Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC)

1. Bình chứa dung môi giải ly cột Làm bằng chất liệu trơ, thường là thủy tinh. Cấu tạo: Nắp bảo vệ  tránh bụi rơi vào bình. Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc bằng kim loại  lọc dung môi và giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng.

Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) GVHD: Th.S Lưu Huỳnh Vạn Long Sinh viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Phương Uyên Nguyễn Hoàng Yến Lê Huỳnh Phương Thảo Lê Phạm Huynh Nguyễn Thanh Thiện Vũ Thị Lan Anh Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC Các loại đầu dò HPLC Điều chế hợp chất cần phân tích 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Bình chứa dung môi giải ly cột Đầu dò Máy bơm Máy HPLC Bộ phận chích mẫu vào máy 10/6/17 Cột sắc ký (và cột bảo vệ) Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) 1: Bình chứa pha động 5: Cộ sắc ký (pha tĩnh) 2: Bộ phận khử khí 6: Đầu dò  3: Bơm cao áp 7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý liệu điều khiển hệ thống 4: Bộ phận tiêm mẫu 8: In liệu.  10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Bình chứa dung môi giải ly cột - Làm chất liệu trơ, thường thủy tinh - Cấu tạo: + Nắp bảo vệ  tránh bụi rơi vào bình + Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc kim loại  lọc dung môi giữ ống mặt thoáng chất lỏng - Cần phải loại bỏ phần không khí hòa tan vào dung môi trước lắp bình dung môi vào vị trí  khử bọt khí 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Máy bơm - 10/6/17 Là loại máy bơm đặc biệt có: + Áp suất: 7.000 psi (48,3 Mpa) + Vận tốc bơm: 0,5 - 4,0 ml/phút - Dùng để bơm dung môi (pha động) xuyên ngang qua pha tĩnh (được nhồi chặt hạt mịn) - Bơm cấu tạo lọa chất liệu chịu dung môi hữu dung dịch đệm Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Cột sắc ký (và cột bảo vệ) - Làm thép không gỉ: + Chiều dài: 10 – 25 cm + Đường kính trong: 2,1 – 4,6 mm - Tiêu chuẩn hạt nhồi cột: đường kính ≤ 5µm - Trước pha động vào cột phân tích cần phải cho qua cột bảo vệ  lọc bỏ chất tạp bẩn sót lại 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Bộ phận chích mẫu vào máy - Ống chứa mẫu van có cổng  định hướng dòng chảy pha động - Khi máy hoạt động đều, pha động lỏng xuyên ngang qua cột sắc ký nhờ máy bơm tạo áp suất cao 10/6/17 10 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC  Kích thước ngăn chứa pha động (để ghi nhận phổ IR dung dịch mẫu) tích nhỏ 20µl; đoạn đường mà dòng chảy cần chảy ngang 2-3mm  Nguyên liệu làm ngăn chứa: - Nếu pha động dung môi hữu  cửa sổ để ghi phổ IR làm NaCl NaBr - Nếu pha động dung môi hữu nước  cửa sổ làm polytetrafluoroatylen (PTFE) polyetylen 10/6/17 44 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC 3.8 Đầu dò LC-MS  Máy khối phổ không tương thích với hệ thống HPLC o - Máy khối phổ (MS) hoạt động điều kiện: p thấp (chân không sâu), t cao, lượng mẫu phân tích nhỏ, chất khảo sát thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ (vài µl/ phút) o - Máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) hoạt động điều kiện: p cao, t thấp, lượng mẫu chất lớn, chất khảo sát thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn (vài ml/ phút)  Để ghép máy HPLC với máy MS ta cần phải có trung gian giao diện 10/6/17 45 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC Sơ đồ tổng quát máy sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) Phạm vi để áp dụng LC-MS với giao diện khác 10/6/17 46 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC 3.8.1 Giao diện tia nhiệt (Thermospray interface)  Giao diện cho phép đưa trực tiếp, liên tục dòng chảy pha động vào phận ion hóa máy khối phổ  Sự ion hóa cao dung môi pha động HPLC chứa thêm chất điện ly có tính bay  Hệ thống làm bốc ion hóa cách ổn định pha động có tính phân cực vận tốc dòng chảy 2ml/ phút 10/6/17 47 