a. Mục ñích
Xác ñịnh sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh trâu bò sau tiêm phòng vacxin vô hoạt nhũ dầu nhị giá typ O- Asia1.
b. Sơñồ ñĩa phản ứng LPB – ELISA:
Mỗi serotype virus LMLM sẽ ñược kiểm tra trên từng ñĩa phản ứng riêng. Phản ứng ñược tiến hành theo sơñồñĩa phản ứng sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C++ C++ 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33 B C++ C++ 2 2 C C+ C+ 3 3 D C+ C+ 4 4 E C- C- 5 5 F C- C- 6 6 G Ca Ca 7 7 H Ca Ca 8 8 40 40
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 52
Chú thích:
C++ : Huyết thanh ñối chứng dương mạnh C+ : Huyết thanh ñối chứng dương yếu C- : Huyết thanh ñối chứng âm
Ca : ðối chứng kháng nguyên
1,2,... 40 : Huyết thanh trâu, bò cần kiểm tra
c. Các bước tiến hành Bước 1: Coat ñĩa (phủñĩa)
- Chuẩn bị kháng thể thỏ kháng virus LMLM tương ứng với các sertype O và Asia1. Pha loãng mỗi loại kháng thể thỏ tương ứng với từng serotype O và Asia1 trong dung dịch Coating buffer theo tỷ lệ 1:500. Tính lượng dung dịch pha loãng ñủ dùng cho số ñĩa ELISA sử dụng cho phản ứng. Nghĩa là mỗi ñĩa ELISA cần Coat 5ml kháng thể thỏ pha loãng thì khi pha cần dư thêm 1ml.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa ELISA, mỗi giếng 50µl kháng thể thỏ pha loãng.
- ðậy nắp, ủ và lắc ñĩa trong tủấm 370C/1 giờ hoặc ủ qua ñêm ở 40C.
Bước 2: Thực hiện phản ứng trung hoà trên ñĩa nhựa polyropylen 96 giếng ñáy chữ U
- Các loại huyết thanh ñối chứng (C++, C+, C-) và huyết thanh cần kiểm tra ñược pha loãng theo tỷ lệ 1:16 với Buffer A.
- Kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O và Asia1 ñược pha loãng trong Buffer A theo tỷ lệ 1: 100.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 53
+ Ở cột 1 – 2: nhỏ vào mỗi giếng 30µl huyết thanh ñối chứng C++, C+, C- ñã pha loãng và 30µl dung dịch Buffer A ở các vị trí tương ứng theo sơ ñồñĩa phản ứng (4giếng/loại).
+ Từ cột 3 – 12: Nhỏ vào mỗi giếng 30µl huyết thanh cần kiểm tra ñã pha loãng theo sơ ñồñĩa phản ứng (2 giếng/loại).
+ Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa nhựa polypropylen, mỗi giếng 30µl kháng nguyên virus LMLM chuẩn type O – Asia1 pha loãng.
+ Tiếp theo ủ hỗn hợp kháng nguyên – huyết thanh trong ñĩa nhựa polypropylen qua ñêm ở 40C.
Bước 3: Gắn mẫu vào ñĩa ELISA ñã Coat
- Rửa ñĩa ELISA ñã Coat 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M. - Chuyển 50µl hỗn hợp kháng nguyên – huyết thanh ñã ủ từ ñĩa nhựa chữ U sang ñĩa ELISA theo vị trí tương ứng như sơ ñồ ñĩa phản ứng. ðậy nắp, ủ và lắc ñĩa trong tủấm ở nhiệt ñộ 370C/1 giờ.
- Sau 1 giờ lấy ñĩa ra và rửa ñĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 4: Gắn kháng thể phát hiện Guinea pig
- Kháng thể phát hiện Guinea pig tương ứng với các Serotype O và Asia1 ñược pha loãng theo tỷ lệ 1:100 với Buffer B.
- Nhỏ vào các giếng của ñĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Guinea pig ñã pha loãng. ðậy nắp, ủ và lắc ñĩa trong tủấm ở nhiệt ñộ 370C/1giờ.
- Sau 1 giờ lấy ñĩa ra và rửa ñĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M
Bước 5: Gắn Conjugate
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 54
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Guinea pig ñã pha loãng. ðậy nắp, ủ và lắc ñĩa trong tủấm ở nhệt ñộ 370C/40 phút.
- Sau 40 phút lấy ñĩa ra và rửa ñĩa 3 lần bằng dung dịch nước rửa PBS 0,002M.
Bước 6: Gắn Substrate TMB
- Pha loãng TMB theo công thức: 9ml nước cất + 1 ml axit cetrixaxetat + 100 µl TMB + 1,3µl H202 30%.
- Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa ELISA, mỗi giếng 50µl Substrate TMB ñã pha loãng.
- ðể ñĩa ELISA ở nhiệt ñộ phòng 15 – 20 phút.
Bước 7: Dừng phản ứng
Nhỏ vào tất cả các giếng của ñĩa ELISA, mỗi giếng 50µl dung dịch H2SO4 1,25M ñể dừng phản ứng.
Bước 8: ðọc kết quả phản ứng.
- ðọc kết quả phản ứng trên máy ñọc ELISA Titertek Multiskan Plus MKII, kính lọc 492nm. Sử dụng phần mềm EDI ñể tính PI (Percentage Inhibition).
- Công thức tính PI :
OD huyết thanh
PI = 100 – x 100 OD trung bình Ca
+ Nếu PI ≥ 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ñược coi là dương tính, kết luận trong kiểm tra có kháng thể LMLM.
+ Nếu PI < 50 thì mẫu huyết thanh kiểm tra ñược coi là âm tính, kết luận trong huyết thanh kiểm tra không có kháng thể LMLM
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 55