XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI các VITAMIN b1, b2, b6, b9 TRONG sản PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CƠNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ CÚC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CƠNG THỨC CHO TRẺ EM BẰNG HPLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng ThS Lê Hồng Dũng Nơi thực hiện: Viện Dinh dưỡng Quốc gia HÀ NỘI – 2015 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép đƣợc bày tỏ lịng biết ơn chân thành với ngƣời dạy dỗ, hƣớng dẫn, dìu dắt giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thạc sĩ Nguyễn Lâm Hồng – Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích - độc chất thạc sĩ Lê Hồng Dũng – Trƣởng phịng khoa Hóa thực phẩm, Viện Dinh dƣỡng, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết, giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Đồng thời, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thanh Nga, Nguyễn Thúy Dung, anh Hồng Trung Hiếu, chị Bùi Thị Thanh Xuân – cán khoa Hóa thực phẩm, Viện dinh dƣỡng quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, thầy cô giáo, Bộ mơn Hóa phân tích – độc chất, anh chị Viện Dinh dƣỡng Quốc Gia giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, vô biết ơn gia đình, bạn bè ngƣời ln động viên, khích lệ trợ giúp cho mặt để tơi có đƣợc kết nhƣ ngày hơm Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Lê Thị Cúc WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Vài nét vitamin B1, B2, B6, B9 1.1.2 Một số phƣơng pháp định lƣợng vitamin B1, B2, B6, B9 thực phẩm 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên tắc phân loại 1.2.2 Các thông số đặc trƣng 1.2.3 Các kỹ thuật định lƣợng HPLC 11 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 13 2.1.1 Nguyên vật liệu 13 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, máy móc 13 2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 14 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em phƣơng pháp HPLC 14 2.3 2.2.2 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng 14 2.2.3 Ứng dụng 15 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.3.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em phƣơng pháp HPLC 15 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 2.3.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 15 2.3.3 Ứng dụng 17 2.3.4 Tính tốn xử lý số liệu 18 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 19 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 19 3.1.1 Lựa chọn mẫu 19 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 19 3.1.3 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 24 3.1.4 Quy trình phân tích vitamin B1, B2, B6, B9 sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em 28 3.2 3.3 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 30 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 30 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 31 3.2.3 Độ chọn lọc 32 3.2.4 Khoảng tuyến tính 33 3.2.5 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 37 3.2.6 Độ lặp lại, độ xác trung gian 38 3.2.7 Độ thu hồi 40 3.2.8 Độ ổn định vitamin dung dịch chạy sắc ký 42 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B2, B6, B9 TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM DINH DƢỠNG CÔNG THỨC CHO TRẺ EM TRÊN THỊ TRƢỜNG 43 BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN 48 ĐỀ XUẤT 51 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantification) MeOH: Methanol PAD: Detector mảng diode (Photodiode array detector) QC Mẫu kiểm chứng (Quality Control) RSD (%): Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TCA: Axit Trichloroacetic UPLCMS/MS: Sắc ký lỏng siêu hiệu cao ghép khối phổ (Ultra high performance chromatography – Mass spectrometry) UV: Tử ngoại (Ultraviolet) v/v Thể tích/thể tích (volume/volume) w/v Khối lƣợng/thể tích (weight/volume) WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B thực phẩm