ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM BACILLUS SUBTILIS TRONG THU HỒI PROTEIN TỪ PHỤ PHẨM CÁ LÓC

ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM BACILLUS SUBTILIS TRONG THU HỒI PROTEIN TỪ PHỤ PHẨM CÁ LÓC Đề tài được tiến hành nhằm tìm ra các điều kiện tốt nhất để thuỷ phân phụ phẩm cá lóc nuôi với sự tham gia của vi khuẩn Bacillus subtilis giúp hiệu suất thu nhận đạm cao, chất lượng đạm tốt. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài cần tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: + Phân tích các thành thành phần cơ bản của phụ phẩm cá lóc nuôi, bao gồm hàm lượng đạm, hàm lượng lipid, độ ẩm. + Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và nước, tỉ lệ chế phẩm Bacillus subtilis bổ sung, tỉ lệ muối bổ sung và thời gian đến hiệu quả thuỷ phân thu nhận các thành phần đạm từ phụ phẩm cá lóc nuôi.

PHẠM THỊ NGỌC DIỄM MSSV B1405125

PHẠM THỊ NGỌC DIỄM MSSV: B1405125

2017

LỜI CẢM TẠ

Trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại Học Cần Thơ,

được sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý Thầy Cô, đặc biệt là quý Thầy

Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã truyền đạt cho em những kiến thức về lí

thuyết và thực hành trong suốt thời gian học ở trường Cùng với thời gian

nghiên cứu, thí nghiệm và sự nỗ lực của bản thân, em đã hoàn thành đề tài

luận văn của mình Từ những kết quả đạt được, em xin chân thành cảm ơn

đến:

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, quý

Thầy Cô Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, quý Thầy Cô Bộ môn

Công nghệ thực phẩm đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt thời gian

học tập

Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Văn Mười và Cô Trần

Thanh Trúc đã dành nhiều thời gian quý giá tận tình hướng dẫn, theo dõi sát

sao và chỉnh sửa những sai sót trong quá trình bố trí thí nghiệm, truyền đạt

nhiều kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi

giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Xin chân thành cảm ơn đến sự giúp đỡ, hướng dẫn nhiệt tình và có tâm

của anh Võ Hoàng Ngân - nghiên cứu sinh ngành Công nghệ Thực phẩm Cảm

ơn anh đã truyền đạt những kiến thức bổ ích, phương pháp nghiên cứu cũng

như những kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn đến các anh chị nghiên cứu sinh, anh chị lớp

cao học Công nghệ thực phẩm khóa 21, khóa 22 và tất cả các anh chị, các bạn

sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 39, 40 đã giúp đỡ, chia sẻ kinh

nghiệm, góp ý những sai sót rất nhiều trong quá trình em nghiên cứu đề tài của

mình

Cuối lời em xin kính chúc quý Thầy Cô, tất cả các anh chị và các bạn dồi

dào sức khỏe và thành công trong cuộc sống!

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Ngọc Diễm

TÓM TẮT

Với hàm lượng đạm khá cao (2,58%), phụ phẩm cá lóc nuôi là nguồn

nguyên liệu có tiềm năng rất lớn trong thu nhận protein Do đó, nghiên cứu đã

được tiến hành nhằm xác định các điều kiện thích hợp để thuỷ phân thu hồi

protein từ phụ phẩm cá lóc nuôi bằng chế phẩm Bacillus subtilis Trong phạm

vi nghiên cứu, đề tài đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố về tỉ lệ

nguyên liệu và nước (1:1 đến 1:4), tỉ lệ chế phẩm vi sinh vật bổ sung thay đổi

từ 0% đến 2,5%, tỉ lệ muối bổ sung thay đổi từ 0% đến 11% và thời gian thủy

phân (6 ngày đến 16 ngày) đến hiệu quả thủy phân thu hồi protein từ phụ

phẩm cá lóc nuôi Kết quả nghiên cứu đã cho thấy, với tỉ lệ nguyên liệu và

nước là 1:3, bổ sung 2% chế phẩm Bacillus subtilis, 9% muối, tiến hành thuỷ

phân trong thời gian 12 ngày sẽ cho khả năng thu nhận protein cao nhất, đạt

48,19% Đồng thời, điều kiện thủy phân này cũng cho sản phẩm đạm thu hồi

có chất lượng tốt với hàm lượng đạm amin cao (5,22%) và hạn chế được đạm

amoniac sinh ra Khả năng thu hồi đạm cao đã cho thấy tiềm năng phát triển

các sản phẩm giàu protein từ phụ phẩm cá lóc nuôi

Từ khoá: phụ phẩm, cá lóc, Bacillus subtilis, đạm tổng, đạm amin, đạm

amoniac.

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung, số liệu được trình bày trong luận văn

này là công trình nghiên cứu của tôi theo sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn

Văn Mười và các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn

cùng cấp nào khác

Cần thơ, ngày 11 tháng 12 năm 2017

Giảng viên hướng dẫn

PGs.Ts Nguyễn Văn Mười

Tác giả

Phạm Thị Ngọc Diễm

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

% Đạm amoniac : Phần trăm đạm amoniac sinh ra tính theo đạm tổng số

của nguyên liệu

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm qua, ngành thủy sản của Việt Nam luôn tăng trưởngmạnh, diện tích nuôi trồng thuỷ sản năm 2013 là 1,5 triệu ha trong đó nuôitrồng thuỷ sản nước ngọt là 911.330 ha với nhiều đối tượng nuôi và mô hìnhnuôi khác nhau (Tổng cục Thủy sản, 2013) Và trở thành thế mạnh kinh tế rấtquan trọng của vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) (năm 2013 sảnlượng thủy sản đạt gần 3 triệu tấn tăng hơn năm 2012 là 170.000 tấn) Các loàithủy sản nuôi có sản lượng lớn ở (ĐBSCL) là cá tra, tôm, cá điêu hồng và gầnđây là sự phát triển mạnh mẽ của cá lóc Cá lóc là loài cá nước ngọt đặc trưng

ở Việt Nam (Mai Đình Yên, 1978) và hiện là đối tượng nuôi quan trọng trong

cơ cấu đàn cá nuôi ở ĐBSCL(Nguyễn Văn Thường, 2004) Theo Long và ctv

(2004) ước tính sản lượng cá lóc nuôi trong năm 2002 toàn vùng ĐBSCLđạt5.294 tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở các tỉnh: An Giang, Đồng Tháp,Cần Thơ và Kiên Giang.

