Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh Lở mồm long móng và đánh giá hiệu quả kinh tế một số biện pháp phòng chống tại Việt Nam (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN THU THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KINH TẾ MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN THU THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KINH TẾ MỘT SỐ BIỆN PHÁP PHÒNG CHỐNG TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thu Thủy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, cố gắng thân, nhận quan tâm giúp đỡ tổ chức, quan, nhà khoa học, thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp người thân gia đình Trước tiên, xin chân thành cảm ơn Cục Thú y Tổ chức Thú y giới (OIE), cho phép tham gia triển khai sử dụng số liệu, kết dự án có liên quan Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy trách nhiệm hết lòng khoa học thầy giáo PGS.TS Nguyễn Bá Hiên TS Nguyễn Văn Cảm Nhân dịp này, xin cảm ơn giúp đỡ Ban Quản lý đào tạo Bộ môn Vi sinh vật Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập hoàn thành luận án Học viện Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Quý thầy cô, quan, nhà khoa học đồng nghiệp UBND, Sở Nông nghiệp & PTNT, Chi cục Thú y tỉnh giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình ln quan tâm, động viên giúp tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thu Thủy ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích yếu luận án x Thesis abstract xii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu bệnh LMLM 2.2 Lịch sử bệnh LMLM 2.2.1 Tình hình dịch LMLM giới 2.2.2 Tình hình bệnh LMLM Việt Nam 2.3 Vi rút gây bệnh LMLM 10 2.3.1 Hình thái, cấu trúc vi rút LMLM 10 2.3.2 Cấu trúc 10 2.3.3 Các serotype vi rút LMLM 11 2.3.4 Đặc tính ni cấy vi rút LMLM 12 2.3.5 Sức đề kháng vi rút LMLM 13 2.4 Một số đặc điểm bệnh LMLM 14 2.4.1 Loài vật mắc bệnh 14 2.4.2 Triệu chứng - bệnh tích 15 2.4.3 Cơ chế sinh bệnh 16 iii 2.4.4 Phương thức truyền lây 18 2.4.5 Đường xâm nhập 19 2.4.6 Tình trạng mang trùng 20 2.4.7 Những thiệt hại bệnh LMLM gây 21 2.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 23 2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 23 2.5.2 Chẩn đoán phân lập vi rút 23 2.5.3 Chẩn đoán huyết học 24 2.5.4 Chẩn đoán kỹ thuật RT-PCR 26 2.6 Một số phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 26 2.6.1 Nghiên cứu cắt ngang (Cross-sectional study) 26 2.6.2 Nghiên cứu tập (Cohort study) 27 2.6.3 Nghiên cứu Bệnh - Chứng (Case – Control study) 28 2.7 Các biện pháp phòng, chống bệnh LMLM 29 2.7.1 Phòng chống bệnh LMLM giới 29 2.7.2 Phòng chống bệnh LMLM khu vực Đông Nam Á 31 2.7.3 Phòng chống bệnh LMLM Việt Nam 32 Phần Nội dung, vật liệu phương pháp nghiên cứu 34 3.1 Địa điểm nghiên cứu 34 3.2 Thời gian nghiên cứu 34 3.3 Nội dung nghiên cứu 34 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học theo không gian thời gian bệnh LMLM Việt Nam, giai đoạn 2006 – 2012 34 3.3.2 Nghiên cứu mức độ phơi nhiễm mang trùng vi rút LMLM số tỉnh trọng điểm từ tháng 10-12/2012 34 3.3.3 Nghiên cứu phân tích đánh giá hiệu kinh tế số biện pháp phòng chống bệnh