phƣơng pháp HPLC 3.1 Nồng độ vitamin với quy trình 20 3.2 Nồng độ vitamin thể tích TCA 20% khác 21 3.3 Nồng độ vitamin với cách lắc khác 23 3.4 Nồng độ vitamin với thời gian siêu âm khác 23 3.5 Ba chƣơng trình gradient khảo sát 25 3.6 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký 31 3.7 Kết khảo sát độ tuyến tính vitamin B1, B2, B6, B9 34 3.8 Kết thẩm định LOD, LOQ vitamin B1 37 3.9 Kết thẩm định LOD, LOQ vitamin B2, B6, B9 38 3.10 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp 38 3.11 Kết đánh giá độ xác khác ngày phƣơng pháp 39 3.12 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ thấp, trung bình cao 40 3.13 Kết thẩm định độ thu hồi phƣơng pháp với vitamin B1 41 3.14 Kết thẩm định độ thu hồi phƣơng pháp với vitamin B2, B6, B9 42 3.15 Kết độ ổn định vitamin 43 3.16 Hàm lƣợng vitamin B1 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng 44 3.17 Hàm lƣợng vitamin B2 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng 44 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 3.18 Hàm lƣợng vitamin B6 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng 45 3.19 Hàm lƣợng vitamin B9 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng 45 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Cơng thức cấu tạo vitamin B1 1.2 Công thức cấu tạo vitamin B2 1.3 Công thức cấu tạo vitamin B6 1.4 Công thức cấu tạo vitamin B9 3.1 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C8 (tại 290nm) 24 3.2 Sắc ký đồ mẫu QC với cột C18 (tại 290nm) 25 3.3 Sắc ký đồ dung dịch hỗn hợp chuẩn bƣớc sóng 267nm chƣơng trình gradient 26 3.4 Phổ hấp thụ UV vitamin 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng bƣớc sóng 246nm (đánh giá tính chọn lọc) 32 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp bƣớc sóng 246nm 33 3.7 Sắc ký đồ mẫu sữa bột Dutch Lady nguyên kem bƣớc sóng 246nm 33 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan tuyến tính diện tích pic nồng độ vitamin B1, B2, B6, B9 36 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM ĐẶT VẤN ĐỀ Các vitamin có vai trị cần thiết sức khỏe ngƣời, đặc biệt khả tăng trƣởng, phát triển toàn diện trẻ nhỏ Trong số 13 loại vitamin quan trọng, vitamin nhóm B tan nƣớc nhƣ: thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), pyridoxin (B6 ), cyanocobamine (B12) quan trọng cho trình trao đổi chất, điều hòa hoạt động quan, đặc biệt quan hoàn thiện chức năng; hỗ trợ tăng trƣởng thể chất phát triển tinh thần, trí tuệ; cung cấp lƣợng tổng hợp tế bào máu Rất nhiều trƣờng hợp bệnh lý chế độ dinh dƣỡng dẫn tới thiếu viatmin B, gây ảnh hƣởng xấu cho sức khỏe Ngày nay, thị trƣờng có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin nhƣ thực phẩm công thức sữa, bột dinh dƣỡng thuốc dƣới dạng viên vitamin B đơn hay hỗn hợp vitamin Trong đó, thực phẩm công thức thức ăn bổ sung quan trọng cho trẻ nhỏ Hiện Bộ Y Tế ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia sản phẩm dinh dƣỡng công thức [3], [4], [5] quy định hàm lƣợng nhƣ phƣơng pháp phân tích chất dinh dƣỡng, bao gồm vitamin nhóm B Việc xác định xác hàm lƣợng vitamin đƣợc bổ sung có ý nghĩa vấn đề đảm bảo quyền lợi sức khỏe ngƣời tiêu dùng Xuất phát từ nhu cầu thực tế để kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm phục vụ nghiên cứu dinh dƣỡng tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em HPLC” với mục tiêu chính: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 loại sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em phƣơng pháp HPLC Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM  Kết thẩm định độ thu hồi phƣơng pháp với vitamin B2 Cc Cm Ct Hệ số thu Hệ số thu hồi (mg/100g) (mg/100g) (mg/100g) hồi (%) TB (%) 0,500 0,885 1,313 85,7 0,500 0,885 1,368 96,5 Nạp 0,500 0,885 1,351 93,2 chuẩn 0,500 0,885 1,348 92,7 nồng 0,500 0,885 1,341 91,2 độ 0,500 0,885 1,406 104,2 thấp 0,500 0,885 1,375 98,1 0,500 0,885 1,347 92,5 0,500 0,885 1,403 103,6 0,500 0,885 1,393 101,5 1,001 