Nắm bắt được điều kiện phát triển và nhu cầu thị trường nhiều ty đã sảnxuất và phát triển đa dạng sản phẩm từ cá lóc như khô cá lóc, chà bông cá lóc,chả cá lóc với quy mô càng lớn tiêu thụ nội địa và xuất khẩu Cùng với sự pháttriển sản phẩm là vấn đề xử lý phụ phẩm từ nguyên liệu như đầu cá, xươngsống, thịt vụn và da nội tạng cũng cần được quan tâm Đây là thành phần cònchứa hàm lượng protein khá cao và chất lượng protein cũng tương tự như ởthịt cá nhưng khó được sử dụng trực tiếp cho tiêu thụ của con người Chiếmkhoảng 60-70% về khối lượng, tương ứng 20-30% tổng hàm lượng protein của

cá (Torres et al., 2007) Vì vậy, việc xử lý nguồn phụ phẩm này bằng các biện

pháp sinh học cũng đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng vi sinh vậthoặc enzyme thủy phân để thu hồi protein do tạo ra những sản phẩm có nhiều

công dụng và giá trị dinh dưỡng cao (Min-Tian Gao et al., 2005) Ngày nay, việc sử dụng enzyme protease từ Bacillus subtilis, một loại vi khuẩn có khả

năng thích nghi cao để ứng dụng vào việc thuỷ phân protein từ phụ phẩm cálóc sao cho hiệu suất thu hồi protein là cao nhất đang được quan tâm nghiên

cứu Tuy nhiên, việc sử dụng trực tiếp chế phẩm Bacillus subtilis để thủy phân

thu hồi protein cần được nghiên cứu để giảm các chi phí trong việc tách chiết

và thu nhận protease Do đó, nghiên cứu đã được thực hiện nhằm ứng dụng

chế phẩm Bacillus subtilis để tiến hành thủy phân thu nhận protein từ phụ

phẩm cá lóc nuôi, hướng đến mục tiêu thu nhận sản phẩm giàu đạm chất lượngcao với hàm lượng đạm amin cao và đạm amoniac thấp nhất

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nhằm tìm ra các điều kiện tốt nhất để thuỷ phân

phụ phẩm cá lóc nuôi với sự tham gia của vi khuẩn Bacillus subtilis giúp hiệu

suất thu nhận đạm cao, chất lượng đạm tốt

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài cần tiến hành các nội dungnghiên cứu sau:

+ Phân tích các thành thành phần cơ bản của phụ phẩm cá lóc nuôi, bao gồmhàm lượng đạm, hàm lượng lipid, độ ẩm

+ Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và nước, tỉ lệ chế phẩm Bacillus

subtilis bổ sung, tỉ lệ muối bổ sung và thời gian đến hiệu quả thuỷ phân thu

nhận các thành phần đạm từ phụ phẩm cá lóc nuôi

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về nguyên liệu cá lóc

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cá lóc (Hình 2.1) là loại cá được người dân ưa chuộng, thịt trắng, ngon,

có giá trị dinh dưỡng cao đồng thời có giá trị xuất khẩu (trích trong Nguyễn

Văn Triều và ctv, 1999)

Theo các tài liệu phân loại học thì họ cá lóc gồm có 2 giống là

Parachanna và Channa Giống Channa chiếm ưu thế với hơn 27 loài và phân

bố hầu hết các nước Châu Á, trong khi giống Parachanna chỉ có 3 loài và phân bố chủ yếu ở khu vực Châu Phi Họ cá Channidae ở ĐBSCL có 4 loài là:

Channa gachua (cá Chành dục), Channa lucius (cá Dày), Channa striata (cá

lóc đen), Channa micropeltes (cá lóc bông) (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993) Nhưng chỉ có 2 loài cá lóc đen (Channa striata) và cá lóc bông (Channa micropeltes) hiện là các đối tượng nuôi chính trong cơ cấu đàn

cá lóc nuôi ở ĐBSCL và trở thành phổ biến ở vùng ảnh hưởng lũ hàng năm ở

ĐBSCLhiện nay (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 1993).

Theo hệ thống phân loại cá lóc (Nelson, 1994; trích dẫn bởi Walter et al.,

2004), vị trí của cá lóc đen trong hệ thống được xác định như sau:

Hình 2.1 Cá lóc nuôi

2.1.2 Đặc điểm phân bố và dinh dưỡng

Ở Việt Nam thì ĐBSCL là nơi nuôi cá lóc nhiều nhất dựa trên nguồnthức ăn tự nhiên phong phú và giá rẻ (Dương Tấn Lộc, 2001) Cá lóc sống phổ

biến ở đồng ruộng, kênh rạch, ao hồ, đầm, sông, thích nghi được cả với môitrường nước đục, tù, nươc lợ, có thể chịu đựng được ở nhiệt độ trên 30°C, pH

thích hợp cho hoạt động sống của chúng là 7,5- 8,5 (Trương Thủ Khoa và Trần

Thị Thu Hương, 1993) Cá thích ở nơi có rong đuôi chó, cỏ, đám bèo, vì ở nơiđây cá dể ẩn mình rình mồi Vào mùa hè cá thường hoạt động và bắt mồi ởtầng nước mặt Mùa đông cá hoạt động ở tầng nước sâu hơn (Dương NhựtLong, 2004).Ngoài ra, nhờ vào cấu tạo thích nghi của cơ quan hô hấp, sự pháttriển của cơ quan hô hấp phụ trên mang, ngoài việc sử dụng oxy có trongnước, cá còn có khả năng lấy oxy trực tiếp từ ngoài không khí (khí trời) Cá cóthể sống trong môi trường chật hẹp, trong điều kiện nước dơ bẩn, nước tù,thiếu oxy, có khi không cần nước chỉ cần da và mang cá có độ ẩm nhất địnhvẫn có thể sống được thời gian khá lâu (Phạm Văn Khánh, 2003)