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC Mô tả nguyên tắc giao diện tia nhiệt sắc ký đồ HPLC-MS sử dụng tia nhiệt 10/6/17 48 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC 3.8.2 Giao diện ion hóa áp suất khí (Atmospheric Pressure Ionization interface, APCI)  Giao diện giúp chịu dòng chảy pha động lên đến ml/phút Vì phù hợp với nhiều loại hợp chất có tính bay không bay Giao diện ion hóa áp suất khí máy HPLC-MS 49 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC 3.8.3 Giao diện Phun ion (Electrospray interface, ESI) Giao diện Phun ion cải tiến loại giao diện ion hóa áp suất khí Một số yêu cầu kỹ thuật ESI  Các dung môi phù hợp để phun sương là: etanol, metanol, isopropanol, acetonitril, aceton,…  Các phân tử hợp chất cần khảo sát phải biến đổi thành chất điện ly, tan dung dịch dùng để phun sương  10/6/17 Pha động chất phân tích phải có tính phân cực 50 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC Mô hình tổng quát tạo thành ion dương kỹ thuật ESI 10/6/17 51 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC Ưu điểm  Có thể tạo ion dương ion âm tùy vào việc áp cực điện Ít cho phân mảnh ion  Thích hợp để phân tích chất bền nhiệt, có tính phân cực, có khối lượng phân tử lớn  Có thể tạo ion đa điện tích Nhược điểm  + Các hợp chất mà phân tử nhóm chữa dễ dàng bị ion hóa phải tạo muối với Na, K, NH ion âm với acetat  10/6/17 Gây phức tạp cho việc giải đoán cấu trúc hóa học 52 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại đầu dò HPLC 3.8.4 giao diện chùm tia hạt Máy LC-MS với giao diện chùm tia hạt giao diện bổ sung cho kĩ thuật tia điện Ưu điểm: Loại hết dược dung môi để thực ion hóa kĩ thuật EI CI Có thể chịu dòng chảy máy với vận tốc 0,3-1 ml/phút Chịu loại dung môi pha động giải li LC 10/6/17 53 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Điều chế hợp chất cần phân tích Các acid amin phân tử phân cực, phương pháp sắc ký thông thường sắc ký lỏng hiệu cao kiểu phân bố pha đảo (RP-HPLC), hay sắc ký khí (GC) thực mà không tạo dẫn xuất *Qui trình tạo dẫn xuất có số mục đích sau: • Làm tăng khả bay • Giảm khả hoạt hóa • Cải thiện hiệu cách phân tích sắc ký hợp chất quan tâm 10/6/17 54 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Điều chế hợp chất cần phân tích 4.1 Tạo dẫn xuất trước hợp chất vào hợp sắc ký  Chất dẫn xuất có nhóm hàm sắc  Các hợp chất có mang nhóm chức acid carboxylic tác dụng với bromur naptacyl để tạo thành dẫn xuất ester 10/6/17 55 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Điều chế hợp chất cần phân tích Chất dẫn xuất có tinh huỳnh quang để xác định amini acid Amino acid tác dụng với orto-phtaldehyd với hiên diện mercaptan, nhiệt độ phòng tạo nhóm xuất iso-indol có mang nhóm thio 10/6/17 56 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Điều chế hợp chất cần phân tích 4.2 Tạo dẫn xuất sau hợp chất khỏi cột sắc ký  Chất dẫn xuất có nhóm hàm sắc  Hỗn hợp amino acid loại amino acid  Dung dịch giải ly cho tác dụng với dd ninhydrin tạ thành chất dẫn xuất amino bền (màu tím Ruhemann), có màu tím đậm  Sự hấp thu ánh sáng hợp chất đầu dò UV ghi nhận  Nhược điểm:  Phải có phân chuyên dụng gắn kèm với máy HPLC  Thời gian phân tích lâu 1-8  Qui trình nhạy 10/6/17 57 tín hiệu theo thời gian Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Thank You ! www.themegallery.com .. .Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) 10/6/17 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc ký HPLC Các loại... 12 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC 10/6/17 13 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các phận máy HPLC 10/6/17 14 Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) Các loại pha tĩnh để nhồi cột sắc. .. chất tan  Sắc ký lỏng- lỏng bao gồm pha động lỏng pha tĩnh lỏng  Sắc ký lỏng- lỏng phân loại thành : sắc ký lỏng- lỏng pha thường sắc ký lỏng- lỏng pha đảo  Điểm bất tiện sắc ký lỏng- lỏng dung