0,885 1,774 88,9 1,001 0,885 1,787 90,2 Nạp 1,001 0,885 1,793 90,8 chuẩn 1,001 0,885 1,925 104,0 nồng 1,001 0,885 1,916 103,0 B2 độ 1,001 0,885 1,948 106,2 trung 1,001 0,885 1,850 96,5 bình 1,001 0,885 1,928 104,2 1,001 0,885 1,841 95,6 1,001 0,885 1,797 91,2 2,502 0,885 3,151 90,6 Nạp 2,502 0,885 3,168 91,3 chuẩn 2,502 0,885 3,086 88,0 95,9 97,1 91,2 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM nồng 2,502 0,885 3,236 94,0 độ 2,502 0,885 3,164 91,1 cao 2,502 0,885 3,153 90,7 2,502 0,885 3,183 91,9 2,502 0,885 3,240 94,1 2,502 0,885 3,169 91,3 2,502 0,885 3,113 89,1  Kết thẩm định độ thu hồi phƣơng pháp với vitamin B6 Cc Cm Ct Hệ số thu Hệ số thu hồi (mg/100g) (mg/100g) (mg/100g) hồi (%) TB (%) 0,122 0,245 0,365 98,9 0,122 0,245 0,361 95,5 Nạp 0,122 0,245 0,366 99,5 chuẩn 0,122 0,245 0,366 99,0 nồng 0,122 0,245 0,366 99,2 độ 0,122 0,245 0,369 101,4 thấp 0,122 0,245 0,362 96,1 0,122 0,245 0,361 95,5 0,122 0,245 0,360 94,2 0,122 0,245 0,365 98,8 0,244 0,245 0,508 107,8 Nạp 0,244 0,245 0,496 102,9 chuẩn 0,244 0,245 0,486 98,7 nồng 0,244 0,245 0,492 101,3 độ 0,244 0,245 0,500 104,5 B6 97,8 103,3 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM trung 0,244 0,245 0,496 103,1 bình 0,244 0,245 0,491 100,8 0,244 0,245 0,501 105,0 0,244 0,245 0,512 109,7 0,244 0,245 0,486 98,8 0,730 0,245 0,900 89,6 0,730 0,245 0,972 99,5 Nạp 0,730 0,245 0,972 99,5 chuẩn 0,730 0,245 0,922 92,6 nồng 0,730 0,245 0,938 94,9 độ 0,730 0,245 0,924 92,9 0,730 0,245 0,953 97,0 0,730 0,245 0,984 101,1 0,730 0,245 0,946 96,0 0,730 0,245 0,970 99,2 cao 96,2  Kết thẩm định độ thu hồi phƣơng pháp với vitamin B9 Cc Cm Ct Hệ số thu Hệ số thu hồi (mg/100g) (mg/100g) (mg/100g) hồi (%) TB (%) 0,033 0,061 0,088 83,7 Nạp 0,033 0,061 0,092 94,0 chuẩn 0,033 0,061 0,090 87,7 nồng 0,033 0,061 0,092 94,7 độ 0,033 0,061 0,088 83,0 thấp 0,033 0,061 0,092 94.3 0,033 0,061 0,090 96,0 B9 91,2 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 0,033 0,061 0,092 94,9 0,033 0,061 0,090 88,5 0,033 0,061 0,092 94,8 0,066 0,061 0,116 82,9 0,066 0,061 0,117 84,9 Nạp 0,066 0,061 0,122 91,7 chuẩn 0,066 0,061 0,121 90,2 nồng 0,066 0,061 0,123 94,3 độ 0,066 0,061 0,117 84,6 trung 0,066 0,061 0,122 93,1 bình 0,066 0,061 0,121 90,4 0,066 0,061 0,118 86,1 0,066 0,061 0,118 86,3 0,186 0,061 0,217 83,9 0,186 0,061 0,222 86,6 Nạp 0,186 0,061 0,218 84,8 chuẩn 0,186 0,061 0,217 84,2 nồng 0,186 0,061 0,215 83,1 độ 0,186 0,061 0,214 82,5 0,186 0,061 0,218 84,8 0,186 0,061 0,219 85,4 0,186 0,061 0,218 84,4 0,186 0,061 0,214 82,3 cao 88,5 84,2 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM  Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC: TT Hàm lƣợng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi (%) 100 100% 98-102 ≥ 10 10-1 10% 98-102 ≥1 10-2 1% 97-103 ≥ 0,1 10-3 0,1% 95-105 0,01 10-4 100 ppm 90-107 0,001 10-5 10 ppm 80-110 0,0001 10-6 ppm 80-110 0,00001 10-7 100 ppb 80-110 0,000001 10-8 10 ppb 60-115 10 0,0000001 10-9 ppb 40-120 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 2.7 SẮC KÝ ĐỒ XÁC ĐỊNH ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CÁC VITAMIN TRONG DUNG DỊCH CHẠY SẮC KÝ WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM PHỤ LỤC MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ CỦA MẪU THỊ TRƢỜNG WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ... vitamin B1, B2, B6, B9 sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em HPLC? ?? với mục tiêu chính: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 loại sản phẩm dinh. .. vitamin B1, B2, B6, B9 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 2.3.1 Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời vitamin nhóm B gồm B1, B2, B6, B9 loại sản. .. phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em phƣơng pháp HPLC Ứng dụng định lƣợng đồng thời vitamin B1, B2, B6, B9 số sản phẩm dinh dƣỡng công thức cho trẻ em thị trƣờng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON