Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

Trình bày được nguyên tắc và ứng dụng của các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổiion, sắc ký loại cỡ.. • Trước khi sử dụng, cần lọc màng lọc 0,45µm và khử

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC)

MỤC TIÊU

1 Trình bày được nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của máy

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2 Trình bày được nguyên tắc và ứng dụng của các kỹ thuật

của HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổiion, sắc ký loại cỡ

3 Mô tả và trình bày nguyên tắc, cấu tạo và ứng dụng của

một số detector thường dùng trong máy HPLC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Pha động Lỏng

Pha tĩnh SẮC KÝ LỎNG

High Performance Liquid Chromatography

Các bộ phận của máy HPLC

Bình chứa dung môi giải ly cột

• Có 4 bình dung môi (đường dung môi) → rửa giải theo tỷ lệ

• Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh,

có cái nắp bảo vệ, nắp có lỗ hở thông với khí trời

• Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn một nútlọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và giữ ống luôn

ở dưới mặt thoáng của chất lỏng

• Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khíhoà tan trong pha động, gọi là khử bọt khí (degassing: chạysiêu âm, sục khí trơ như heli )

• Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được điều khiểnbằng hệ thống điều khiển.

• Có hai kiểu chương trình dung môi

Dung môi dùng cho HPLC

Có hai kiểu sử dụng pha động trong việc giải ly:

• Giải ly đơn nồng độ (đẳng dòng - isocratic elution)

• Giải ly nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution):

Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịchđệm (pha trong nước), methanol, acetonitril hoặc hỗn hợp củacác loại trên

Dung môi dùng cho HPLC

Lưu ý:

• Tất cả dung môi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩnHPLC (HPLC grade solvent), không có lẫn bụi bẩn và phảiđược khử không khí

• Trước khi sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) và khử khí(sục mạnh khí helium vào bình hoặc đặt bình đã được mởnắp vào một bồn siêu âm)

• Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung môi sử dụng phải trongsuốt đối với bước sóng mà đầu dò UV đang hoạt động đểphát hiện mẫu chất

Bơm cao áp

• Áp suất cao lên đến 7000 psi (48,3 MPa) để bơm một dungmôi (pha động) để xuyên ngang qua một pha tĩnh (đượcnhồi thật chặt bởi những hạt thật mịn) với một vận tốc khôngđổi, thường vào khoảng 0,5-4,0 ml/phút

• Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dungmôi hữu cơ và các dung dịch đệm

Cột sắc ký, cột bảo vệ

• Thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo

• Cột nhồi thường: dài 10-30 cm, đườngkính trong 4-10 mm, cỡ hạt 5 hoặc 10

um Số đĩa lý thuyết dao động 40000đến 60000/m

• Microcolumn: dài 3-7,5 cm, đường kínhtrong 1-2 mm, cỡ hạt 3 hoặc 5 pm Cótrị số N đến 100000 đĩa/m Ưu điểm nổibật của chúng là chạy sắc ký tốn ítdung môi và ít thời gian

Cột sắc ký, cột bảo vệ

• Chất nhồi: chế tạo từ silica (silic dioxyd)

• Ngoài ra, còn có các chất nhồi khác như nhôm oxyd, polymexốp, nhựa trao đổi ion tuỳ thuộc vào loại hình sắc ký

• Trước khi pha động đi vào cột phân tích, nó phải được cho

đi ngang qua một cột bảo vệ (guard column), sử dụng để lọc

bỏ những tạp chất còn sót lại

• Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loạinhưng kích thước hạt lớn hơn Cột bảo vệ không đắt tiềnnên cần được thay mới thường xuyên

Bộ phận tiêm mẫu

• Ống chứa mẫu (sample loop), là van có hai cổng, giúp địnhhướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong haicon đường khác nhau

