Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) MỤC TIÊU Trình bày nguyên tắc hoạt động cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trình bày nguyên tắc ứng dụng kỹ thuật HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ Mô tả trình bày nguyên tắc, cấu tạo ứng dụng số detector thường dùng máy HPLC TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO SẮC KÝ LỎNG Pha động Lỏng Pha tĩnh - Rắn - Lỏng High Performance Liquid Chromatography Các phận máy HPLC Bình chứa dung môi giải ly cột • Có bình dung môi (đường dung môi) → rửa giải theo tỷ lệ mong muốn • Bình làm chất liệu trơ, thường thủy tinh, có nắp bảo vệ, nắp có lỗ hở thông với khí trời • Ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, có gắn nút lọc kim loại với mục đích lọc dung môi giữ ống mặt thoáng chất lỏng • Trước sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) đuổi khí hoà tan pha động, gọi khử bọt khí (degassing: chạy siêu âm, sục khí trơ heli ) Dung môi dùng cho HPLC • Tỉ lệ dung môi hỗn hợp điều khiển hệ thống điều khiển • Có hai kiểu chương trình dung môi Dung môi dùng cho HPLC Có hai kiểu sử dụng pha động việc giải ly: • Giải ly đơn nồng độ (đẳng dòng - isocratic elution) • Giải ly nồng độ tăng dần tuyến tính (gradient elution): Dung môi dùng cho HPLC nước, loại dung dịch đệm (pha nước), methanol, acetonitril hỗn hợp loại Dung môi dùng cho HPLC Lưu ý: • Tất dung môi phải có độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn HPLC (HPLC grade solvent), lẫn bụi bẩn phải khử không khí • Trước sử dụng, cần lọc (màng lọc 0,45µm) khử khí (sục mạnh khí helium vào bình đặt bình mở nắp vào bồn siêu âm) • Nếu máy sử dụng đầu dò UV, dung môi sử dụng phải suốt bước sóng mà đầu dò UV hoạt động để phát mẫu chất Pha tĩnh-Pha đảo Pha tĩnh bình thường LC (Stationary Phases for Reversed-Phase LC) (Stationary Phases for Normal LC)  Gốc R C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) C18 (n-octyldecyl)  Pha động H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol)  Các cấu tử phân cực bị rửa nhanh nhất, tăng độ phân cực pha động làm tăng thời gian chạy mẫu  Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…  Các cấu tử không phân cực bị rửa nhanh nhất, tăng độ phân cực pha động giảm thời gian chạy mẫu Sắc ký phân bố hiệu cao Chon pha tĩnh pha động Ba thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động chất phân tích Cần chọn điều kiện để cân lực tương tác ba thành phần Độ phân cực thành phần tiêu mô tả định tính lực tương tác • Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm R dẫn chất siloxan • Với pha động: Dựa vào trị số P’ • Với chất phân tích: Dựa vào nhóm chức Sắc ký phân bố hiệu cao Chọn pha tĩnh pha động Để tách sắc ký ngưòi ta lựa chọn theo nguyên tăc sau: • Độ phân cực chất phân tích hợp (matching) với độ phân cực pha tĩnh khác xa độ phân cực pha động • Độ phân cực chất phân tích hợp với độ phân cực pha động khác nhiều với độ phân cực pha tĩnh Chọn theo nguyên tắc có xác suất thành công nhiều Còn theo nguyên tắc pha tĩnh khó cạnh tranh chất phân tích với pha động nên thời gian lưu ngắn Sắc ký hấp phụ hiệu cao Nguyên tắc • Sắc ký hấp phụ trình hấp phụ chất phân tích bề mặt chất rắn • Pha tĩnh chất rắn phân cực • Chất phân tích tranh chấp với pha động vị trí hấp phụ bề mặt pha tĩnh • Lưu giữ chất phân tích lực hấp phụ Sắc ký hấp phụ hiệu cao Pha tĩnh: • Silica: Trên bề mặt có nhóm silanol dạng tự (có lực hấp phụ mạnh nhất) Ngoài dạng liên kết nhóm với phân tử nước Ưu điểm: hấp phụ mạnh, dùng cho nhiều trường hợp, nhược điểm: ổn định khoảng pH hẹp (2 - 8) • Alumina: có độ ổn định pH rộng (2 - 12) Sau xử lý kiềm dùng alumina tách base hữu (anilin, pyridín dẫn chất chúng) • Titan oxyd zirconi oxyd dạng oxyd