LMLM 34 3.4 Đối tượng vật liệu 35 3.4.1 Đối tượng 35 3.4.2 Vật liệu 35 3.5 Phương pháp nghiên cứu 36 iv 3.5.1 Phương pháp áp dụng để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ theo không gian thời gian 36 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu mức độ lưu hành vi rút LMLM số tỉnh trọng điểm từ tháng 10-12/2012 39 3.5.3 Nghiên cứu phân tích đánh giá hiệu kinh tế số biện pháp phòng chống bệnh LMLM 44 3.5.4 Tính hiệu kinh tế số biện pháp phòng chống bệnh LMLM 44 Phần Kết thảo luận 47 4.1 Đặc điểm dịch tễ học theo không gian thời gian bệnh LMLM Việt Nam, giai đoạn 2006 - 2012 47 4.1.1 Đặc điểm loài gia súc mắc bệnh LMLM 47 4.1.2 Đặc điểm loài gia súc chết bệnh LMLM 51 4.1.3 Đặc điểm thời gian ổ dịch LMLM giai đoạn 2006 – 2012 52 4.1.4 Đặc điểm không gian ổ dịch LMLM giai đoạn 2006 - 2012 57 4.2 Mức độ lưu hành vi rút lmlm số tỉnh trọng điểm từ tháng 1012/2012 80 4.2.1 Mức độ lưu hành vi rút LMLM 81 4.2.2 Xác định chủng vi rút LMLM 84 4.2.3 Xác định yếu tố nguy 88 4.3 Hiệu kinh tế số biện pháp phòng chống bệnh LMLM 92 4.3.1 Kinh phí hoạt động chương trình khống chế bệnh LMLM 92 4.3.2 Thiệt hại sản xuất bệnh LMLM Việt Nam 94 4.3.3 Chi phí tổng thể bệnh LMLM Việt Nam 97 Phần Kết luận kiến nghị 100 5.1 Kết luận 100 5.2 Kiến nghị 101 Các công trình khoa học cơng bố có liên quan đến luận án 102 Tài liệu tham khảo 103 Phụ lục 120 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BHK Baby Hamster Kidney CCU Carrying Capacity Unit CI Confidence Interval EDR Estimated Dissemination Ratio ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FMD Foot and Mouth Disease KHBT Kết hợp bổ thể LMLM Lở Mồm Long Móng LPB-ELISA Liquid Phase Blocking-ELISA LPEC Livestock Production Efficiency Calculator NN&PTNN Nông nghiệp Phát triển nông thôn OIE World Organisation for Animal Health OR Odds Ratio PBS Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction ROC Receiver Operating Characteristic Curve SE Standard Error SEACFMD RCU The Southeast Asia and China Foot and Mouth Disease Campaign (SEACFMD) Regional Coordination Unit in Bangkok USD United States Dollar WRL World Reference Laboratory WTO World Trade Organization vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1 Tình hình dịch LMLM từ năm 2013 – 2015 4.1 Phân loại ổ dịch LMLM theo loài gia súc, giai đoạn 2006 - 2012 48 4.2 Tỉ lệ loài gia súc mắc bệnh LMLM (năm 2006 – 2012) theo loài 50 4.3 Tỷ lệ loài gia súc bị chết bệnh LMLM giai đoạn 2006 – 2012 51 4.4 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh đồng sông Hồng, Đông Bắc Tây Bắc bộ, giai đoạn 2006 - 2009 60 4.5 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Bắc Trung Bộ Nam Trung Bộ, giai đoạn 2006 - 2009 61 4.6 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Tây Nguyên, Đông Nam Bộ đồng sông Cửu Long, giai đoạn 2006 - 2009 62 4.7 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh đồng sông Hồng, Đông Bắc Bộ Tây Bắc Bộ, giai đoạn 2010 - 2012 70 4.8 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Bắc Trung Bộ Nam Trung Bộ, giai đoạn 2010 - 2012 71 4.9 Nguy xuất dịch LMLM tỉnh Tây nguyên, Đông Nam Bộ đồng sông Cửu Long, giai