bommeli Diagnostics - Thuỵ Sỹ Bộ KIT này cĩ những ưu điểm:

- Cho phép chúng ta phát hiện kháng thể 3ABC ở bị và cừu bị nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào sau 10 – 14 ngày và kéo dài 1 năm với

độ chính xác tới 99,95% Vì vậy, khi kết quả dương tính ta cĩ thể kết luận trâu, bị bị nhiễm virus LMLM

- Dễ sử dụng do các thành phần phản ứng đã cĩ sẵn, đồng thời phương pháp tiến hành đơn giản

- Kiểm tra khối lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

- Mỗi lần làm xét nghiệm cĩ thể kiểm tra các mẫu của nhiều lồi (trâu, bị, cừu)

2.5.2.5 Chẩn đốn bằng kỹ thuật RT- PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng

sự phát minh ra vào năm 1985 Kỹ thuật PCR là một phương pháp tạo dịng invitro, cho phép khuếch đại một đoạn ADN đặc hiệu từ một hệ gene phức tạp

và tương đối dài, mà khơng cần đến việc tách và nhân dịng (cloning) Với những virus thuộc loại virus ARN thì phải tiến hành thêm phản ứng sao chép ngược nhờ vào men sao chép ngược RT (Reverse Transcriptase) để chuyển ARN thành ADN Sau đĩ tiến hành phương pháp PCR như các quy trình thơng

thường (Kitching, 2000) [28] Do đĩ kỹ thuật này được gọi là RT- PCR

2.6 VACXIN PHỊNG BỆNH LMLM

ðối với bệnh LMLM, do virus ngồi thực địa biến dị liên tục nên virus dùng để chế vacxin cũng phải thay đổi ðể biết virus ngồi thực địa thay đổi thể nào cần phải điều tra dịch tễ thường xuyên Kết quả điều tra dịch tễ học cĩ thể nĩi chính xác sự tương ứng của virus ngồi thực địa với virus vacxin đồng thời nĩi lên sự cần thiết phải cĩ các sản phẩm với phổ kháng nguyên rộng hơn (Tơ Long Thành, 2000) [12]

Yêu cầu quan trọng trong việc sử dụng vacxin là chúng phải đảm bảo

an tồn, dễ sử dụng, hiệu quả kinh tế cao

2.6.1.Vacxin vô hoạt formol keo phèn

Virus thuộc các type gây bệnh ñược lấy từ các vết loét ở niêm mạc miệng bò ốm ñem tiêm truyền cho bò khoẻ bằng cách tiêm vào bắp thịt, lưỡi hoặc chỗ khía trên da lưỡi Mụn nước hình thành trên lưỡi sau 24h, ñem lấy dịch lâm ba ở mụn và bảo quản lạnh Khi chế vacxin cho thêm keo phèn và

vô hoạt virus bằng formol Liều tiêm cho trâu, bò thường là 15 - 60 ml, tuỳ theo trọng lượng của gia súc Miễn dịch xuất hiện sau 8 - 20 ngày và kéo dài trong vòng 8 - 10 tháng Sử dụng vacxin này có nhược ñiểm là chỉ dùng cho gia súc không mắc bệnh, hạn chế sử dụng cho gia súc có chửa, con non Ngoài ra vacxin chế theo kiểu này nếu vô hoạt virus không tốt thì vô tình sẽ trở thành nguồn gây bệnh

2.6.2 Vacxin vô hoạt nuôi cấy trên môi trường tế bào

Vacxin vô hoạt ñược chế từ virus nuôi cấy trên tế bào biểu mô lưỡi bò hoặc các tế bào phù hợp khác như BHK - 21.Tại Việt Nam hiện ñang sử dụng các vacxin phòng bệnh cho trâu bò và lợn của hai hãng thuốc thú y có tiếng trên thế giới là Merial (Pháp) và Intervet (Hà Lan) ñược chế theo công nghệ nói trên Virus LMLM ñược nuôi cấy nhân lên trên môi trường tế bào BHK - 21 trong hệ thống dịch treo, sau ñó virus ñược vô hoạt bằng Binary Ethylênimine (BEI), cô ñặc và làm sạch kháng nguyên Bước cuối cùng là kết hợp với chất bổ trợ miễn dịch có thể là nhũ dầu kép DOE (Double Oil Emulsion), hoặc là Hydroxide nhôm và Saponin ALSA (Aluminum hydroxide & Saponin) Vacxin bổ trợ nhũ dầu kép có khả năng tạo miễn dịch lâu hơn vacxin bổ trợ saponin - hydroxid nhôm

2.6.3 Vacxin nhược ñộc

Việc thích ứng virus LMLM trên chuột chưa cai sữa, lên phôi gà con

1 ngày tuổi, hoặc tiếp ñời nhiều lần trên tế bào nuôi ñã cho ra ñời vacxin