Lý thuyết về Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

Ngày nay, nó được ứng dụng rộng rãi với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất trong nhiều lĩnh vực bao gồm dược phẩm, công nghệ sinh học, môi

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.1 CÁC KHÁI NIỆM MỞ ĐẦU

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là một kỹ thuật sắc ký được phát triển vào cuối thập niên 1960 và đầu thập niên 1970 Ngày nay, nó được ứng dụng rộng rãi với mục đích xác định, định lượng và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất trong nhiều lĩnh vực bao gồm dược phẩm, công nghệ sinh học, môi trường, polymer và công nghiệp thực phẩm

HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng để tải một chất hỗn hợp đơn giản vào cột sắc ký, qua đó quá trình phân tách xảy ra HPLC được phân biệt với các phương pháp sắc ký thông thường vì áp lực của HPLC khá cao trong khi sắc ký thông thường phần lớn dựa vào lực của trọng lực Do điều kiện phân tách dưới áp lực cao của HPLC, nên cột của HPLC có đường kính trong tương đối nhỏ và ngắn, kích thước phân tử hạt pha tĩnh dần trở nên nhỏ hơn giúp cho quá trình phân tích tối ưu hợp chất mẫu hơn là sắc

ký thông thường Cột tiêu biểu dài 10 - 25 cm, đường kính trong 4,6 mm Hiện nay, có loại cột đường kính trong 2 mm trở xuống

Có thể xem, HPLC là sự áp dụng lý thuyết và thiết bị của sắc ký khí (Gas Chromatography -GC) Tuy nhiên, HPLC là một kỹ thuật linh hoạt hơn, và thường có thể thực hiện được các phân tách phức tạp HPLC tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hóa, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hóa sinh…

Vì thế, có thể tóm tắt đặc điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

 Tách hỗn hợp trên cột được nhồi hạt pha tĩnh có d  10 µm

 Sử dụng bơm có áp suất cao gần 400 atm để đẩy pha động qua cột sắc ký

 Tốc độ dòng khoảng vài ml/phút

 Phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ 20 µg

 Thích hợp với các hoạt chất không bay hơi và chịu nhiệt

 Độ nhạy cao, kết quả chính xác và lặp lại

.2 THÀNH PHẦN CỦA MỘT HỆ THỐNG HPLC

Hình 2.1 Hệ thống HPLC

1 Bình chứa pha động

2 Bộ phận khử khí

3 Hệ thống bơm cao áp

4 Bộ phận tiêm mẫu

5 Cột sắc ký (có tiền cột)

6 Đầu dò

7 Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu

Nội dung chi tiết của các thành phần được trình bày sau đây

1.2.1 BÌNH CHỨA PHA ĐỘNG

Trong HPLC, pha động có thể là một hỗn hợp hữu cơ chứa nước, một dung dịch đệm hay là một hỗn hợp các dung môi hữu cơ

Bình chứa là thủy tinh màu, trung tính, cỡ 100 - 2000 ml, kín Điều quan trọng là chất lỏng vào bơm không được chứa bụi hoặc các tiểu phân khác, vì chúng có thể gây ra nghẽn cột, gây tổn hại các mối hàn, van nối, cũng như các tác động bất lợi khác Vì thế, pha động phải được lọc trước khi đưa vào bơm Thông thường, lọc qua màng lọc 0,45 hoặc 0,22 µm và đuổi khí hòa tan

Các vật liệu lọc:

 Nước: cellulose nitrat, cellulose acetat

 Hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước: màng lọc RC (regenerated cellulose), polyamid hay nylon

1

2

3

4

5

6

1

2

3

44

5

6

7

 Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon.

Đối với HPLC pha thường, dung môi thường không phân cực, còn HPLC pha đảo, dung môi thường là một hỗn hợp của nước và dung môi hữu cơ phân cực Độ tinh khiết của dung môi và các muối vô cơ được sử dụng cho pha động trong HPLC là rất quan trọng

* Bộ phận khử khí dung môi

Loại khí ngay trong bình chứa dung môi (siêu âm, sục khí trơ) hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi bơm vào dung môi

 Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung môi

 Sục khí trơ (Heli): đuổi khí hòa tan khỏi dung môi

 Khử khí ngay trên dòng (on-line membrane degassing)