Cá lóc đen có đầu lớn, đỉnh đầu rất rộng, dẹp bằng Miệng to hướng lên,rạch xiên và kéo dài qua đường thẳng kẻ từ bờ sau của mắt Theo tác giả

Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), lúc cá sống có màu xanh

đen, nâu đen đến đen ở phần lưng và nhạt dần xuống bụng, bụng cá có màutrắng sữa Ở cá nhỏ hai bên hông có từ 10-14 sọc đen lợt vắt xéo ngang thân,các sọc này lợt dần và mất hẳn ở cá lớn Vây lưng, vây hậu môn, vây đuôi cócác đốm đen vắt ngang qua các tia vây Vây lưng và vây hậu môn không cógai, kéo dài về phía sau gần tới gốc vây đuôi, vây ngực rộng, vây bụng nhỏgắn liền nhau ở mặt dưới của thân, vây đuôi tròn (Mai Đình Yên, 1983) Lượcmang cá Lóc có dạng hình núm, cá có thực quản ngắn, vách dày, bên trongthực quản có nhiều nếp nhăn Dạ dày to hình chữ Y, ruột cá thoái hóa còn rấtngắn, đây là loài cá có tính ăn rộng, thường ăn mồi sống và bắt mồi chủ động

(Nguyễn Thị Nhãn và ctv, 2011).

Theo Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ (2003), cá lóc là loài cá dữ, phàm ăn

(miệng rộng, răng sắc) Cá Lóc là loài cá ăn động vật, thành phần thức ăn baogồm nhiều loại động vật tươi sống như: cá, tép, ếch nhái Ngoài ra cá lóc cóthể ăn được thức ăn chế biến (Huỳnh Thu Hòa, 2004) từ cá nguồn nguyênliệu địa phương như cá tạp tấm cám, bắp, và Vitamin C (35 mg/kgthức ăn) có hàm lượng protein lớn hơn 20% Nếu nhiệt độ thấp hơn 12°C thì

cá kém ăn và sống ở tầng đáy (Nguyễn Văn Kiểm và ctv, 1999).

Loài cá này có tốc độ tăng trưởng rất nhanh nên người dân rất thích nuôi.Trọng lượng cá khi thu hoạch có thể đạt kích cỡ dao động từ 1,2 - 1,5 kg/con.Giai đoạn nhỏ, cá lóc chủ yếu tăng trưởng về chiều dài, cá càng lớn thì sự tăng

trọng ngày càng nhanh (Lam Mỹ Lan và ctv, 2009) Trong tự nhiên, sức lớn

của cá không đều, phụ thuộc vào điều kiện thức ăn sẵn có trong thuỷ vực.Trong điều kiện nuôi có thức ăn và chăm sóc tốt cá có thể lớn từ 0,5 đến 0,8

kg/năm, đạt tỷ lệ sống cao và ổn định (Phạm Văn Khánh, 2000) Sau 1 nămtuổi, thân cá lóc dài 38,5-40 cm, nặng 625-1,395 g, cá 3 tuổi thân dài 45-59

cm, nặng 1,467-2,031 g , con đực và con cái chênh lệch lớn về trọng lượng(Minh Dung, 2004) Ở cá Lóc có sự ăn nhau khi có sự sai khác về kích cỡ.Nghiên cứu cho thấy kích cỡ cá nhỏ/cá lớn bằng 0.64/1 sẽ có hơn 40% cá nhỏ

bị cá lớn ăn thịt (Qin et al, 1996, trích bởi Phan Hồng Cương, 2009).

Cá lóc từ 1-2 năm tuổi bắt đầu sinh sản, có thể đẻ đến 5 lần/ năm Ở nhiệt

độ 25- 30°C sau 3 ngày cán ở thành con (Ngô Trọng Lư, 2003) Sức sinh sảntùy thuộc vào trọng lượng cá cái, cá có trọng lượng từ 1,0- 1,5kg , sức sinh sảnđạt 15.000 -20.000 trứng/ tổ cá và từ 5.000 -10.000 trứng/ tổ cá đối với cá 0,5

-0,8 kg (Nguyễn Văn Kiểm và ctv,1999) Trứng cá Lóc màu vàng sậm, có

chứa giọt dầu nổi được trên mặt nước Sau khi đẻ xong cá bố mẹ không rờikhỏi ổ mà nằm phục dưới đáy bảo vệ trứng cho đến khi trứng nở thành con vàcá con bắt đầu có tập tính sống độc lập (Phạm Văn Khánh, 2003)

2.1.3 Tình hình nuôi trồng và phát triển của cá lóc

Cá lóc là một trong những mặt hàng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở

ĐBSCL Theo Long và ctv (2004) ước tính sản lượng cá lóc nuôi trong năm

2002 toàn vùng ĐBSCL đạt 5.294 tấn, sản lượng này tập trung chủ yếu ở cáctỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và Kiên Giang Cá lóc nuôi với mật độbán thâm canh và thâm canh với nhiều hình thức nuôi như: nuôi trong ao đất,nuôi lồng, mương rãnh và trên ruộng lúa v.v trong các quốc gia ở châu Á

(Ling 1997; Xuan và ctv, 1994) Sản lượng này tăng lên 40.000 tấn năm 2009, tăng hơn 1.000 tấn so với năm 2008 (Đỗ Minh Chung và Lê Xuân Sinh, 2011).

Năm 2016, diện tích nuôi cá lóc ở ĐBSCL là 100.000 ha, trong đó Trà vinh có

258 ha, Đồng Tháp 193 ha, An Giang là 114 ha, tổng sản lượng cá lóc ĐBSCLđạt 65.000 tấn (Trà Vinh 30,8%, An Giang 18,9%, Đồng Tháp 19,2%, các tỉnhkhác 31,1%)

Hầu hết cá lóc nuôi được bán ở thị trường trong nước, khoảng 400-500tấn cá sống được xuất sang Campuchia và 40-50 tấn xuất sang các nước khác.Cá lóc tiêu thụ trong nước chủ yếu được bán cho các vựa ở thành phố Hồ ChíMinh (58,8%), người bán lẻ (31,6%), cơ sở chế biến (2,8%), nhà hàng và quán

ăn (6,8%) (Le et al., 2012).