Bộ phận tiêm mẫu

• Mẫu khảo sát (ở áp suất thường) được tiêm vào máy nhờmột kim tiêm Gạt van theo chiều quy định, ống chứa mẫuđược nối thông vào bên trong máy, pha động lỏng thổingang qua đoạn ống chứa mẫu, cuốn hết các chất mẫu nằmtrong ống đi vào trong máy

• Khi máy đang hoạt động đều, pha động lỏng đi xuyên ngangqua cột sắc ký nhờ một máy bơm tạo áp suất cao

• Khi con đường này hoạt động thì đường kia thông ra khôngkhí bên ngoài máy, được khí thổi sạch để sẵn sàng chứamột mẫu mới cho lần phân tích sau

• Mức độ đáp ứng của đầu dò phải tỉ lệ với số lượng của mỗichất phân tích hiện diện trong hỗn hợp mẫu phân tích.

• Lựa chọn loại đầu dò tùy loại hợp chất muốn phân tích vàcác hợp chất đó có các đặc trưng hoá học nào

Một đầu dò HPLC lý tưởng đạt một số tiêu chuẩn:

• Độ bền cao Không làm hư hại mẫu phân tích

• Có độ nhạy cao và cho kết quả có tính lặp lại

• Cho đáp ứng tương đồng đối với những chất phântích có cấu trúc hoá học tương đồng

• Không thay đổi khi có sự thay đổi nhiệt độ hoặc ápsuất

• Có thời gian đáp ứng ngắn, độc lập với vận tốc củadòng chảy của dung môi giải ly

Các loại đầu dò HPLC:

• Đầu dò theo dõi một tính chất hóa học đặc trưng củacác chất phân tích mà dung môi giải ly không có Cáctính chất đó là: sự hấp thu UV (ultraviolet absorbance),hiện tượng huỳnh quang (fluorescence)

• Đầu dò theo dõi sự hiện diện một khối vật chất trongdung môi giải ly, khối vật chất đó chính là hợp chấtphân tích: chỉ số khúc xạ (refractive index), hằng sốđiện môi (dielectric constant)

• Đầu dò kết hợp: tại thời điểm phát hiện, một lượngdung môi có chứa mẫu được loại bỏ bớt: phươngpháp ion hóa ngọn lửa (FID) hoặc bằng khối phổ(Masse spectroscopy)

PHÂN LOẠI DỰA VÀO BẢN CHẤT

TƯƠNG TÁC

SO 3 -

SO 3 -

VD: nguyên lý sắc ký trao đổi ion

(acide amine)

Sắc ký loại trừ kích thước

• Sắc ký phân bố (partition chromatography)

• Sắc ký hấp phụ hoặc lỏng-rắn (adsorption or liquid-solidchromatography)

• Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

• Sắc ký loại trừ kích thước (size exclusion chromatography)

PHÂN LOẠI DỰA VÀO BẢN CHẤT

- Không có mang điện tích.

- Có thể có tính phân cực hoặc không.

- Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

Cột trao đổi ion - Có trọng lượng phân tử nhỏ (<2000).

- Phân tử có mang điện tích.

- Loại hợp chất hòa tan trong nước.

Cột sắc ký gel - Có trọng lượng phân tử nhỏ hoặc lớn.

- Không có mang điện tích.

- Có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ hoặc nước.

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Có thể phân thành hai dạng tuỳ thuộc vào pha tĩnh:

• Sắc ký lỏng – lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh cáchạt chất mang rắn, đó là chất nhồi cột Quá trình lưu giữchất phân tích liên quan đến sự phân bố giữa 2 pha lỏng

• Sắc ký pha liên kết (Bonded-phase chromatography - BPC):

Ở đây, pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mangrắn (silica, alumina )

• Sắc ký pha liên kết chiếm ưu thế dần thay thế cho sắc kýlỏng - lỏng

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

• Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd(silica) Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫnchất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

• Ở đây R có thể là mạch thẳng có 18 hoặc 8 carbon hoặc cácnhóm chức hữu cơ khác như amin mạch thẳng, nitril,hydrocarbon thơm Tính chất phân cực của pha tĩnh thay đổituỳ thuộc vào gốc R Dựa vào gốc R này người ta phân rahai nhóm: Pha tĩnh phân cực và pha tĩnh không phân cực

 Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl)

hoặc C18 (n-octyldecyl).

