ðây là một phương pháp cĩ độ nhạy và độ chính xác cao (Crowther, Abu Elzein, 1979) [19], (Hamblin và cs, 1987) [22], Have và cs, 1983) [23], Roeder và Le Blanc Smith, 1986) [29].
a. Nguyên lý:
Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym khơng bị rửa trơi, enzym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi cĩ màu trong quang phổ kế thì sẽ định lượng được mức độ phản ứng.
b. Phân loại phản ứng ELISA: được phân thành ba loại chính như sau
- Phản ứng ELISA trực tiếp (direct ELISA): dùng kháng thể gắn enzym để xác định kháng nguyên nghi cốđịnh trên đĩa chuyên dụng.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 35
- Phản ứng ELISA gián tiếp (indirect ELISA): dùng kháng nguyên chuẩn và kháng kháng thể gắn enzym để phát hiện kháng thể nghi.
- Phản ứng Sandwich ELISA gồm 2 loại:
+ Phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp (direct Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể gắn emzym.
+ Phản ứng Sandwich ELLISA gián tiếp (indirect Sandwich ELISA): kháng nguyên chuẩn được được kẹp giữa kháng thể chuẩn và kháng thể nghi, sau đĩ kháng thể nghi được nhận diện bằng kháng kháng thể lồi gắn enzym.
c. Ứng dụng phản ứng ELISA trong chẩn đốn bệnh LMLM:
Phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên virus LMLM:
Phương pháp ELISA thường được sử dụng để xác định sự cĩ mặt của kháng nguyên virus LMLM trong mẫu bệnh phẩm lấy từ gia súc bị nghi ngờ nhiễm virus.
Kháng nguyên của virus LMLM cĩ thể xác định bằng phương pháp ELISA trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ hay dịch tiết ở các mụn nước chưa vỡ hoặc mới vỡ.
Cịn mẫu được lấy từ nơi chứa ít virus hay chất lượng mẫu khơng đảm bảo thì trước khi định type virus bằng phương pháp ELISA sẽ tiến hành nuơi cấy virus trên mơi trường tế bào sau đĩ phân lập virus từ mơi trường nuơi cấy.
Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus LMLM:
Phương pháp ELISA cũng được sử dụng để phát hiện và giám định các serotype của virus LMLM trong huyết thanh gia súc. Trong phản ứng, mỗi đĩa ELISA chỉ làm với một type virus LMLM chuẩn, để phát hiện kháng thể nghi trong huyết thanh của gia súc cần chẩn đốn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 36
Cĩ thể sử dụng cả ba phương pháp ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus LMLM. Nhưng hiện nay phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp thường được sử dụng phổ biến hơn cả. Bởi vì, kĩ thuật ELISA này cĩ thuận lợi hơn hẳn các phản ứng thơng thường khác do cĩ tính đặc hiệu rất cao, rất nhạy lại kinh tế vì nhiều ứng dụng:
- Trong chẩn đốn phát hiện bệnh, với phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp chúng ta cĩ thể phát hiện và định type kháng nguyên virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm biểu mơ, dịch tiết hay cĩ thể phát hiện kháng thể và giám định serotype virus LMLM từ mẫu bệnh phẩm huyết thanh.
- ðối với gia súc đã tiêm phịng vacxin, đểđánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gia súc sau tiêm phịng cũng như hiệu quả sử dụng vacxin người ta cũng sử dụng phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp để định lượng kháng thể kháng virus LMLM.
Phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA)
Trong chẩn đốn huyết thanh học, phương pháp Sandwich ELISA gián tiếp được sử dụng nhiều nhất hiện nay trên thế giới là phương pháp LPB - ELISA (Liquid Phase Blocking ELISA). Phương pháp này được nghiên cứu và đưa ra lần đầu tiên bởi Hamblin và cộng sự vào năm 1986. ðộ nhậy của phản ứng LPB - ELISA tương đương với phản ứng trung hồ virus nhưng lại khơng phải nuơi cấy tế bào trong xét nghiệm. Do đĩ, đây là một phương pháp xét nghiệm hiệu quả, an tồn và ít tốn kém hơn so với phương pháp trung hồ virus rất nhiều.
Kỹ thuật chẩn đốn này cho kết quả nhanh trong vịng 3 – 4 giờ, khơng phụ thuộc mơi trường mơ, tỷ lệ phần trăm dương tính giả thấp. Do cĩ thể sử dụng kháng nguyên vơ hoạt nên xét nghiệm được với số lượng chủng virus nhiều hơn.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 37
Hiện nay, để thuận lợi cho việc chẩn đốn tại các phịng thí nghiệm, người ta đã sản xuất ra các bộ KIT chẩn đốn dựa trên kỹ thuật LPB - ELISA. Các thành phần và nguyên liệu cho phản ứng vẫn cĩ thể thực hiện được xét nghiệm dễ dàng. Cĩ hai loại bộ KIT đã được sản xuất là bộ KIT LPB - ELISA bao gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 7 serotype virus và bộ KIT LPB - ELISA phát hiện 3 hoặc 4 serotype virus LMLM. Hiện bộ KIT LPB - ELISA chẩn đốn đang được sử dụng tại Việt Nam gồm bộ kháng thể chuẩn để phát hiện 4 serotype virus O, A, C và Asia1.
d. Ứng dụng phương pháp NSP – ELISA (Non Structural Protein ELISA) Trong chẩn đốn phân biệt kháng thể trong huyết thanh của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phịng vacxin
Phương pháp NSP - ELISA dựa trên nguyên lý sau: Sau khi virus LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn ra. Trong quá trình này, virus vừa tạo ra các thành phần để tái tạo thành các hạt virus mới, vừa tạo ra các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới mà chỉ đĩng vai trị các men giúp cho quá trình nhân lên. Các thành phần kết hợp thành bản thân các hạt virus cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên cấu trúc (SP). Các thành phần khơng tham gia kết hợp thành các hạt virus mới cĩ tính kháng nguyên gọi là kháng nguyên khơng cấu trúc (NSP).