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng của cá lóc

Là loài cá ăn động vật nên giá trị sản phẩm thịt có chất lượng cao (Phạm

Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009) Có giá trị y học cao, rất tốt cho sức

khỏe con người bởi vì nó chứa rất nhiều các acid amin và các acid béo

(Haniffa et al., 2014) Những yếu tố như giống loài, mùa vụ khai thác, thời

tiết, vùng miền, điều kiện sinh trưởng… ảnh hưởng quyết định đến thành phầndinh dưỡng của cá lóc Hàm lượng protein trong thịt cá khoảng 16-20%, trong

trứng cá khoảng 20-28% Hàm lượng lipid biến động trong khoảng 1-34%

(Trần Văn Chương, 2001; Trần Như Khuyên và Nguyễn Thanh Hải, 2007)

Thành phần dinh dưỡng của cá lóc bao gồm protein, lipid, nước và cácthành phần khác (muối vô cơ, carbohydrate và hocmon…) Thành phần dinhdưỡng cá lóc được biểu hiện ở Bảng 2.1:

Bảng 2.1: Thành phần hóa học của cá lóc

(Nguồn: Wimalasena and Jayasuriya, 1996)

Protein trong cá lóc có giá trị dinh dưỡng cao vì nhiều acid amin cầnthiết cho người (Bảng 2.2) và các thành phần acid amin cân đối Đặc biệt, hàmlượng đáng kể albumin có khả năng chống oxy hoá, ngăn chặn và phản ứngvới các gốc tự do (Tranggono, 1991)

Bảng 2.2: Thành phần acid amin trong protein thịt cá lóc

470

560 180 70

16-gồm một số lượng lớn các protein hòa tan: albumin, myoalbumin,myoprotein, globulin-X và myostromin Albumin, myoprotein và myoalbumin

có khả năng hòa tan trong nước cao Trong khi đó, myostromin và globulinkhông hòa tan trong nước nhưng tan trong acid yếu Protein này tan trongnước và dung dịch muối có nồng độ ion thấp (nồng độ muối 0,5%) và có thểđược làm đông tụ ở nhiệt độ cao (90°C) Heme-protein và các enzyme khácnhau tham gia vào quá trình chuyển hóa tế bào (Harris, 1990)

2.2 Tổng quan về protein thuỷ sản

2.2.1 Sơ lược về protein

Tất cả các tế bào sống đều chứa protein, điều đó có nghĩa là protein làchất cần cho sự sống Protein là thành phần cơ bản cấu tạo nên tế bào và đơn

vị cơ bản của cơ thể sống Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ

thể sinh vật (Lê Ngọc Tú và ctv, 2004) Protein là những đại phân tử được cấu

tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là acid amin, chúng kết hợp vớinhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (còn được gọi là chuỗipolypeptide), các chuỗi này có thể xoắn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thànhcác cấu trúc không gian khác nhau của protein Theo Phan Thị Thanh Quế(2005) thì các acid amin trong chuỗi polypeptide của cá chứa đầy đủ các acidamin thiết yếu không thể thay thế như lysine và các acid amin có chứa lưuhuỳnh (methionine, cysteine)

Protein được phân nhóm theo nhiều nguyên tắc khác nhau, như dựa vàohình dạng, tính tan hoặc chức năng, thành phần hóa học để phân nhóm protein.Dựa vào khả năng hòa tan, protein cơ được chia thành 3 nhóm: protein chất cơ(protein tương cơ) tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, protein tơ cơ(protein cấu trúc) tan trong dung dịch muối nồng độ cao và stroma protein haycòn gọi là protein liên kết không tan trong nước, dung dịch muối cả loãng vàđặc (Lawrie, 1991)

2.2.1.1Protein tơ cơ (Myofibrillar protein)

Chiếm 55-60% tổng protein mô cơ (Asghar et al.,1985) Protein tơ cơ

bao gồm myosin, actin, actomyosin, tropomyosine, troponin,… trong đómyosin chiếm khoảng 55% (Nguyễn Văn Mười, 2006) Các protein này hòatan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (<0,5 M) (Huss,1995) Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động của

cơ, actin và myosin tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ (Nguyễn ThịThu Thủy, 2011)

2.2.1.2Protein mô liên kết (Stroma protein)

Protein mô liên kết, màng cơ hay stroma protein chiếm khoảng 3-10%tổng lượng protein của cá Collagen và elastine là hai thành phần cơ bản củamàng cơ Các protein này có trong thành phần của chất cơ và màng liên kếtbao bọc sợi cơ Màng cơ có thể ở dạng chặt chẽ, dày đặc hay lỏng lẻo tùythuộc vào thành phần và sự liên kết của các tế bào và của các sợi cơ hiện diện(Nguyễn Văn Mười, 2006) Protein này không tan trong nước, trong dung dịchkiềm và trong dung dịch muối trung tính Protein mô liên kết có giá trị dinhdưỡng kém hơn so với protein cấu trúc và protein tương cơ (Nguyễn Thị ThuThủy, 2011)

2.2.1.3Protein chất cơ

Protein chất cơ chiếm 30% đến 35% tổng protein cơ và chiếm khoảng

5% khối lượng mô cơ (Asghar et al., 1985), gồm albumin, myoalbumin, globulin, myoglobulin và các enzyme (Haard et al., 1994; Kijowski, 2001).

Các protein này có đặc tính là tan được trong nước, tan trong dung dịch muốitrung tính có nồng độ ion thấp (Masuelli, 2013) Protein tương cơ bị đông tụkhi đun nóng ở nhiệt độ trên 50°C (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011; Phan ThịThanh Quế, 2005)

2.3 Giới thiệu về phụ phẩm thuỷ sản

2.3.1 Giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm thuỷ sản

Thuỷ sản là nguồn nguyên liệu quan trọng của thực phẩm, của côngnghiệp, nông nghiệp và dược phẩm Từ các loài thủy sản, người ta đã chế biếnđược hơn 4000 món ăn khác nhau và hơn 1600 dạng đồ hộp Ngoài ra, từ thủysản còn sản xuất ra một số loài thuốc chữa bệnh, các dạng thức ăn dùng trongchăn nuôi và các sản phẩm dùng trong các ngành công nghiệp như: các loạikeo, các chế phẩm enzyme, các hoạt chất chống oxy hoá, các chất màu, hươngliệu, đồ trang sức, Xét về vai trò dinh dưỡng, protein cá chứa đầy đủ và cânđối các acid amin không thay thế như ở thịt động vật trên cạn

2.3.2 Các vấn đề đặt ra từ phụ phẩm thuỷ sản

Ngành chế biến thủy sản trong nước và trên thế giới hàng năm thải ra mộtlượng lớn các phụ phế phẩm một cách lãng phí dẫn đến ô nhiễm môi trườngcần được xử lý Phụ phẩm thủy sản thường là nội tạng, đầu, xương, da, Đểgiải quyết một lượng lớn phụ phẩm như hiện nay, tại Việt Nam và trên thế giớiđang có xu hướng tận thu phần phụ phẩm để chế biến thành các sản phẩm cógiá trị gia tăng Một số phụ phẩm có giá trị dinh dưỡng cao dùng để chế biếnthành bột cá, dầu cá, Ngoài ra các sản phẩm như: chế phẩm enzyme, peptide

có hoạt tính sinh học, màng sinh học được chế biến từ một số loại phụ phẩmthủy sản có thể mang lại những hiệu quả kinh tế rất lớn cho con người.

2.4 Tổng quan về vi sinh vật Bacillus subtilis

2.4.1 Vị trí phân loại

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion

Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Năm

1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt

tên là Bacillus subtilis.

Dựa theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Basillus subtilis thuộc:

Giới (regnum): Bacteria

Ngành (phylum): FirmicutesLớp (class): Bacilli

Bộ (ordo): BacillalesHọ (familia): Bacillaceae

Chi (genus): Bacills Loài (species): Bacillus subtilis

Dưới đây là đại diện một loại Baciluss subtilis và chế phẩm vi sinh có mặt trên thị trường hiện nay (Hình 2.2):

Hình 2.2 Vi sinh vật Bacillus subtilis và chế phẩm Bacillus subtilis

2.4.2 Đặc điểm hình thái và môi trường sống

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, đầu tròn, không kết thành chuỗi, bắt

màu tím, kích thước 0,5-0,8 µm x 1,5-3 µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Là

vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, có 8-12 lông Có khả năng phânhủy protein, lipid nhờ có khả năng tiết enzyme protease và lipase

Thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sinh bào tử Chiều ngangcủa bào tử không vượt quá chiều ngang của tế bào vi khuẩn do đó khi có bào

tử tế bào vi khuẩn không thay đổi hình dạng Thường thuộc loại hiếu khí hoặc

kỵ khí không bắt buộc (Phạm Kim Tuyến, 2006 trích dẫn của Ehrenberg,1835)

Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trongđất và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đấttrồng trọt có khoảng 106 -107 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng samạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm Ngoài ra, chúng còn có

mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus

subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như

mắm, tương, chao, Vi khuẩn này có thể phân lập được dễ dàng vì chúng tồntại rất phong phú trong tự nhiên từ nhiều nguồn khác nhau như: đất, nước,không khí và các nguồn xác thực vật,… Có khả năng thích nghi cao do có sinhbào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon

trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các

hợp chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng Đặc biệt các loài

như Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp,

chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như:Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)

Bacillus subtilis là vi khuẩn không gây bệnh cho người, động thực vật và

môi trường sinh thái, đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hạitrong quá trình biến đổi sinh học

Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng

sinh dưỡng, hình thành bào tử và nảy mầm Tăng trưởng tế bào sinh dưỡngxảy ra khi các chất dinh dưỡng dồi dào và tăng trưởng theo hàm số mũ Khichất dinh dưỡng cạn kiệt chúng bắt đầu hình thành bào tử Mỗi tế bào dinhdưỡng chỉ tạo một bào tử, bào tử không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở100°C trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sáttrùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng cứ

về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong 200-300 năm.Việc

hình thành bào tử là một quá trình phức tạp, bào tử phát triển bằng cách nảymầm do sự nứt của bào tử, tiêu tốn nhiều năng lượng, tế bào cần giảm nhu cầu

sử dụng chất dinh dưỡng để đảm bảo đủ chất dinh dưỡng cho quá trình hình

thành bào tử (Gonzalez – Pastor et al, 2003).

Khuẩn lạc của Bacillus subtilis mọc trên môi trường thạch đặc có đặc

điểm khô ráo, màu trắng đục hoặc màu kem xám nhạt, bề mặt khuẩn lạc bóng,trơn, mọc lan trên mặt thạch, có mép nhăn, lồi lõm

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào

tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng

xạ,… (Tô Minh Châu, 2000) Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) nồng

độ muối NaCl làm cho Bacillus subtilis ngừng phát triển là 10-15% Theo

Nguyễn Đức Lượng (2002) và Phạm Minh Tâm (2002), Bacillus subtilis có aw

tối thiểu 0,95 Theo Lương Đức Phẩm (1978) và Hồ Sưởng (1978) nhiệt độ

sinh trưởng tối thích của vi khuẩn Bacillus subtilis là 37°C, protease của

Bacillus subtilis có vùng pH tác dụng tương đối rộng, pH thích hợp khoảng

7,0-7,4 (Tống Ngọc Triêm)

- Ảnh hưởng của độ thông khí: độ thông khí việc sục khí và khuấy đảo môitrường có tác dụng tốt với sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợpenzyme của vi sinh vật cũng như quá trình sinh tổng hợp protease Tuy nhiên,ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo loài vi sinh vật Trong một số trườnghợp:

+ Thiếu oxy, tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưnglại làm tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnh lại kìm hãm sinhtổng hợp protease

+ Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các visinh vật có khác nhau (Crivova, 1973; Aravina và cộng sự, 1976)

− Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy: thời gian hoạt động củaprotease vi khuẩn phụ thuộc độ bền hoạt tính của protease Thông thường hoạttính của protease có thể giữ được trong khoảng từ 60-82 giờ tuy nhiên hoạttính sẽ giảm dần theo thời gian Hoạt động của protease chỉ mạnh trong

khoảng thời gian xác định tùy loài vi khuẩn Protease của Bacillus subtilis sinh

tổng hợp hoạt động tốt nhất trong khoảng thời gian 46-68 giờ (Tống NgọcTriêm)

− Muối: hạn chế sức hoạt động của enzyme thủy phân nhưng đồngthời muối cũng giữ cho việc thủy phân tiến hành đều đặn, ngăn chặn sự pháhoại của vi khuẩn thối rữa (Lương Hữu Đồng, 1975)

− Nước: hoạt động sống của vi sinh vật đều liên quan đến nước, tỷ

lệ nước trong tế bào của vi sinh vật khá cao, nước trong vi khuẩn chiếm từ 85% Vi sinh vật cần nước ở trạng thái tự do, do đó quá trình trao đổi chất nếuthiếu nước sẽ có hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào, làm cho tế bào có thể bịchết Nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất màcòn là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa Nước không những có ảnh hưởng

75-đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân (Lê Ngọc Tú và ctv,

2005)

− Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọngđối với sinh trưởng của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase Nhiệt độ

nuôi Bacillus subtilis là khoảng 35-37oC và tối ưu nhất là 37°C vì ở nhiệt độ

này Bacillus subtilis sinh trưởng tốt, khả năng sinh nhiều protease nhất (Đỗ Thị Bích Thủy và Trần Thị Xô, 2004).

2.4.4 Một số ứng dụng của vi sinh vật Bacillus subtilis

Bacillus được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:

- Trong công nghiệp: Bacillus có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nên

được ứng dụng nhiều trong sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp như đượcứng dụng nhiều trong α - amylase, protease, phytase, có vai trò trong côngnghệ thực phẩm như amylase dùng để đường hoá tinh bột hay hệ enzyme của

Bacillus subtilis được ứng dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa và sản xuất

enzyme công nghiệp Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp lysine khá cao

(15-20%) từ tinh bột nên được ứng dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành

Bacillus amyloliquefaciens được thế giới sử dụng để sản xuất α–amylase và

protease ở quy mô công nghiệp

+ Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da: Việc xử lý da bằng cách sửdụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế về dễ kiểm soát, nhanhchóng và giảm được chất thải Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố

không mong muốn, từ đó có được da sạch George et al (1995) sử dụng protease kiềm của Bacillus amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da.

- Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme

ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như

Streptococcus pyogenes, E coli, Salmonella, Vibrio sp, Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng

trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao nuôi nhằmduy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi Yerra Koteswara

Rao et al (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được chủng Bacillus

amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học đối với Botrylis

elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ)

- Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và

cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus

amyloliquefacien, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, Người ta sử dụng chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân

protein thực vật và động vật có trong rác hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rácthải Ngoài ra, chúng còn là một trong những thành phần của sản phẩm dùng

để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ sung cho tôm Thành phần của các

sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis,

Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ một chức năng riêng và

tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm phát triển khoẻmạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt

- Trong y dược: Bacillus được ứng dụng tạo ra nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu như: Bacillus subtilis được đóng thành từng ống 10 ml hoặc gói dạng bột gọi là subtilin (Humfeld and Feustel, 1943) để điều trị bệnh tiêu chảy cho người do Coliforms gây ra, bệnh đường ruột do lị trực trùng hoặc dùng để đắp

vết thương ngoài da Từ Bacillus subtilis có thể thu được nhiều kháng sinh như Subtilin (Humfeld and Feustel, 1943), Eulycin (Johnson and Durdon, 1946), Bacillomin (Shtikell and Poplavskii, 1955).

- Ngoài ra, do bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiếnđến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non, nên được ứng dụng sản xuất

probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006).

2.5 Khái quát chung về thuỷ phân

Thủy phân là một quá trình hóa học trong đó một phân tử bị phân cắt khi

có mặt của phân tử nước Một phần của phân tử sau khi cắt sẽ tương tác vớication H+ từ phân tử nước, phần khác sẽ liên kết với anion OH- còn lại

Bản chất của quá trình thủy phân protein là quá trình phá vỡ các liên kếtpeptide khi có mặt của nước Trong quá trình thủy phân protein, protein đượcthủy phân bởi enzyme protease, acid hay base Hơn nữa, do liên kết peptide làliên kết bền, nên quá trình thủy phân cần có mặt chất xúc tác Các tác nhânxúc tác gồm:

+ Tác nhân hóa học: acid (HCl) hay base (NaOH)

+ Tác nhân hóa sinh học: enzyme thủy phân protein (protease)

Trong nhiều nghiên cứu, thủy phân bằng phương pháp sử dụng enzymethủy phân là phổ biến nhất Thủy phân protein thường phải được phân đoạn để

có được những peptide với chức năng cao hơn hoặc nâng cao giá trị dinhdưỡng ở dạng tinh khiết hơn Quá trình thủy phân protein tạo ra các đoạnpeptide, các acid amin tự do có giá trị dinh dưỡng, sinh học cao đáp ứng cácchức năng sinh lý cho cơ thể người, đây là phương pháp chế biến mang lạihiệu suất thu hồi protein cao nhất và không ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản

phẩm cuối cùng (Chalamaiah et al., 2012).

