Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

1. Bình chứa dung môi giải ly cột Làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh. Cấu tạo: Nắp bảo vệ  tránh bụi rơi vào bình. Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc bằng kim loại  lọc dung môi và giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng.

Trang 1

GVHD: Th.S Lưu Huỳnh Vạn Long

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Phương Uyên

Nguyễn Hoàng Yến

Lê Huỳnh Phương Thảo

Lê Phạm Huynh

Trang 2

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

Trang 3

2 Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC

3 Các loại đầu dò trong HPLC

4 Điều chế các hợp chất cần phân tích

1 Các bộ phận của máy HPLC

Trang 5

1: Bình chứa pha động.

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.

Trang 6

Trang 7

- Cần phải loại bỏ phần không khí đã hòa tan vào dung môi trước

khi lắp bình dung môi vào vị trí  khử bọt khí

- Làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh

+ Nắp bảo vệ  tránh bụi rơi vào bình

+ Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc bằng kim loại  lọc dung môi và giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng

Trang 8

2 Máy bơm

+ Áp suất: 7.000 psi (48,3 Mpa)

- Dùng để bơm dung môi (pha động) đi xuyên ngang qua một pha tĩnh (được nhồi chặt bởi những hạt rất mịn)

- Bơm được cấu tạo bằng lọa chất liệu chịu được dung môi hữu cơ và các dung dịch đệm

Trang 9

3 Cột sắc ký (và cột bảo vệ)

- Trước khi pha động vào cột phân tích cần phải cho qua cột bảo vệ  lọc bỏ những chất tạp bẩn còn sót lại

Trang 10

4 Bộ phận chích mẫu vào máy

- Khi máy đang hoạt động đều, pha động lỏng đi xuyên ngang qua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao

Trang 12

5 Đầu dò

- Dùng để theo dõi dòng chảy của dung môi giải ly  khi nào các hợp chất đi ra khỏi cột

- Một số tiêu chuẩn lý tưởng của đầu dò HPLC:

+ Độ bền cao, không làm hư hại mẫu phân tích

+ Độ nhạy cao, cho kết quả có tính lặp lại

+ Cho đáp ứng tương đồng với những chất phân tích có cấu trúc hóa học tương đồng

+ Không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ, áp suất

+ Thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc dòng chảy của dung môi giải ly

Trang 14

Trang 15

Có nhiều loại pha tĩnh để nhồi cột HPLC: pha thường, pha tạo nối, pha đảo, trao đổi ion, sắc ký gel,…

Cột pha thường, pha đảo, pha tạo nối

Trọng lượng phân tử nhỏ(<2.000) Không có mang điện tích Có tính phân cực hoặc không Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

Cột trao đổi ion Trọng lượng phân tử nhỏ(<2.000) Phân tử mang điện tích Hòa tan

trong nước.

Cột sắc ký gel

Trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn Không mang điện tích Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

Trang 16

Trang 17

 Cơ chế hấp thu là tương tác giữa nhóm silanol của silica gel với nhóm chức phân cực của phân tử chất tan.

sắc ký lỏng-lỏng pha thường và sắc ký lỏng-lỏng pha đảo

 Điểm bất tiện của sắc ký lỏng-lỏng là dung môi giải ly phải bão hòa với pha tĩnh, không thể áp dụng kỹ thuật

giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần

Trang 18

2.Pha tạo nối :

Ưu điểm :

 Phân tử phân cực,không phân cực, loại ion, khả năng ion hóa…đều có thể tách chỉ bởi một cột sắc ký và với pha động phù hợp

 Chế tạo nhiều loại pha tĩnh với độ phân cực khác nhau

 Lựa chọn nhiều loại dung môi giải ly

 Dung môi giải ly là nước kết hợp với dung môi hữu cơ

 Áp dụng kỹ thuật giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần mà không làm hư hại pha tĩnh

 Hệ thống đạt sự cân bằng nhanh và không để lại các hệ quả xấu

Trang 19

Nhược điểm :

*Các loại pha tạo nối :

Trang 20

2.1.Nguyên liệu tổng hợp pha nối:

- Giao đoạn thông dụng nhất là sử dụng clorur tionyl để biến nhóm silanol thành clorosilan.

- Tiếp đó, cho nhóm clorosilan + amin để tạo alkyl aminosilan

- Nguyên liệu được tạo thành bằng cách cho nhóm silanol bề mặt tác dụng với organo-clorosilan giúp

nối pha tĩnh vào chất mang, ngang qua nối siloxan(Si-O-Si).

Trang 22

 Silan chỉ nối duy nhất một nhóm clor,phản ứng sẽ tạo ra một pha tĩnh mang những nhóm dimetylsilan một cách đồng đều và pha tĩnh như thế sẽ bị che phủ bởi 8-12% carbon.

 Sử dụng diclorosilan hoặc triclorosilan, nghĩa là Si nối với hai hoặc ba nhóm clor, sẽ có phản ứng tạo nối ngang tạo nên một pha tĩnh có mức độ tạo nối không thể xác định được.

Trang 23

Hình 5

Trang 24

2.2 Cơ chế bắt giữ chất của pha tạo nối:

tượng tín hiệu mũi trên sắc ký đồ kéo đuôi,tạo vệt dài.

Trang 25

 Việc lựa chọn dây alkyl dài hoặc ngắn : một nguyên tắc tổng quát là các hợp chất tan có tính phân cực được tách tốt hơn nhờ vào pha tĩnh có dây alkyl ngắn và chất tan có tính kém phân cực được tách tốt hơn nhờ vào pha tĩnh có dây alkyl dài.

 Pha tĩnh nitril thường để tách các porphyrin Các pha tĩnh aminoalkyl thường được sử dụng để tách các loại đường và peptid, không nên sử dụng pha này để tách các hợp chất carbonyl vì hợp chất này sẽ tạo thành base Schiff với pha tĩnh

Trang 26

2.3 Pha tĩnh thủ tính :

 Hoạt tính sinh học tùy thuộc vào hóa lập thể, nhiều cặp đối phân cho thấy chúng có tính trái ngược nhau

 Các pha tĩnh HPLC vẫn không thể tách được hỗn hợp gồm hai đối phân vì có tính chất vật lý và hóa học giống hệt

nhau

 Trong HPLC, tác chất Marfey được sử dụng để tạo hỗn hợp suyên lập thể phân với các hợp chất amin hoặc acid

amin thủ tính

Trang 27

2.4 Các loại pha tĩnh khác :

chức hoạt động như cho sắc ký gel.

methanol.

Trang 28

Trang 29

3.1 Đầu dò đo hấp phụ tia tử ngoại

phân tích

nhau Bước sóng thường dùng là 245 nm

Trang 30

Ưu điểm:

Không nhạy với nhiệt độ, có sự đáp ứng tuyến tính giữa sự hấp thu UV với lượng mẫu chất

Nhược điểm:

Khá kén loại hợp chất phân tích vì một số hợp chất hấp thu UV kém

 Loại đầu dò sử dụng nhiều nhất trong máy HPLC

Trang 31

Nguyên tắc hoạt động:

• Lúc đầu, pha động ra khỏi cột, sắc

kí đồ vạch một đường thẳng( đường nền với mức hấp thu =0)

• Khi dung môi có chất phân tích, chất phân tích sẽ hấp thu UV làm ống quang điện xuất hiện 1 pic trên sắc kí đồ

Trang 32

3.2 Đầu dò mạng diod quang

phép quét liên tục quang phổ

hấp thu của chất phân tích có

mặt trong dòng chảy dung môi

giải ly, không cần làm ngưng

dòng chảy

Trang 34

3.3 Đầu dò phát huỳnh quang

 So với đầu dò hấp thu tử ngoại, đầu dò huỳnh quang nhạy hơn, có thể phát hiện hợp chất hiện diện ở hàm lượng 1ng/ml

 Đầu dò huỳnh quang dựa vào tính chất căn bản của hợp chất phát huỳnh quang là hấp thụ bức xạ của một bước sóng

và phát ra bức xạ có bước song dài hơn có tính phát quang

 Không thông dụng cho máy HPLC vì tính chọn lọc cao là chỉ cho mũi tín hiệu trên sắc kí đồ khi mẫu là hợp chất huỳnh quang

Trang 35

• Khi pha động chứa hợp chất giải ly vừa ra khỏi cột, chỉ số khúc xạ ngăn chứa sẽ thay đổi, tia sáng lệch, tia khúc xạ chạm mặt phẳng nhạy sáng tại vị trí khác

Trang 36

chất điện ly Lực ion có giá trị cao làm giảm độ nhạy của đầu dòđầu dò bị ảnh hưởng khi có sự thay đổi thành phần hóa học của dòng chảy

triệt ion để loại chất điện ly nền

Trang 37

• Khi pha động chứa hợp chất giải ly vừa ra khỏi cột, chỉ số khúc xạ ngăn chứa sẽ thay đổi, tia sáng lệch, tia khúc xạ chạm mặt phẳng nhạy sáng tại vị trí khác

Trang 38

Ưu điểm:

trường hợp một dung dịch chứa hỗn hợp hợp chất mà không ghi được tín hiệu nào

Nhược điểm:

Trang 39

Bộ triệt là một cột được nhồi bởi một loại nhựa trao đổi ion, loại bỏ các ion ra khỏi dòng chảy pha động

Bộ triệt phải có độ chọn lọc, chỉ loại bỏ 1 số ion trong pha động

Máy đo dộ dẫn điện là buồng chứa mẫu có dung tích

là 1µl,theo dõi Na+,NH4+,K+ và halogenua X-,NO3-,SO42- Máy là 2 điện cực, dán lên buồng chứa mẫu và cầu Wheatstone có dòng điện 1 chiều

3.5 Đầu dò đo độ dẫn điện

Trang 40

 Các loại hợp chất ion thường được tách khi sử dụng dung dịch giải ly chủ yếu là nước có chứa các chất điện ly Lực ion có giá trị cao làm giảm độ nhạy của đầu dòđầu dò bị ảnh hưởng khi có sự thay đổi thành phần hóa học của dòng chảy

 Với bộ triệt, khó áp dụng kĩ thuật giải ly tăng dần độ phân cách tuyến tính khắc phục: sử dụng bộ triệt ion để loại chất điện ly nền

Trang 42

Nguyên tắc hoạt động:

làm việc,điện cực so sánh, điện cực phụ đều đặt vào dòng chảy hoặc áp sát vào vách ngăn của dòng chảy

Điện cực làm việc làm bằng thủy tinh trong suốt

Điện cực so sánh làm bằng AgClĐiện cực phụ làm bằng thép không gỉ,điện cực đo được làm phân cực để gây sự oxi hóa cho hỗn hợp hợp chất được giải ly

Trang 44

20µl; đoạn đường mà dòng chảy cần chảy ngang là 2-3mm

- Nếu pha động là dung môi hữu cơ  cửa sổ để ghi phổ IR được làm bằng NaCl hoặc NaBr

- Nếu pha động là dung môi hữu cơ và nước  cửa sổ làm bằng polytetrafluoroatylen (PTFE) và polyetylen.