 Pha động là H2O + dung môi hòa tan

(acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol)

 Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh

nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm

tăng thời gian chạy mẫu

Pha tĩnh-Pha đảo

(Stationary Phases for Reversed-Phase LC)

Pha tĩnh bình thường của LC

(Stationary Phases for Normal LC)

 Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…

 Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa

ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Ba thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động và chấtphân tích

Cần chọn điều kiện để cân bằng lực tương tác giữa ba thànhphần này Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu mô tảđịnh tính lực tương tác

• Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan

• Với pha động: Dựa vào trị số P’

• Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

Pha tĩnh:

• Silica: Trên bề mặt có nhóm silanol ở dạng tự do (có ái lực hấp phụ mạnh nhất) Ngoài ra còn ở dạng liên kết giữa các nhóm hoặc với phân tử nước Ưu điểm: hấp phụ mạnh, dùng được cho nhiều trường hợp, nhược điểm: ổn định chỉ trong khoảng pH hẹp (2 - 8).

• Alumina: có độ ổn định pH rộng hơn (2 - 12) Sau khi xử lý kiềm có thể dùng alumina tách các base hữu cơ (anilin, pyridín và dẫn chất của chúng).

• Titan oxyd và zirconi oxyd ở dạng oxyd base không tan trong môi trường kiềm Ổn định trong môi trường acid đến pH=1 Chất phân tích có tính base được lưu giữ trên pha tĩnh titan oxyd hoặc zirconi oxyd có thể rửa giải với hỗn hợp nước bão hòa dicloromethan.

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

• Ảnh hưỏng rõ rệt đến hệ số phân bố của chất phân tích

• Để rửa giải các chất đã bị hấp phụ, ngươi ta dùng pha động

có sức rửa giải (eluent strength) khác nhau

• Trị số εo càng lớn, sức rửa giải càng mạnh

• Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào phân số molcủa từng dung môi để tính tri so εo của hệ

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao

Ứng dụng:

Các chất phân tích có khối lượng phân tử dưới 5 000, ít tantrong nước hoặc trong hỗn hợp nước - dung môi hữu cơ khôngthích hợp với sắc ký pha đảo Người ta cần dùng sắc ký phathuận, đặc biệt là sắc ký hấp phụ để tách hỗn hợp các chất này

• Sắc ký hấp phụ có thế mạnh trong việc tách các đồng phân

vị trí các hợp chất hữu cơ

• Ngoài ra sắc ký hấp phụ còn được ứng dụng nhiều trongphân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm

Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

Sắc ký trao đổi ion hiệu năng cao

Ứng dụng:

• Chất phân tích ion được đưa vào đầu cột đã nhồi nhựa traođổi ion thích hợp Rửa giải được thực hiện bằng một dungdịch có ion đủ sức đẩy ion phân tích đang bị lưu giữ ra khỏi

bể mặt nhựa

• Kỹ thuật sắc ký này có thể áp dụng tách các ion vô cơ vàhữu cơ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel

Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên gel

• Hiện nay phương pháp HPLC được áp dụng rấtlớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt làứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc

• Là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đathành phần cho phép định tính và định lượng

So sánh HPLC và GC (Comparison of HPLC and GLC)

• Áp dụng được với các mẫu

không bay hơi và không

mẫu vào máy

Áp suất hơi của các cấu tử trong hỗn hợp

Áp suất hơi của các cấu tử trong hỡn hợp

Đầu dò Được thiết kế riêng vì pha

động thể khí Nhiệt độ hoạt

Thanks for your listening