Hình 2.2 Hệ thống khử khí dung môi ngay trên dòng 1.2.2 DUNG MÔI

Một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công trong phân tích HPLC là chọn lựa một pha động thích hợp với cột và mẫu thử

Một số yêu cầu cơ bản cần phải có của dung môi (pha động) trong HPLC là:

 Có khả năng hòa tan mẫu thử mà không tương tác về mặt hóa học

 Không gây hư hại hay lão hóa cột nhanh chóng

 Phù hợp với detector sử dụng

 Có độ nhớt thấp

 Có tính hỗn hòa (miscibility) phù hợp

 Có khả năng thu hồi mẫu dễ dàng (đối với HPLC điều chế)

 Sẵn có trên thị trường và độ tinh khiết đạt yêu cầu

 An toàn, ít cháy nổ, ít độc

Như đã đề cập, ngoài pha tĩnh, thì việc chọn lựa dung môi thích hợp đóng một vai trò quan trọng, vì độ mạnh và độ chọn lọc của dung môi quyết định mức độ phân tách của chất tan Việc tìm kiếm dung môi thích hợp có thể áp dụng ngay trên hệ thống HPLC, tuy nhiên, sẽ tốn kém, phức tạp và tốn nhiều thời gian

Một phương pháp gợi ý để thăm dò hệ dung môi hiệu quả cho HPLC là sắc ký lớp mỏng Trong nhiều trường hợp, sắc ký lớp mỏng sẽ cho những thông tin ban đầu hết sức cần thiết

về loại cột và dung môi sử dụng

* Chương trình dung môi

Rửa giải isocratic (đẳng dòng)

Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký Phương pháp isocratic là kỹ

thuật đơn giản và nên là lựa chọn đầu tiên khi tiến hành phân tích Tuy nhiên, độ phân giải đối với nhiều chất không đủ để phân tách chúng, thời gian rửa giải có thể kéo dài

Rửa giải gradient (tiệm tiến)

Thành phần pha động thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình dung môi.

Rửa giải gradient thường được tạo ra bằng cách kết hợp áp lực dòng chảy từ hai bơm và thay đổi tốc độ dòng riêng của chúng bằng một bộ điều khiển hoặc hệ thống dữ liệu, trong khi đó vẫn duy trì tốc độ dòng tổng hằng định

Rửa giải gradient chỉ thành công và ưu điểm hơn isocratic khi xác định được điều kiện sắc

ký và thiết bị thích hợp Ngoài ra, rửa giải gradient ít được dùng cho định lượng và sắc ký điều chế vì độ lặp lại kém

Rửa giải đa dạng

Là phương pháp rửa giải sử dụng pha động đa dạng và nhiều kỹ thuật sắc ký, phương cách khác nhau trên cùng một cột, còn được gọi là sắc ký theo phương pháp hỗn hợp Sắc ký loại trừ (SEC), sắc ký trao đổi ion (IEC) hoặc sắc ký ái lực (AC) là các phương pháp có thể được

sử dụng

1.2.3 HỆ THỐNG BƠM CAO ÁP

Vai trò của bơm để đẩy pha động qua cột sắc ký với tốc độ dòng chảy cụ thể, được thể hiện trong ml mỗi phút (ml/phút) Lưu lượng bình thường trong HPLC là 1-2 ml/phút

Áp suất vào cột thường lớn hơn áp suất thường 200 lần Áp suất không khí bình thường khoảng 105 Pa = 1 bar = 15 psi Vì thế, áp suất vào cột lên đến 200 bar = 3000 psi

Có hai loại bơm:

 Bơm với áp suất không đổi (constant pressure pump)

 Bơm với dòng chảy không đổi (constant flow pump).

Nếu dùng một bơm với áp suất không đổi, tốc độ dòng sẽ thay đổi nếu thay đổi sự đề kháng dòng chảy, nhưng đối với bơm với dòng chảy không đổi, các thay đổi về đề kháng dòng chảy được bù trừ bởi những thay đổi áp suất Vì thế, không nên dùng bơm với áp suất không đổi cho HPLC

Trong quá trình thử nghiệm sắc ký, một máy bơm có thể cung cấp một thành phần pha động hằng định (isocratic) hoặc thay đổi (gradient)

Hiện nay, có loại bơm tứ phân (quaternary pump) có chức năng lấy 4 dung môi từ 4 kênh riêng, tiến hành rửa giải gradient, tiết kiệm dung môi hơn