Trang 45

3.8 Đầu dò LC-MS

- Máy khối phổ (MS) hoạt động trong điều kiện: p thấp (chân không sâu), to cao, lượng mẫu phân tích rất nhỏ, chất khảo sát ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µl/ phút)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoạt động trong điều kiện: p cao, to thấp, lượng mẫu chất lớn, chất khảo sát

ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn (vài ml/ phút)

Trang 46

Sơ đồ tổng quát máy sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS)

Phạm vi

để áp dụng LC-MS với các giao diện

Trang 47

3.8.1 Giao diện tia nhiệt (Thermospray interface)

 Giao diện này cho phép đưa trực tiếp, liên tục dòng chảy của pha động vào bộ phận ion hóa của máy khối phổ

 Sự ion hóa cao nếu dung môi pha động của HPLC chứa thêm chất điện ly có tính bay hơi

 Hệ thống này có thể làm bốc hơi và ion hóa một cách ổn định một pha động có tính phân cực ở vận tốc dòng chảy 2ml/ phút

Trang 48

Mô tả nguyên tắc giao diện tia nhiệt và sắc ký đồ HPLC-MS sử dụng tia nhiệt

Trang 49

Giao diện ion hóa ở

áp suất khí quyển

trong máy HPLC-MS

3.8.2 Giao diện ion hóa ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization interface, APCI)

 Giao diện này giúp chịu được dòng chảy của pha động lên đến 2 ml/phút Vì vậy phù hợp với nhiều loại hợp chất có tính bay hơi và không bay hơi

Trang 50

3.8.3 Giao diện Phun ion (Electrospray interface, ESI)

Giao diện Phun ion là một cải tiến của loại giao diện ion hóa ở áp suất khí quyển

 Các dung môi phù hợp để phun sương là: etanol, metanol, isopropanol, acetonitril, aceton,…

 Các phân tử của hợp chất cần khảo sát phải biến đổi thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương

 Pha động và các chất phân tích phải có tính phân cực

Trang 51

Mô hình tổng quát sự tạo thành ion dương trong kỹ thuật ESI

Trang 52

Ưu điểm

 Có thể tạo ion dương hoặc ion âm tùy vào việc áp cực điện thế

Ít cho phân mảnh ion

 Thích hợp để phân tích các chất kém bền nhiệt, có tính phân cực, có khối lượng phân tử lớn

 Có thể tạo ra các ion đa điện tích

Nhược điểm

 Các hợp chất mà phân tử không có những nhóm chữa dễ dàng bị ion hóa thì phải tạo muối với Na, K, NH4+ hoặc ion âm với acetat



Trang 53

3.8.4 giao diện chùm tia hạt

Máy LC-MS với giao diện chùm tia hạt là một giao diện bổ sung cho kĩ thuật tia điện

Ưu điểm:

Loại hết dược dung môi để có thể thực hiện sự ion hóa bằng kĩ thuật EI hoặc CI

Có thể chịu được dòng chảy của máy với vận tốc 0,3-1 ml/phút

Chịu được bất kì loại dung môi pha động giải li của LC

Trang 54

Các acid amin là các phân tử rất phân cực, do vậy các phương pháp sắc ký thông thường như sắc ký lỏng hiệu năng cao kiểu phân bố pha đảo (RP-HPLC), hay sắc ký khí (GC) không thể thực hiện mà không tạo dẫn xuất

*Qui trình tạo dẫn xuất có một số mục đích như sau:

• Cải thiện hiệu quả và cách phân tích sắc ký của các hợp chất được quan tâm

Trang 55

4.1 Tạo dẫn xuất trước khi hợp chất đi vào hợp sắc ký

 Chất dẫn xuất có nhóm hàm sắc

 Các hợp chất có mang nhóm chức acid carboxylic tác dụng với bromur naptacyl để tạo thành dẫn xuất ester

Trang 56

 Chất dẫn xuất có tinh huỳnh quang để xác định các amini acid

một nhóm xuất iso-indol có mang nhóm thế thio

Trang 57

4.2 Tạo dẫn xuất sau khi hợp chất đã đi ra khỏi cột sắc ký

 Dung dịch giải ly cho tác dụng với dd ninhydrin sẽ tạ thành chất dẫn xuất là một amino bền (màu tím Ruhemann), có màu tím đậm

 Sự hấp thu ánh sáng của hợp chất sẽ được đầu dò UV ghi nhận tín hiệu theo thời gian

 Thời gian phân tích lâu 1-8 giờ



Trang 58

Thank You !

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	31,72 MB