Trong đĩ một số kháng nguyên khơng cấu trúc cĩ khả năng kích thích gia súc tạo ra kháng thể với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh gia súc (nhất là trâu bị) đã nhiễm bệnh. Cịn gia súc được tiêm phịng vacxin, đặc biệt những vacxin vơ hoạt cĩ độ tinh khiết cao (đã được loại bỏ những kháng nguyên khơng cấu trúc) sẽ chỉ sản sinh kháng thể khơng đặc hiệu chống virus LMLM chứ khơng cĩ kháng thể kháng lại kháng nguyên khơng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 38
cấu trúc. Vì vậy, việc phát hiện kháng thểđặc hiệu kháng kháng nguyên khơng cấu trúc cho phép kết luận gia súc đang bị nhiễm virus LMLM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp NSP – ELISA được sử dụng chẩn đốn cho nhiều loại gia súc như trâu bị, dê, cừu. Kháng nguyên khơng cấu trúc xuất hiện sớm nhất sau 8 ngày nhiễm virus ở trâu bị và 10 ngày ở dê cừu. Với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên khơng cấu trúc của virus LMLM chúng ta cĩ thể xác định được động vật nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào, cả những con chưa tiêm hay đã tiêm phịng vacxin, những con khơng cĩ triệu trứng lâm sàng, thậm chí cả ngay khi ổ dịch nổ ra 1 năm.
Phương pháp NSP – ELISA hồn tồn nhạy khi sử dụng chẩn đốn cho một đàn gia súc với số lượng lớn. Nhiều bộ KIT chẩn đốn dựa trên kĩ thuật NSP – ELISA của các hãng khác nhau trên thế giới đã được sản xuất và sử dụng. Nhưng đến 10/2001 sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) đã chính thức cơng nhận ba bộ KIT chẩn đốn cĩ độ chính xác và đặc hiệu cao trong chẩn đốn xác định gia súc nhiễm bệnh LMLM là:
CHEKIT- FMD - 3ABC của Bommeli Diagnostics. FMDV NSP ELISA của UBI.
Ceditest FMDV - NS của Cedi Diagnostics.
của gia súc do bị nhiễm virus LMLM tự nhiên với kháng thể trong huyết thanh của gia súc do tiêm phịng vacxin.
Phương pháp NSP – ELISA (Non - Structural Protein ELISA). Những năm trước đây tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) vẫn cịn chưa cĩ hướng dẫn quy trình chính thức để phân biệt gia súc bị nhiễm virus (sau khi đã lành bệnh) với gia súc đã tiêm phịng vacxin LMLM. Các phương pháp
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 39
huyết thanh học chính thức được hướng dẫn chỉ để định lượng kháng thể kháng protein cấu trúc (Structural proteins – SP) của virus LMLM, nhưng khơng thể phân biệt kháng thể tạo ra do gia súc nhiễm bệnh LMLM hay do tiêm phịng vacxin. Tìm các phương pháp huyết thanh học cĩ thể phân biệt kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM với kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc được tiêm phịng vacxin là trọng tâm nghiên cứu trong nhiều thập niên qua.
Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên cứu và tìm ra được một phương pháp phát hiện được kháng thể cĩ trong huyết thanh của gia súc bị nhiễm virus LMLM, kể cả những con vật đã được tiêm phịng vacxin. ðây là phương pháp ELISA định lượng kháng thể kháng kháng nguyên khơng cấu trúc (Non-structural Proteins - NSP) của virus LMLM trong huyết thanh gia súc. Phương pháp này được gọi là phương pháp NSP – ELISA.
Phương pháp 3ABC – ELISA
Một trong những phương pháp chẩn đốn dựa vào việc xác định kháng nguyên khơng cấu trúc được sử dụng rộng rãi trên thế giới và đem lại hiệu quả cao là phương pháp 3ABC – ELISA. Phương pháp chẩn đốn này nhằm xác định kháng nguyên khơng cấu trúc 3ABC của virus LMLM. 3ABC được xác định là một trong những kháng nguyên cĩ khả năng kích thích gia súc sinh đáp ứng miễn dịch cao nhất. Phương pháp 3ABC – ELISA được Bergmann cùng các cộng sự nghiên cứu, đưa ra lần đầu tiên vào năm 1993 đã thu được nhiều thành cơng khi ứng dụng rộng rãi ở Nam Mỹ.
Bộ KIT thương mại được xây dựng dựa trên kĩ thuật 3ABC – ELISA được sử dụng phổ biến trong các phịng thí nghiệm này là bộCHEKIT – FMD – 3ABC của BommeliDiagnostics - Thuỵ Sỹ. Bộ KIT này cĩ những ưu điểm:
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nơng nghiệp……… 40
- Cho phép chúng ta phát hiện kháng thể 3ABC ở bị và cừu bị nhiễm virus LMLM với bất kỳ serotype nào sau 10 – 14 ngày và kéo dài 1 năm với độ chính xác tới 99,95%. Vì vậy, khi kết quả dương tính ta cĩ thể kết luận trâu, bị bị nhiễm virus LMLM.
- Dễ sử dụng do các thành phần phản ứng đã cĩ sẵn, đồng thời phương pháp tiến hành đơn giản.
- Kiểm tra khối lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.
- Mỗi lần làm xét nghiệm cĩ thể kiểm tra các mẫu của nhiều lồi (trâu, bị, cừu).