Trên thị trường có nhiều loại bơm nhưng nhìn chung chúng phải đáp ứng các yêu cầu sau đây:

 Trơ về mặt hóa học đối với dung môi sử dụng

 Không tạo ra xung hoặc phải có bộ phận đệm xung

 Lưu lượng dòng từ 1 - 10 ml/phút đối với sắc ký phân tích, trên 200 ml/phút đối với sắc ký điều chế

 Có khả năng điều chỉnh lưu lượng dòng và độ lặp lại của tốc độ dòng ổn định trong giới hạn  0,5%

Hình 2.3 Bơm tứ phân 1.2.4 BỘ PHẬN TIÊM MẪU

Phương pháp được sử dụng hiện nay là sử dụng van tiêm (valve-loop injector) do có nhiều

ưu điểm hơn so với các phương pháp trước đây

Ưu điểm

 Đưa mẫu vào cột bằng van bơm với thể tích nhất định

 Van bơm có thể hoạt động dưới áp suất cao

 Vòng chứa mẫu (sample loop) có thể tích nhất định nên thể tích mẫu đưa vào cột lúc nào cũng hằng định

 Không tắt cột hay bị bẩn

 Độ lặp lại cao

 Có thể thiết kế việc bơm mẫu tự động (autosampler)

Khuyết điểm

 Lượng mẫu bơm vào loop thường nhiều hơn thể tích của loop, thường gấp 5 - 10 lần

Hình 2.4 Van tiêm mẫu (valve-loop injector) 1.2.5 CỘT SẮC KÝ

Cột bảo vệ (guard column)

Là cột có kích thước nhỏ được đặt trước cột phân tích, có tác dụng giữ lại những phần tử bẩn từ dung môi và mẫu phân tích Chất nhồi cột giống cột phân tích nhưng kích thước hạt lớn hơn để giảm áp suất Ngoài ra, trong sắc ký lỏng-lỏng, cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm tối thiểu hóa sự mất dung môi

Hình 2.5 Cột bảo vệ Cột sắc ký

Thép không gỉ hay thủy tinh đặc biệt (khi áp suất 60 psi) hoặc chất dẻo

Cột bảo vệ

Cột phân tích

Cột phân tích

 Dài: 15 - 25 cm (thường dùng 25 cm)

 Đường kính trong: 4 - 10 mm (4,6 mm)

 Cỡ hạt pha tĩnh: 3 - 10 µm (5 µm)

 Số đĩa lý thuyết: 40.000 - 60.000 đĩa/m

Cột điều chế

 Dài: 25 - 100 cm

 Đường kính trong: 6 - 50 mm

 Chất nhồi cột có kích thước lớn hơn cột phân tích

 Dùng trong dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất

1.2.6 ĐẦU DÒ (DETETOR)

Đầu dò được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hợp chất đi qua và để cung cấp một tín hiệu điện tử cho thiết bị thu thập dữ liệu

Có rất nhiều loại đầu dò khác nhau có thể được sử dụng cho HPLC Các loại đầu dò chính

sử dụng trong HPLC là đầu dò chỉ số khúc xạ (RI), UV-Vis và huỳnh quang, nhưng cũng có đầu dò tán xạ ánh sang bay hơi, điện hóa Mỗi đầu dò có ưu, khuyết điểm và các loại mẫu phân tích thích hợp nhất Gần đây, sự phát triển kỹ thuật đã làm tăng khả năng phân tách và xác định các hợp chất trong một hỗn hợp Những kỹ thuật này bao gồm sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng-khối phổ-khối phổ (LC-MS-MS), sắc ký lỏng ghép phổ

hồng ngoại (LC-IR) và sắc ký lỏng-cộng hưởng từ hạt nhân (LC-NMR) (Bảng 2.1).

