Tiểu luận Các bước tạo GMO, GMF

CÁC BƯỚC CƠ BẢN1. Chuẩn bị gen mục tiêu2. Tạo vector tái tổ hợp3. Thực hiện kỹ thuật chuyển gen4. Sàng lọc tế bào chuyển gen5. Kiểm tra hoạt tính gen mới6. Thử nghiệm đánh giá an toàn7. Sản xuất, dán nhãn, lưu thông

Thực phẩm biến đổi gen

Đề tài 4: Các bước tạo GMO, GMF

Sinh viên thực hiện

(Nhóm 4) Hà Thị Ngọc Anh Nguyễn Thị Vân Cúc

CÁC BƯỚC CƠ BẢN

1 Chuẩn bị gen mục tiêu

1 Chuẩn bị gen mục tiêu

Các

bước Tách chiết Tinh sạch Tách dòng

Mục đích Lấy đoạn gen mục tiêu ra

khỏi tế bào sinh vật (tách lấy DNA, RNA)

Loại bỏ các thành phần khác để có DNA hoặc RNAm tinh khiết

Cắt lấy đoạn gen mục tiêu, tạo dòng tế bào mang gen đích mới  lưu trữ

Nguyên

tắc - Phương pháp vật lý (đồng hóa, đun nóng, ly tâm, siêu

âm…)

- Phương pháp hóa học (phá vỡ màng tế bào)

- Dùng hỗn hợp hóa chất, tách lớp, gạn lấy phần có gen mục tiêu

- Rửa và ly tâm lấy kết tủa (DNA, RNA)

Sử dụng enzym cắt đặc hiệugắn vào vector tách dòng phù hợp Có sự khác eukaryote và prokaryote

- Ly tâm ở tốc độ cao để DNA và RNA lắng

xuống đáy, gạn nước thu kết tủa

- cắt đoạn gen

- gắn vào vector tách dòng phù hợp

- Chuyển vào tế bào khả biến

- Tạo dòng mang gen đích mới  lưu trữ

1 Chuẩn bị gen mục tiêu

 Cấu trúc vector tách dòng:

- Phân tử DNA mạch kép, dạng vòng

- Kích thước nhỏ dễ vào tế bào

- Có các điểm cắt đặc hiệu của RE

- Cho phép cài các đoạn DNA lạ

- Có trình tự tái bản ori

- Có gen chỉ thị (kháng sinh, màu)

 Tiến hành tách dòng gen mục tiêu:

prokaryote eukaryote

Chỉ cần tách đoạn gen mục tiêu từ DNA Có thể phải lấy RNA

Chỉ cần sao chép đoạn gen mục tiêu, cắt

nhờ các enzyme Cần phải cắt bỏ intron sau đó thực hiện phiên mã ngược

2 Tạo vector tái tổ hợp

- Vector là các đoạn DNA có kích thước nhỏ cho phép cài (gắn)

các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ mà không gây biến đổi hệ gen của tế bào chủ.

- Vetor tái tổ hợp là vector được tạo thành khi gắn gene cần

chuyển vào vector biểu hiện sẵn có bởi các loại enzyme cắt, nối.

- Vector chuyển gene: Là phân tử ADN có khả năng mang được

gen cần thiết, thường có dạng vòng và có một số đặc tính:

• Có điểm khởi đầu sao chép (origin of replication) để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào

• Có các đoạn trình tự nhận biết cho enzyme giới hạn để tạo nơi lắp ráp cho các đoạn gen lạ

• Có trình tự khởi điểm (promoter)

• Có dấu chuẩn chọn lọc cho phép dễ dàng phát hiện nhận biết chúng trong tế bào chủ nhận

Một số plasmid

 Enzyme cắt giới hạn:

Dựa vào khả năng nhận biết và cắt, chia làm 3 nhóm:

+ Nhóm 1: Enzym nhận biết vị trí đặc hiệu, cắt phân tử DNA ở cách

– Có thể ghép nối đầu 2 đầu bằng hoặc đầu lệch

– Uphổ biến là enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4.