đoạn 2010 - 2012 72 4.10 Mức độ lưu hành vi rút LMLM địa phương hộ chăn nuôi 81 4.11 Mức độ lưu hành vi rút LMLM cá thể theo xét nghiệm probang 82 4.12 Mức độ tương đồng kháng nguyên vi rút vắc xin LMLM với chủng vi rút thực địa 85 4.13 Kết phân tích mơ hình hồi quy nhị biến (phân tích sàng lọc – Bivariate analysis) 89 4.14 Kết phân tích đa tầng, nhiều biến xác định yếu tố nguy 91 4.15 Chi phí vắc xin sử dụng gian đoạn 2006 - 2012 93 4.16 Chi phí trung bình chi trả cho cán tham gia kiểm soát bệnh LMLM hàng năm Việt Nam từ 2006-2012 93 4.17 Chi phí hàng năm kiểm soát bệnh LMLM Việt Nam 94 4.18 Thiệt hại gia súc sức kéo bệnh LMLM 95 4.19 Thiệt hại gia súc sức kéo tổn thương vĩnh viễn móng 96 vii 4.20 Thiệt hại sức kéo gia súc bị chết 96 4.21 Giá trị tổng đàn tồn quốc có khơng có biện pháp kiểm sốt bệnh LMLM 97 4.22 Tổng chi phí liên quan đến bệnh LMLM Việt Nam 98 4.23 Tỉ suất chi phí – lợi nhuận kiểm soát bệnh LMLM 98 viii I TRANG THIẾT BỊ CƠ BẢN - Máy PCR (Bio-Rad-USA) - NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, UK) - Bồn ổn nhiệt - Bộ điện di sản phẩm PCR - Hệ thống bơm hút chân không - Tủ lạnh âm (-20 oC) đến (-70 0C) - Tủ lạnh âm (0 0C) đến (-20 0C) - Tủ lạnh thường (20 0C) đến (80 0C) - Máy ly tâm - Máy IKA Turrax - Máy votex - Máy Spin - Đế từ MPC II Primer đặc hiệu cho vi-rút Lở mồm long móng týp O týp A 2.1 Týp O Týp O Sequence (5’-3’) O–1D293F TGGAYAACACCACYAAYCCAAC VP1 O–1D296F ACAACACCACCAACCCAAC VP1 O–1D296aF ATAACACCACTAATCCAAC VP1 O–1D296bF ACAACACCACCAATCCAAC VP1 O–1D296cF ATAACACCACCAATCCAAC VP1 O–1D628R GTTGGGTTGGTGGTGTTGT VP1 O–1D628aR GTTGGATTAGTGGTGTTAT VP1 O–1D628bR GTTGGGTTGGTGGTGTTTT VP1 Vùng gen 150 2.1 Týp A Serotype A Sequence (5’-3’) A–1D202aF TCAGCCACCTACTATTTCTCTGA VP1 A–1D202bF GCAGCAACATACTACTTCTCTGA VP1 A–1D202cF GCAGCAACCTACTATTTCTCTGA VP1 A–1D202dF GCGGCCACTTACTACTTCTCTGA VP1 A–1D202eF GCGGCCACCTACTATTTTTCTGA VP1 A–1D202fF GCGGCCACCTACTACTTTTCTGA VP1 A–1D478aR CAGTGCTCCGTAGTTAAAGGATGA VP1 A–1D478bR AATTGCACCGTAATTGAAGGATGC VP1 A–1D478cR GAGTGCACCATAGTTGAAAGACGC VP1 A–1D478dR AATCGCACCAAAGTTGAAGGAAGT VP1 A–1D478eR AACTGCGCCGTAGTTGAAGGAGGC VP1 A–1D478fR AATTGCGCCGTAGTTGAAGGATGC VP1 Vùng gen III CÁC GIAI ĐOẠN THỰC HIỆN Giai đoạn 1: Chiết tách RNA vi-rút Rneasy Spin-Columns - Sử dụng 460 µl mẫu vi-rút LMLM ống tube 1.5ml - Cho 460 µl dung dịch Lysis buffer RLT (đã có chứa 1% 2mercaptoethanol) hòa với mẫu vi-rút vortex lắc - Cho 460 µl dung dịch ethanol 70% vortex lắc thành hỗn hợp dịch đồng 151 - Cho 700 µl hỗn hợp dịch cột Rneasy - Ly tâm tốc độ 10.000rpm/15 giây - Loại bỏ nước - Rửa cột Rneasy 700 µl dung dịch RW1 cung cấp theo kít - Loại bỏ nước - Rửa cột lần RNeasy 500 µl dung dịch RPE cung cấp theo kít - Loại bỏ nước - Tiếp tục, rửa cột lần RNeasy 500 µl dung dịch RPE cung cấp theo kít - Ly tâm làm khơ màng lọc cột RNeasy - Hồn ngun thu hoạch RNA 50 µl nước khơng chứa RNA cung cấp sẵn kít - Giữ nhiệt độ -200C Giai đoạn 1: Phiên mã ngược RNA vi-rút (Reverse Transcription of RNA) - Chuẩn bị nguyên liệu Đơn vị (µl) Nguyên liệu 10 mM dNTPs 2.5 Dung dịch đệm RT nồng độ lần MMLV (200U/µl) 0.5 Rnasin (3.3U/ µl) H2O Primer (25pmol/ µl) Tổng thể tích 11 152 - Lấy 14 µl RNA cho vào 11 µl hỗn hợp nguyên liệu với tổng thể tích cuối 25 µl - Xử lý nhiệt 42 oC 60 phút 94 0C 10 phút - Giữ âm -20oC Giai đoạn 3: Khuyếch đại PCR phiên mã ngược - Chuẩn bị nguyên liệu Nguyên liệu Nồng độ 25 mM MgCl2 1.5 mM 10 mM dNTPs 200 μM 1X Primer (10-25 pmol/μl) 0.5 pmol/μl primer (10-25 pmol/μl) 0.5 pmol/μl 2.5 U 0.5 Dung dịch đệm 10X Taq DNA polymerase (5 U/μl) Đơn vị (µl) Mẫu (sản phẩm phiên mã ngược) H2O 33.5 Tổng thể tích - 50 Thực chu kỳ nhiệt độ: Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 940C phút 940C 60 giây 550C 60 giây 720C 90 giây 720C phút 30 Sau lấy μl sản phẩm PCR chạy điện di agarose gel 153 Giai đoạn 4: Phân tích sản phẩm PCR Agarose Gel Electrophoresis Chuẩn bị 60ml thạch agarose 2% dung dịch đệm TBE 1X Đun nhiệt khoảng phút microwave để thạch tan chảy đồng Chuẩn bị bảng Gel agarose Cho 6μl thang chuẩn (marker) Cho 6μl sản phẩm PCR Thực điện di 100 Volts cho 20 phút Bảng gel điện di ghi nhận kết ( nhìn vạch sản phẩm) máy UVTransilluminator Giai đoạn 5: Tinh sản phẩm PCR sử dụng kít Promega Wizard PrepsTM - Cắt sản phẩm PCR cho vào ống tube loại 1.5ml - Cho 100 μl dung dịch tinh (Purification Buffer) - Trộn - Cho 1ml Resin - Lắc lần Mỗi lần phút - Chuẩn bị Wizard Prep-mini-column cho sản phẩm PCR - Ly tâm 12.000 rpm 20 giây Giữ sản phẩm tinh nhiệt độ âm-200C ống chứa 1ml Giai đoạn Đánh dấu vùng Oligonucleotide kít T4 Polynucleotide - Chuẩn bị hỗn hợp nguyên liệu tube eppendorf Đơn vị (μl) Nguyên liệu Primer (24 pmol/μl) 32 Dung dịch đệm PNK 10X T4 polynucleotide kinase (10 P -ATP (1.85 MBq) 154 U/μl) H2O 19 Tổng thể tích 30 - Sau ủ nhiệt độ Nhiệt độ Thời gian 370C 60 phút 900C phút - Sử dụng 1.2 pmol Primer (1.5 μl) cho mẫu Giai đoạn 7: Thực chu trình trình tự gen sử dụng Promega f-mol kit a) Chuẩn bị ống đánh dấu T, C, G A b) Cho μl dd/dNTPs ống/giếng c) Ly tâm nhẹ d) Giữ nhiệt độ 40C Mỗi ống phản ứng thực tube có chứa nguyên liệu sau: Nguyên liệu Đơn vị (μl) Mẫu DNA tinh Dung dịch đệm nồng độ 5X 32 P -ATP 1.5 Taq polymerase (5U/ μl) H2O 10.5 Tổng thể tích 20 155 - Lắc ly tâm nhẹ a) Cho μl hỗn hợp vào tube dd/dNTP/giếng b) Ly tâm nhẹ tất giếng thực Thực chu trình nhiệt: Nhiệt độ Thời gian 940C phút 920C phút 550C phút 720C phút 30 giây 200C Giữ nhiệt Số chu kỳ 30 a) Cho μl dung dịch dừng phản ứng cho tube giếng phản ứng b) Ly tâm nhẹ Đun nhiệt nhiệt độ 80-900C phút trước chạy gel Sử dụng 3.5 μl giếng Chuẩn bị dung dịch Fmol Sequencing Nguyên liệu Nồng độ Đơn vị (μl) Formamide 95% 950 NaOH 2M 10 mM 10% Bromophenol Blue 0.05% 10% Xylene Cyanol FF 0.05% H2O 35 Tổng thể tích 1000 156 Giai đoạn 8: Polyacrylamide Gel Electrophoresis sản phẩm chu trìnhtrình tự gen a)Cẩn thận làm gel với chất tẩy rửa b Rửa lại nước cất sau làm ethanol Chuẩn bị dung dịch gel - 125 ml TBE 0.5X - 250 μl TEMED - 250 μl ammonium persuphate (AMPS) Đổ dung dịch gel kính ống tiêm 50 ml Chuẩn bị 1000ml TBE 1X Sử dụng μl thuốc nhuộm formamide vào giếng Đun nhiệt mẫu nhiệt độ 95-1000C/2phút trước thực bước Cho μl mẫu giếng theo trình tự T, C,G,A Chạy máy 70 Watts Tháo đĩa (plate) bể gel 10 Làm khô khoảng 45-60 phút 1.5 làm nóng