Quá trình thủy phân của liên kết peptide dẫn đến tăng số lượng các ion(NH4+ và COO-), đồng thời làm tăng tính kỵ nước và sự tích điện, giảm kíchthước các phân tử của chuỗi polypeptide và thay đổi cấu trúc phân tử, dẫn đến

phơi bày các nhóm kỵ nước ra môi trường phản ứng (Mahmoud et al., 1992) Theo Trần Thanh Trúc và ctv (2015) việc thủy phân protein làm giảm

kích thước các peptide, dịch thủy phân là nguồn acid amin có sẵn cho sinhtổng hợp protein Tuy nhiên, việc sử dụng acid mạnh hoặc bazơ mạnh để thủyphân protein là nguyên nhân tạo ra các sản phẩm phụ có tác hại với môitrường Chính vì vậy, việc thủy phân protein hòa tan từ thịt cá lóc bằng tácnhân sinh học là enzyme có thể kiểm soát được quá trình thủy phân nên giảmthiểu các phản ứng không mong muốn và giảm ô nhiễm môi trường

2.5.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thuỷ phân protein có bổ sung vi

sinh vật Bacilus Subtilis

- Nước: tỉ lệ nước bổ sung ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân, nước là môi

trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản

ứng nữa Nước không những có ảnh hưởng đến vận tốc mà cả chiều hướng củaphản ứng thủy phân (Lê Ngọc Tú và cs, 2005) Hàm lượng nước bổ sung ít,môi trường không đủ loãng, môi trường hạn hẹp cũng khiến vi sinh chậm pháttriển và chết đi hoặc sinh bào tử Nước bổ sung nhiều pha loãng dịch thuỷphân, không thu nhận nguồn đạm cao, phát sinh chi phí và mất nhiều thờigian Đồng thời lượng nước bổ sug cũng ảnh hưởng tới lượng đạm amoniacsinh ra.

- Tỉ lệ chế phẩm Basillus subtilis: Mật số vi sinh trong môi trường thuỷ phân

liên quan đến tốc độ thuỷ phân và sản phẩm thu hồi Mật số vi khuẩn cao sẽthúc đẩy tốc độ thủy phân cơ chất nhanh hơn Tỉ lệ vi sinh bổ sung cần phụthuộc vào lượng cơ chất cần thuỷ phân và thu hồi Khi mới đưa vào môitrường thủy phân, đây là giai đoạn vi khuẩn làm quen với môi trường và chuẩn

bị cho sự tăng trưởng, hoạt động vượt bậc sau đó Khi đã quen với môi trườngmới, vi khuẩn bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhân.Đến một lúc nào đó mật số vi khuẩn không tăng thêm mà giữ ổn định ở mộtmức trong thời gian nhất định

- Muối: Muối được bổ sung với tác dụng phòng thối, hàm lượng muối quá thấp

không ức chế được các vi sinh vật gây thối, ưa muối Các vi sinh vật này sửdụng nguồn cơ chất cung cấp cho việc thu hồi đạm và sinh ra các sản phẩmphụ như H2S, S, Hàm lượng muối quá cao sẽ gây ức chế cả các vi sinh vật

bổ sung, cản trở quá trình tổng hợp protein

- Thời gian thuỷ phân: Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt

trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại Thời giandài hơn và sử dụng lượng vi khuẩn lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn(Phan Thiên Tùng, 2006 trích trong Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005)

2.6 Một số nghiên cứu có liên quan

Đề tài nghiên cứu trước khi thực hiện cần tìm hiểu các nghiên cứu có

liên quan về vấn đề thuỷ phân có bổ sung vsv Bacillus subtilis với các điều

kiện thuỷ phân khác nhau, các nguyên liệu cũng như các ứng dụng khác nhaulàm cơ sở nền cho việc bố trí thí nghiệm của nghiên cứu Một số đề tài liênquan trước đó như:

Một nghiên cứu khoa học cấp trường do Trần Thanh Dũng đã nghiên cứu

“thuỷ phân phụ phẩm cá tra bằng vi khuẩn Baciluss subtilis làm phân bón cho

cây hẹ” Thông qua nghiên cứu, đề tài kết luận điều kiện thuỷ phân thích hợp

là bổ sung tỉ lệ chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis 1,4%, muối 7% và pH =

5,2 Ở điều kiện đó, kết quả nghiên cứu ghi nhận mật số vi khuẩn thuỷ phânprotein cao (log mật số là 9,2 tương đương với mật số 1,6 x 109) và hàmlượng lượng đạm amin đạt cao nhất (49,88 g/kg chất khô), đạm amoniac thấp

nhất (5,0 g/kg chất khô) vào ngày thủy phân thứ 10 Dịch đạm thủy phân nàyphù hợp để làm phân bón.

Nguyễn Minh Trí, 2011 đã nghiên cứu điều kiện thích hợp nuôi cấychủng Bacillus subtilis CB15 sinh protease trên môi trường dịch ép đầu tôm vàcho kết quả thực nghiệm, điều kiên nuôi cấy thích hợp sinh protease: môitrường chứa 40% dịch ép đầu tôm (pH= 7), nhiệt độ phòng (28-30°C), lắc 130vòng/ phút, nuôi cấy trong 72 giờ, hoạt độ protease đạt trên 1 AU/ml dịch nuôicấy Enzyme thu được có hoạt tính cao nhất ở 50°C, pH= 8

Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ vi khuẩn (bacillus subtilis) đểthủy phân phụ phẩm cá tra của Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, TrươngQuang Bình (Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM) kết luậnđiều kiện tối ưu cho việc thủy phân phụ phẩm cá Tra từ enzyme protease từ vikhuẩn Bacillus subtilis như sau nhiệt độ 50°C, pH = 7,6, tỷ lệ nước 30%, nồng

độ muối 2%, hoạt độ enzyme 50UI và thời gian thủy phân là 18 giờ Kết quảthu nhận được từ nghiên cứu là sản phẩm nước mắm thu được khi ủ ở tỷ lệ bãchượp 20% có hàm lượng đạm formol 14,5 g/l, đạm tổng số 16 g/l, đạm NH3

1,49 g/l và acid amin 12,81 g/l Kiểm tra chỉ tiêu vi sinh đạt tiêu chuẩn và cảmquan đạt nước mắm loại khá, hạng nhất

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Các thí nghiệm được tiến hành bố trí, phân tích các chỉ tiêu và xử lý sốliệu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nôngnghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 08/2017 đến tháng 12/2017

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Máy xay BIGSUNBB – 179, công suất 250 W, Việt Nam

- Cân điện tử, độ chính xác 0,0001 g, Ohaus, Mỹ

- Cân điện tử, độ chính xác 0,1 g, Satedo, Trung Quốc

- Máy khuấy từ Toshiba, Magnestir MG-10, Nhật

- Thiết bị ly tâm nhiệt độ thấp, Herlme Z323K, Rotana 46 R, Đức.