– Thường có sản phẩm thương mạ i

– Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thời gian ngắn (5 -10 phút), hoặc nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài

(qua đêm)

Sự hình thành vector tái tổ hợp

Gen gắn vào giữa

promotor và terminator nhờ đoạn tương đồng

3 Thực hiện chuyển gen

Chuyển gen là tập hợp nhiều kỹ thuật

khác nhau nhằm gắn một gen mới

(một đoạn DNA) vào bộ gen của một

tế bào hoặc một cá thể sinh vật

4 Sàng lọc tế bào chuyển gen

Dựa vào chỉ thị kháng sinh Dựa vào gen chỉ thị màu phương pháp lai phân tử

Nguyên

tắc - Gen kháng chất kháng sinh có trong vecto tái

tổ hợp, MT dinh dưỡng

bổ sung các chất kháng sinh tương ứng để nuôi cấy tế bào

- tế bào chứa vecto tái tổ hợp tồn tại và phát triển được; tế bào không có vecto tái tổ hợp không phát triển được.

- Gen chỉ thị (Reporter genes) là các gen có trách nhiệm thông báo là gen cần biến nạp đã gắn vào

hệ gen của sinh vật và bắt đầu hoạt động hay chưa.

- Gen chỉ thị thường dùng:

ß-galactosidase, luciferase, Alkaline Phosphatase, GUS, NPT, CAT, GFP, FRET,…

- Tiến hành phản ứng lai phân tử:

Nuôi cấy  để khuẩn lạc in

dấu trên màng lai  lai phân tử giữa màng lai với

mẫu dò đánh dấu phóng

xạ (mẫu dò có trình tự tương ứng với đoạn đặc

hiệu gen tái tổ hợp)  rửa

để loại bỏ các mẫu không được lai)

- thực hiện phóng xạ tự ghi để lấy kết quả

Ưu đơn giản, dễ sử dụng đơn giản, dễ sử dụng độ chính xác cao

Nhược

điểm Độ chính xác ở mức độ tương đối Độ chính xác ở mức độ tương đối kỹ thuật tương đối phức tạp, tốn kém và đòi hỏi

các thiết bị chuyên dụng

Sàng lọc gen biến nạp ở Ngô

Chọn lọc các tế bào đã được chuyển gen bằng chỉ thị kháng sinh

Ví dụ: Sàng lọc gen biến nạp ở Ngô

Chọn lọc các tế bào đã được chuyển gen bằng gen chỉ thị

5 Kiểm tra hoạt tính gen mới

Phương pháp phát hiện

protein

Chọn lọc cá thể mang gen chuyển

PCR Giải trình tự gen

Chạy PCR với cặp

mồi đặc hiệu cho

gen đã đưa vào

Phát hiện sản phẩm

PCR bằng điện di

Giải trình tự khu vực mang đoạn chèn xem có thay đổi về cấu trúc, trình tự gen không

Gen đưa vào sẽ tạo protein mới, cần xác định sự có mặt của protein mới và hàm lượng của nó

Nuôi cấy trong môi trường chọn lọc về tính trạng đưa vào thể chuyển gen

đoạn gen đưa vào

hoặc bị biến đổi

Trình tự gen giải ra

ở thể chuyển gen phải giống với trình

tự gen mục tiêu đưa vào

Định tính và định lượng protein đó để xác định hoạt tính gen mới của thể chuyển gen

Chọn các cá thể có biểu hiện đặc tính cao nhất để tiếp tục lai và tạo thành sản phẩm thương mại

6 Thử nghiệm, đánh giá an toàn

• Bộ Tài nguyên và Môi trường cấp, thu hồi Giấy chứng nhận an toàn sinh học.