Nhìn chung, đầu dò trong sắc ký lỏng cần đáp ứng những yêu cầu sau:

 Đáp ứng nhanh và lặp lại

 Độ nhạy cao, phát hiện chất cần phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp

 Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

 Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

 Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

1.2.7 BỘ PHẬN XỬ LÝ VÀ GHI TÍN HIỆU

Vì tín hiệu phát hiện là các tín hiệu điện, nên việc sử dụng kỹ thuật thu thập dữ liệu hiện đại

có thể hỗ trợ trong việc phân tích tín hiệu Hệ thống thu thập tín hiệu trong HPLC là máy vi tính (computer) Máy tính sẽ ghi nhận, phân tích, truy xuất thành các phổ đồ một cách dễ dàng để đọc và giải thích Các tính năng tiên tiến khác cũng có thể được áp dụng trong hệ

thống sắc ký Những tính năng này bao gồm tiêm mẫu tự động kiểm soát bằng máy tính, điều khiển nhiều bơm khi dùng chương trình gradient và thu thập các phân đoạn

Bảng 2.1 Tóm tắt đặc điểm của các loại detector thường dùng

Hấp thụ UV-Vis

- Bước sóng cố định

- Bước sóng thay đổi

- Dãy diod quang

5.10 -7 5.10 -7

> 2.10 -7

Sử dụng rất phổ biến, chọn lọc với các chất có cấu trúc hoặc nhóm chức chưa bão hòa Ít thay đổi với tốc độ dòng và nhiệt độ

Dùng được

Vạn năng, độ nhạy vừa phải Thay đổi nhiều theo nhiệt độ (cần kiểm soát đến

 0,001 o C)

Không thích hợp

Tán xạ ánh sang bay hơi 2.10 -4

Vạn năng, độ nhạy vừa phải, đáp ứng với khối lượng

Dùng được

Điện hóa

- Đo độ dẫn

- Đo cường độ dòng

10 -5

10 -9

- Có thay đổi theo nhiệt độ

và tốc độ dòng Chỉ thích hợp với chất tan ion.

- Rất nhạy, chọn lọc, nhưng điện cực dễ bị nhiễm bẩn

Không thích hợp

1.3 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC

1.3.1 THỜI GIAN LƯU

Thời gian lưu tR là thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ

Thông số tR giúp cho việc định tính chất tan trên sắc ký đồ

1.3.2 HỆ SỐ DUNG LƯỢNG

Hệ số dung lượng k’ là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động Hệ số dung lượng có thể cho biết khả năng lưu giữ của cột

Trong đó

tR: thời gian lưu.

t0: thời gian lưu lý tưởng, nghĩa là chất tan không bị pha tĩnh giữ lại

Giá trị k’ phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ và đặc điểm cột

Trị số tối ưu: 1  k’  5, có tài liệu ghi là 2 < k’ < 10 (có thể chấp nhận 1 < k’ < 20) 1.3.3 HỆ SỐ CHỌN LỌC

Hệ số chọn lọc  biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh

Trị số yêu cầu: 1,05 <  < 2,00.

1.3.4 HIỆU LỰC CỦA CỘT

Hiệu lực cột biểu thị qua các đại lượng sau:

- Số đĩa lý thuyết N (theoretical plate)

Trong đó,

N: số đĩa lý thuyết biểu kiến

tR: thời gian lưu

W: chiều rộng của pic ở đáy pic

W1/2: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều cao

Hình 2.6 Mô tả cách xác định N

Số đĩa lý thuyết càng lớn, hiệu lực cột càng cao Trị số tối ưu là:

Trong đó,

L: chiều dài cột (cm)

dp: đường kính hạt pha tĩnh (µm)

- Chiều cao đương lượng đĩa lý thuyết HETP

Trong đó,

L: chiều dài cột

N: số đĩa lý thuyết

HETP càng nhỏ, hiệu lực cột càng cao, thường là 0,03 - 1 mm.

1.3.5 ĐỘ PHÂN GIẢI

Trong đó

tR1, tR2: thời gian lưu của hai đỉnh 1 và 2

Wb1, Wb2: chiều rộng của đỉnh 1 và đỉnh 2

Ta có:

 Rs = 0,75: hai pic không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều

 Rs = 1,0: hai pic tách khá tốt, còn xen phủ 4%

 Rs = 1,5: hai pic tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%)

Rs nên lớn hơn 1,5

Ngoài ra, hệ số phân giải còn được tính theo công thức sau

Vì thế, đeể tăng Rs, có thể dùng các cách sau:

 Tăng N: bằng cách dùng cột dài hơn hoặc pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ hơn (khả

thi hơn) Cũng có thể giảm tốc độ pha động

 Tăng k B ’ : bằng cách thay đổi thành phần pha động k’

B tăng sẽ tăng thời gian phân tích Để dung hòa Rs và thời gian rửa giải cần 2 < k ’

B < 5.