- Hệ thống trích béo Shoxlet

- Bộ chưng cất đạm Kjeldalh,Velp, Italy

- Nhiệt kế HANNA, model S42866, độ chính xác 0,1ºC, Ý

- pH kế HANNA, TOA pH meter HM-12P, độ chính xác 0,01, Ý

- Tủ đông Acson International, model Acson R134a, -25ºC, Nhật

- Máy lắc mẫu, Hàn Quốc

- Một số dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm: Ống nghiệm, cốc(50, 100, 250 mL,…), bình tam giác (100, 250 mL), bình định mức(100, 500, 1000 mL), ống đong (10, 50, 100 mL) xuất xứ từ TrungQuốc, Nhật và Đức

- Micropipet thể tích 1-5 mL (EMC Lab, Đức)

- Một số dụng cụ và thiết bị phòng thí nghiệm khác

3.1.3 Hóa chất sử dụng

- Dung dịch pH chuẩn 4,00, 7,00 và 9,00 do Đức sản xuất

- Natri chlorua 98%, Trung Quốc

- Ether dầu hoả 60-90, Trung Quốc

- Magie oxit (MgO), Việt Nam

- Dung dịch H2SO4 đậm đặc (D = 1,84)

- Chất xúc tác: (K2SO4: 100 g / CuSO4: 10 g / Se: 1 g)

- Sodium hydroxyde , độ tinh khiết 99,5%, Việt Nam,

- Phenolphtalein, PA, Việt Nam

- Ống chuẩn Natrihydroxide 0,1 N, Việt Nam

- Ống chuẩn acid sulfuric 0,1 N, Việt Nam

- Các hóa chất có liên quan khác

Tất cả các hóa chất được cung cấp bởi chi nhánh công ty cổ phần Hóachất và Vật tư khoa học kỹ thuật Cần Thơ;

- Bacillus subtilis 109 CFU/g được sản xuất tại công ty TNHH SITTOVIỆT NAM (số 4, đường 3A, khu công nghiệp Biên Hoà, tỉnh Đồng Nai).3.1.4 Nguyên liệu

Nguyên liệu thí nghiệm là phụ phẩm của quá trình chế biến cá lóc baogồm đầu, mang, da, vây, đuôi và thịt xương vụn của cá lóc sau khi xử lý thuhồi thịt fillet Cá lóc nguyên liệu được mua từ vùng nuôi cá lóc ở huyện TamBình, tỉnh Vĩnh Long Cá sau khi thu mua vào buổi sáng (trước 6 giờ), đượcchứa trong các thùng nước, vận chuyển về phòng thí nghiệm với thời giantrung bình 1 giờ Đến phòng thí nghiệm (Bộ môn Công nghệ thực phẩm, KhoaNông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ), cá còn sốngđược giữ ổn định trong bể nước ít nhất 1 giờ trước khi xử lý, nhiệt độ nước đạtkhoảng 25°C Cá được thực hiện xử lý sơ bộ để thu hồi thịt fillet phục vụ cho

chế biến chả hoặc các sản phẩm khác sử dụng phần thịt cá Phụ phẩm sau khithu hồi được xay nhuyễn và cân vào túi PE 100g, bảo quản trong tủ đông.

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu cơ bản được phân tích và đo đạc theo các phương pháp đượctổng hợp ở Bảng 3.1

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

không đổi theo phương pháp NMKL số

23-1991

mẫu rắn (%)

Phương pháp Soxhlet (AOAC 920.39)

(TVBN) (%)

Phương pháp Antona (1989)

formol – Hàm lượng TVBN

3.2.2 Phương pháp đo đạc và xử lý số liệu

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần Thông số thích hợplựa chọn từ kết quả của thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm kế tiếp.Kết quả của các thí nghiệm được thống kê và phân tích theo phần mềmthống kê Statgraphics Centurion 16.1, phân tích phương sai ANOVA, kiểmđịnh LSD để kết luận sự sai khác giữa các nghiệm thức

3.3 Nội dung nghiên cứu

Cá lóc được cân tổng khối lượng trước khi làm ngất, cắt tiết và xả máutrong nước (thời gian xả máu 5 phút để đảm bảo tách loại máu hoàn toàn) Cásau khi cắt tiết được chuyển sang đánh vảy Cá lóc sau khi được xử lý, fill etlấy thịt, tiến hành thu hồi đầu cá, mang, nắp mang, da và thịt vụn Phụ phẩmsau khi được thu hồi được cân, xác định khối lượng và để vào tủ mát trước khixay nhằm tránh tăng nhiệt độ cao khi xay, ảnh hưởng đến chất lượng phụphẩm Phụ phẩm sau khi xay sơ bộ được cân vào túi PE 100 gram, ép mỏng vàbảo quản trong tủ đông phục vụ cho quá trình nghiên cứu Tiến hành phân tíchthành phần protein tổng số, độ ẩm và lipid trong nguyên liệu phụ phẩm ở mỗilần làm cá khác nhau

Phụ phẩm được rã đông sau khi lấy ra, cân theo khối lượng thích hợp vớitừng thí nghiệm và được chứa vào bình tam giác 250 mL, bổ sung nước, muốitheo tỉ lệ nghiên cứu Gia nhiệt ở nhiệt độ 90°C trong 20 phút, quá trình gianhiệt cần đậy miệng bình tam giác bằng giấy bạc, sau đó làm nguội bằng nướcchảy tràn, sau đó bổ sung vi sinh theo các tỉ lệ nghiên cứu Dùng bông gòn vàvải sạch đậy miệng bình để giảm bớt sự lây nhiễm tạp chất khác và các vi sinhvật gây thối, nhưng vẫn chú ý độ thoáng bên trong bình đủ tạo oxy để vi sinh

vật Bacillus subtilis.Tiến hành ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng, sử dụng máy lắcvới tốc độ lắc được chọn là 130 vòng/ phút (Hình 3.1)

Hình 3.1 Ủ mẫu bằng máy lắc

3.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện ở Hình 3.2