7 Sản xuất, dán nhãn, lưu thông

 Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh sinh vật biến đổi gen, sản phẩm của sinh vật biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm phải tuân thủ các điều kiện sau đây:

- Sinh vật biến đổi gen hoặc sản phẩm của sinh vật biến đổi gen

• được cấp Giấy xác nhận đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm;

• có tên trong Danh mục sinh vật biến đổi gen được cấp Giấy xác nhận đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm;

• trừ trường hợp quy định tại Điều 29 của Nghị định 69/2010/NĐ-CP

- Tuân thủ các quy định của pháp luật về sản xuất, kinh doanh thực phẩm

 Xin cấp Giấy xác nhận sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử

dụng làm thực phẩm

 Dãn nhãn theo quy định đối với thực phẩm biến đổi gen

Thể hiện các thông tin liên quan đến sinh vật biến đổi gen trên nhãn hàng hóa

Hướng dẫn ghi nhãn đối với thực phẩm biến đổi gen bao gói sẵn

Cách thức ghi nhãn Miễn ghi nhãn bắt buộc đối với

một số thực phẩm Khắc phục, sửa chữa nhãn

- Ghi bằng tiếng Việt cụm từ

“biến đổi gen” bên cạnh tên

của thành phần nguyên liệu

biến đổi gen kèm theo hàm

lượng trên nhãn sản phẩm.

- Đối với những sản phẩm có

diện tích để ghi nhãn nhỏ hơn

10cm 2   thì trên nhãn bắt buộc

phải có tên hàng hóa và cụm từ

“biến đổi gen”; những nội dung

bắt buộc còn lại không thể hiện

trên nhãn thì phải được ghi

trong tài liệu kèm theo hàng

hóa.

- Thực phẩm mang theo người nhập cảnh để tiêu dùng cá nhân trong định mức được miễn thuế nhập khẩu; thực phẩm trong túi ngoại giao, túi lãnh sự; thực phẩm tạm nhập tái xuất, thực phẩm quá cảnh, chuyển khẩu; thực phẩm gửi kho ngoại quan; thực phẩm là mẫu thử nghiệm hoặc nghiên cứu; là mẫu trưng bày hội chợ, triển lãm;

- Nguyên liệu, phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm, bao bì chứa đựng thực phẩm, nhập khẩu về để sản xuất nội bộ không bán ra thị trường, chỉ vận chuyển nội

bộ giữa các kho từ tỉnh này qua tỉnh khác thuộc cùng một hệ thống trong doanh nghiệp.

- Tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh, nhập khẩu phải tự thực hiện việc khắc phục, sửa chữa.

- Bổ sung cụm từ “biến đổi gen” theo quy định tại Thông tư liên tịch này nhưng không được che lấp những thông tin bắt buộc theo quy định của pháp luật về ghi nhãn thực phẩm.

- Việc khắc phục, sửa chữa nội dung không phù hợp, ghi thiếu trên nhãn thực phẩm phải bảo đảm không phục hồi lại được như trước

GIỐNG NGÔ BIẾN ĐỔI GEN GA21

KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ

Mô tả sơ bộ quy trình

Thông tin gen chuyển

• Trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS giống đến 99,3%

so với protein EPSPS là enzyme quan trọng trong con đường axit shikimic và enzyme này được tìm thấy trong tự nhiên ở tất cả thực vật, nấm, vi khuẩn

• So sánh trình tự chuỗi axit amin của protein mEPSPS với trình

tự của các protein độc tố trong ngân hàng dữ liệu thông tin cho thấy mEPSPS không tương đồng với bất kỳ độc tố đã biết nào.

Cấu trúc gen chuyển

Primer and probe

Vector sử dụng

Các thành phần trong vùng backbone của

vecto

Kích thước và chức năng của mỗi vùng trong

đoạn T-DNA

Chuyển gen bằng sung bắn gen

Kết quả sau chuyển gen

Biểu hiện protein biến đổi (mEPSPS)

trong cây ngô GA21

Bảng 1: nồng độ mEPSPS trong lá ngô từ ba thế hệ lai hồi giao

 Protein mEPSPS có sự ổn định qua nhiều thế hệ.

Các đặc điểm và tính trạng tương tự giữa ngô chuyển gen GA21 và ngô không chuyển gen

Tính trạng khác biệt giữa ngô chuyển gen GA21

và ngô không chuyển gen

TÀI LIỆU THAM KHẢO

học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di

truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen”

45/2015/TTLT-BNNPTNT-BKHCN “ Hướng dẫn ghi nhãn đối với thực

phẩm biến đổi gen bao gói sẵn”

Khuất Hữu Thanh, Viện CNSH-CNTP,

ĐHBKHN.