base không tan môi trường kiềm Ổn định môi trường acid đến pH=1 Chất phân tích có tính base lưu giữ pha tĩnh titan oxyd zirconi oxyd rửa giải với hỗn hợp nước bão hòa dicloromethan Sắc ký hấp phụ hiệu cao Pha động: • Ảnh hưỏng rõ rệt đến hệ số phân bố chất phân tích • Để rửa giải chất bị hấp phụ, ta dùng pha động có sức rửa giải (eluent strength) khác • Trị số εo lớn, sức rửa giải mạnh • Nếu pha động gồm nhiều dung môi, dựa vào phân số mol dung môi để tính tri so εo hệ Sắc ký hấp phụ hiệu cao Ứng dụng: Các chất phân tích có khối lượng phân tử 000, tan nước hỗn hợp nước - dung môi hữu không thích hợp với sắc ký pha đảo Người ta cần dùng sắc ký pha thuận, đặc biệt sắc ký hấp phụ để tách hỗn hợp chất • Sắc ký hấp phụ mạnh việc tách đồng phân vị trí hợp chất hữu • Ngoài sắc ký hấp phụ ứng dụng nhiều phân tích chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm Sắc ký trao đổi ion hiệu cao Nguyên tắc: • Dựa vào lực hút ion chất tan vị trí mang điện tích pha tĩnh • Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích dương pha tĩnh hút anion chất tan • Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích âm hút cation chất tan • Chất trao đổi anion chất trao đổi cation polymer không tan nước mang nhóm trao đổi ion gọi chất trao đổi ion (ion exchangers) nhựa trao đổi ion (ion exchange resins) Sắc ký trao đổi ion hiệu cao Ứng dụng: • Chất phân tích ion đưa vào đầu cột nhồi nhựa trao đổi ion thích hợp Rửa giải thực dung dịch có ion đủ sức đẩy ion phân tích bị lưu giữ khỏi bể mặt nhựa • Kỹ thuật sắc ký áp dụng tách ion vô hữu Sắc ký lỏng hiệu cao gel Nguyên tắc: • Dựa vào kích thước phân tử Vì có tên gọi chung sắc ký loại cỡ (SEC: size exclusion chromatography) sắc ký loại phân tử (MEC: molecular exclusion chromatography) Pha tĩnh gel polysaccharid, polyacrylamid thường dùng phổ biến để xác định phân bố khối lượng phân tử polymer Sắc ký lỏng hiệu cao gel Ứng dụng: Lọc gel dùng chủ yếu để tách chất có khối lượng phân tử M khác Với pha tĩnh có phụ thuộc tuyến tính lgM thể tích lưu VR khoảng định Có thể đánh giá M chất phân tích cách so sánh thể tích lưu với thể tích lưu chất chuẩn • Hiện phương pháp HPLC áp dụng lớn nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc • Là công cụ đắc lực phân tích thuốc đa thành phần cho phép định tính định lượng So sánh HPLC GC (Comparison of HPLC and GLC) Các đặc điểm chung:  Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi  Thể tích mẫu nhỏ  Có thể không phá hủy mẫu (nondestructive of sample)  Định lượng dễ dàng Ưu điểm HPLC • Áp dụng với mẫu Ưu điểm GC • Thiết bị đơn giản rẻ không bay không • Nhanh chóng bền nhiệt • Dễ dàng kết nối với phổ • Áp dụng cho ion vô khối GC - HPLC Pha động GC HPLC Khí Lỏng Tính chất mẫu Mẫu cần phải có tính bay hơi, Không giới hạn bền nhiệt Cơ chế tách Áp suất cấu tử Tương tác cấu tử hỗn hợp Lực trì dòng chảy pha động Bơm áp lực Máy nén tạo áp suất cao Bộ phân đưa mẫu vào máy Áp suất cấu tử hỗn hợp Áp suất cấu tử hỡn hợp Đầu dò Được thiết kế riêng pha động thể khí Nhiệt độ hoạt Bộ phân tiêm mẫu, cột, đầu dò Nhiệt độ phòng động máy phải nung nóng Thanks for your listening ... nguyên tắc hoạt động cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Trình bày nguyên tắc ứng dụng kỹ thuật HPLC: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ Mô tả trình bày nguyên... môi hữu nước Cột trao đổi ion Cột sắc ký gel Sắc ký phân bố hiệu cao Có thể phân thành hai dạng tuỳ thuộc vào pha tĩnh: • Sắc ký lỏng – lỏng: Pha tĩnh lớp chất lỏng bao quanh hạt chất mang rắn,... TÁC • Sắc ký phân bố (partition chromatography) • Sắc ký hấp phụ lỏng- rắn (adsorption or liquid-solid chromatography) • Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) • Sắc ký loại trừ kích