nhiệt độ 80-850C 11 Đánh dấu góc gel khơ,thời gian từ 18-48 với hình tăng cường 18-60 tùy thuộc vào hoạt động đồng vị phóng xạ 12 Hiện thị hình ảnh tự động gắn nhãn thứ tự (tức TCGA) đặt tên mẫu máy giải trình tự gen Ví dụ 157 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 T C C T T G A T G T G G C C G A G G C G T G C C C C A C G T 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 T T C T G C A C T T C G A A G G T G A C G T G C C A T A C G 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 T G A C C A C G A A G A C G G A C T C G G A C A G G G T T C 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 T C G C G C A A T T T G A C T T G T C T T T G G C A G C A A 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 A A C A C A T G T C A A A C A C C T T T C T T G C A G G T C 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 T T G C C C A G T A C T A C A C G C A G T A C A G C G G C A 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 C G A T C A A C C T G C A C T T C A T G T T C A C A G G T C 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 C C A C T G A C G C G A A A G C G C G T T A C A T G A T T G 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 C A T A C G C C C C A C C G G G T A T G G A G C C G C C T C 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 64 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 G C A C G C C T G A G G C C G C 158 T G C C C A T T G C A T T C Giai đoạn 9: Phân tích kết phần mềm MEGA4 Kết giải mã gen so sánh để tìm mối liên hệ với trình tự gen nhóm/dòng virus khác cơng bố Ngân hàng gen (NCBI) để so sánh với chủng giới so sánh chủng nước có kết trước phần mềm chuyên dụng (ví dụ phần mềm MEGA) để thể phả hệ sinh dòng 159 PHỤ LỤC 02 VACCINE MATCHING (Xác định tương đồng kháng nguyên vi –rút LMLM-giá trị r1) I TRANG THIẾT BỊ - Micropipettes kênh lấy thể tích từ 0.5-10µl; 10-100µl ; 1001000µl - Multistepper 08 kênh lấy thể tích từ 50-250µl - Máy Vortex - Máy Spin - Kính hiển vi soi ngược - Tủ an toàn sinh học cấp II - Tủ lạnh + 40 0C, tủ lạnh –20 0C, tủ lạnh âm -80 0C - Tủ ấm CO2 - Dụng cụ lọc vô trùng với đầu lọc 0,20 μm - Syringe: 1, 5ml - Tips phù hợp với Micropipettes - Ống Eppendorf 1.5ml - Ống nhựa ly tâm 5ml, 15ml, 50ml - Nồi ổn nhiệt: có nhiệt độ từ +35 0C đến 60 0C - Điã đáy bằ ng triê ̣t trùng 96 giế ng dùng nuôi cấ y tế bào II NGUYÊN LIỆU - Thuốc khử trùng: Virkon, - Phosphate Buffered Saline, - Penicillin/Streptomycin - Fungizone - Eagle’s maintenance medium (EMEM) - Basal medium Eagle (BME) - Formal 10% pha PBS lần - Methyl blue 0,05% pha Formal 10% 160 III CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 3.1 Mẫu kháng huyết Bò: Được sử dụng để thực phản ứng trung hòa vi-rút mẫu huyết tiêm vắc-xin LMLM típ O kháng lại kháng nguyên O1manisa O3039) tiêm vắc-xin LMLM típ A kháng lại kháng nguyên A22Iraq Amay97) Tất mẫu huyết biết trước hiệu giá kháng thể 3.2 Mẫu vi-rút LMLM thực địa: Pha loãng dung dich ̣ vi rút sử dụng với 100TCID50/ 50 µl 3.3 Các bước thực Thực hiê ̣n điã phản ứng: Huyế t pha loãng bắt đầu: 1/4 đế n 1/512 + Mỗi độ pha loãng huyết cho vào giếng, giếng 50 µl + Cho 50 µl dung dich ̣ vi rút với 100TCID50 /50 µl vào giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút + Sau ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/48 Kiể m tra tế bào hằ ng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào - Thực hiê ̣n điã đố i chứng Đố i chứng huyế t thanh: Huyế t đối chứng âm dương tính pha lỗng bắt đầu: 1/4 đế n 1/512 + Mỗi độ pha loãng huyết cho vào giếng, giếng 50 µl + Cho 50 µl dung dich ̣ vi rút với 100TCID50 /50 µl vào giếng + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút + Sau ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất giếng + Ủ đĩa 370C/3 – 5% CO2/48 161 Đố i chứng tế bào + Cho 100 µl mơi trường vào giếng A6 đến D6 A7 đến D7 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/60 phút Đố i chứng môi trường + Cho 150 µl mơi trường vào giếng E6 đế n H6 E7 đến H7 + Ủ đĩa 370C/ 5% CO2/60 phút Chuẩ n đô ̣ la ̣i vi rút sử du ̣ng + Pha loañ g dung dich ̣ vi rút sử du ̣ng: từ 10-1 đế n 10-4 + Cho 50 µl mơi trường vào các giế ng từ A9 đế n H12 + Cho 50 µl vi rút pha loañ g 10-1 và các giế ng từ A9 đế n H9 + Cho 50 µl vi rút pha loañ g 10-2 và các giế ng từ A10 đế n H10 + Cho 50 µl vi rút pha loañ g 10-3 và các giế ng từ A11 đế n H11 + Cho 50 µl vi rút pha loañ g 10-4 và các giế ng từ A12 đế n H12 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/ 60 phút - Sau ủ xong, cho 50 µl tế bào BHK vào tất giếng từ A1 đế n H4, từ A6 đế n D6, từ A7 đến D7 và từ A9 đế n H12 + Ủ đĩa 370C/5% CO2/48 + Kiể m tra tế bào hằ ng ngày dưới kính hiển vi soi ngược để ghi nhận bệnh tích tế bào 3.4 Kết 3.4.1 Tiń h hiê ̣u giá kháng thể trung hòa của mẫu huyế t thanh: - Đô ̣ pha loañ g của huyế t phải chuyể n về log10 (huyế t pha loañ g 1/X, lấ y log10 của X) để đưa vào công thức Karber (1931) 162 Hiê ̣u giá trung hòa 50% = a + 0,5 – 1/n x ∑rl Với: a: độ pha loãng huyế t cao có it́ nhấ t mô ̣t giế ng không có bệnh tích tế bào ∑rl: tở ng số giếng có bệnh tích tế bào các ̣ pha lỗng có it́ nhấ t mơ ̣t giế ng khơng có bê ̣nh tić h tế bào n: số giếng sử dụng cho độ pha loãng 3.4.2 Điề u kiê ̣n để chấ p nhâ ̣n kế t quả - Đố i chứng tế bào: biǹ h thường - Đố i chứng môi trường: biǹ h thường - Đố i chứng môi trường và tế bào: bình thường - Hiệu giá mẫu đối chứng huyết dương chuẩn chệnh lệch ± độ pha loañ g bâ ̣c so với hiê ̣u giá đã biế t (log10 đô ̣ pha loañ g bâ ̣c của hiê ̣u giá đã biế t ± 0,3) - Hiê ̣u giá chuẩ n đô ̣ la ̣i của vi rút nằ m khoảng log10 hiê ̣u giá vi rút đã biế t ± 0,5 3.5 Kết luâ ̣n + Mẫu có hiê ̣u giá kháng thể trung hòa 50% ≥ 1,65 (1/45) đươ ̣c xem là mẫu dương tính + Mẫu khơng có hiê ̣u kháng thể trung hòa 50% ≤ 1,2 (1/16) đươ ̣c xem là mẫu âm tiń h + Mẫu có hiê ̣u giá kháng thể trung hòa từ 50% từ > 1,2 (1/16) đế n < 1,65 (1/45) đươ ̣c xem là mẫu nghi ngờ Nếu mẫu kiểm tra lại lần có hiệu giá > 1,2 (1/16) xem mẫu dương tính Mức tương đồng kháng nguyên thể qua giá trị r1, vi rút vắc xin có giá trị r1 ≥ 0.3 vi rút thực địa vi rút vắc xin có tương đồng kháng 163 nguyên với vi rút thực địa; giá trị r1 cao mức tương đồng cao đồng nghĩa vắc xin có khả bảo hộ tốt với vi rút thực địa Giá trị r1 tính theo cơng thức sau: r1= Trong đó: Nếu r1