 Tăng : bằng cách thay đổi loại pha tĩnh hoặc thành phần pha động, kể cả pH Việc

tăng  có ảnh hưởng mạnh tới Rs

1.3.6 HỆ SỐ BẤT ĐỐI XỨNG

Hệ số bất đối xứng As thường dùng để đánh giá sự cân đối của đỉnh.

Trong đó,

W1/20: độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao

f: khoảng cách từ đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở 1/20 chiều cao

Trị số chấp nhận: 0,8 < A s < 1,5.

1.4 ỨNG DỤNG

1.4.1 ĐỊNH TÍNH

Phân tích định tính trong HPLC được thực hiện gồm 3 cách, dựa vào đặc tính quan trọng là thời gian lưu tR của hợp chất

1.4.1.1 Dựa vào các dữ liệu về sự lưu

- So sánh trực tiếp thời gian lưu t R

Sắc ký lần lượt mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều kiện Sau đó, so sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn Phụ thuộc vào sự sẵn có và tính chính xác của chất chuẩn

- So sánh thời gian lưu từ tài liệu tham khảo

Dựa vào các tài liệu, so sánh với thời gian lưu của mẫu thử, trong trường hợp khó khăn về chất chuẩn Tuy nhiên, cần thực hiện điều kiện sắc ký giống như mô tả trong tài liệu Bên cạnh đó, cần dựa vào những thông tin khác kèm theo như phổ UV, IR… để kết luận chính xác hơn

1.4.1.2 Phân tích định tính các chất thu được từ HPLC quy mô phân tích

Trong trường hợp định tính dựa vào thời gian lưu không thể thực hiện hay dữ liệu thiếu chắc chắn Thực hiện bằng nhiều cách: kiểm tra chéo bằng các phương pháp sắc ký, sử dụng nhiều detector khác nhau, hay các kỹ thuật hỗ trợ khác nhau như phản ứng màu, phân tích nguyên tố, huỳnh quang…

1.4.1.3 Phân tích phổ nghiệm on-line các đỉnh thu được từ HPLC

So sánh phổ tương ứng các đỉnh HPLC cần xác định với phổ các chất chuẩn

1.4.2 ĐỊNH LƯỢNG

Nguyên tắc chung: dựa trên sự so sánh chiều cao hoặc diện tích pic trong mẫu thử với một

hay nhiều chất chuẩn

 Pic hẹp và đối xứng: đo chiều cao hoặc diện tích pic

 Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic

1.4.2.1 Phương pháp qui về 100% diện tích pic

- Trường hợp không có chất chuẩn

- Phương pháp này yêu cầu mọi cấu tử trong hỗn hợp đều phải được rửa giải, phát hiện và tách hoàn toàn Sự đáp ứng của đầu dò trên cấu tử là như nhau

Trong đó,

% X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z

AX, AY, AZ: diện tích pic của cấu tử X, Y, Z

- Áp dụng để xác độ tinh khiết của hoạt chất và trong định lượng gần đúng các hợp chất tự nhiên có độ tinh khiết cao

2.4.2.2 Phương pháp dùng chuẩn ngoại

Chuẩn ngoại một điểm

Xác định chiều cao hay diện tích pic của chất thử, tính ra nồng độ chất thử dựa vào nồng độ

và chiều cao hay diện tích đã biết của chất chuẩn

hay Trong đó

hX, SX, CX: lần lượt là chiều cao, diện tích, nồng độ chất thử

hO, SO, CO: lần lượt là chiều cao, diện tích, nồng độ chất chuẩn

Chuẩn ngoại nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn)

 Pha các dung dịch có nồng độ khác nhau

 Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn

 Thiết lập phương trình hồi qui và vẽ đường biễu diễn phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ

 Tiến hành sắc ký mẫu thử

 Dựa vào phương trinh hồi qui suy ra nồng độ mẫu thử

1.4.2.3 Phương pháp chuẩn nội

Nhằm giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong phương pháp định lượng bằng HPLC, một chất chuẩn thứ hai, gọi là nội chuẩn được thêm vào chất chuẩn ngoại và mẫu thử

Yêu cầu của chuẩn nội: