Lý thuyết về Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.1 CÁC KHÁI NIỆM MỞ ĐẦU Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) kỹ thuật sắc ký phát triển vào cuối thập niên 1960 đầu thập niên 1970 Ngày nay, ứng dụng rộng rãi với mục đích xác định, định lượng tinh khiết thành phân riêng lẻ hợp chất nhiều lĩnh vực bao gồm dược phẩm, công nghệ sinh học, môi trường, polymer công nghiệp thực phẩm HPLC dựa áp lực bơm học lên chất dung môi lỏng để tải chất hỗn hợp đơn giản vào cột sắc ký, qua trình phân tách xảy HPLC phân biệt với phương pháp sắc ký thơng thường áp lực HPLC cao sắc ký thông thường phần lớn dựa vào lực trọng lực Do điều kiện phân tách áp lực cao HPLC, nên cột HPLC có đường kính tương đối nhỏ ngắn, kích thước phân tử hạt pha tĩnh dần trở nên nhỏ giúp cho q trình phân tích tối ưu hợp chất mẫu sắc ký thông thường Cột tiêu biểu dài 10 - 25 cm, đường kính 4,6 mm Hiện nay, có loại cột đường kính mm trở xuống Có thể xem, HPLC áp dụng lý thuyết thiết bị sắc ký khí (Gas Chromatography GC) Tuy nhiên, HPLC kỹ thuật linh hoạt hơn, thường thực phân tách phức tạp HPLC tốt đại phân tử, loại chất vơ ion hóa, hợp chất thiên nhiên khơng bền, hỗn hợp thuốc chất hóa sinh… Vì thế, tóm tắt đặc điểm sắc ký lỏng hiệu cao sau:  Tách hỗn hợp cột nhồi hạt pha tĩnh có d ≤ 10 µm  Sử dụng bơm có áp suất cao gần 400 atm để đẩy pha động qua cột sắc ký  Tốc độ dòng khoảng vài ml/phút  Phân giải nhanh lượng mẫu nhỏ cỡ 20 µg  Thích hợp với hoạt chất khơng bay chịu nhiệt  Độ nhạy cao, kết xác lặp lại .2 THÀNH PHẦN CỦA MỘT HỆ THỐNG HPLC 6 5 7 22 1 3 Hình 2.1 Hệ thống HPLC Bình chứa pha động Bộ phận khử khí Hệ thống bơm cao áp Bộ phận tiêm mẫu Cột sắc ký (có tiền cột) Đầu dò Bộ phận xử lý ghi tín hiệu Nội dung chi tiết thành phần trình bày sau 1.2.1 BÌNH CHỨA PHA ĐỘNG Trong HPLC, pha động hỗn hợp hữu chứa nước, dung dịch đệm hỗn hợp dung mơi hữu Bình chứa thủy tinh màu, trung tính, cỡ 100 - 2000 ml, kín Điều quan trọng chất lỏng vào bơm khơng chứa bụi tiểu phân khác, chúng gây nghẽn cột, gây tổn hại mối hàn, van nối, tác động bất lợi khác Vì thế, pha động phải lọc trước đưa vào bơm Thông thường, lọc qua màng lọc 0,45 0,22 µm đuổi khí hòa tan Các vật liệu lọc: • Nước: cellulose nitrat, cellulose acetat • Hỗn hợp dung môi hữu nước: màng lọc RC (regenerated cellulose), polyamid hay nylon • Dung môi hữu cơ: màng lọc teflon Đối với HPLC pha thường, dung mơi thường khơng phân cực, HPLC pha đảo, dung môi thường hỗn hợp nước dung môi hữu phân cực Độ tinh khiết dung môi muối vô sử dụng cho pha động HPLC quan trọng * Bộ phận khử khí dung mơi Loại khí bình chứa dung mơi (siêu âm, sục khí trơ) dòng chảy pha động trước bơm vào dung mơi • Siêu âm: đuổi khí thừa khỏi dung mơi • Sục khí trơ (Heli): đuổi khí hòa tan khỏi dung mơi • Khử khí dòng (on-line membrane degassing) Hình 2.2 Hệ thống khử khí dung mơi dòng 1.2.2 DUNG MƠI Một yếu tố định đến thành công phân tích HPLC chọn lựa pha động thích hợp với cột mẫu thử Một số yêu cầu cần phải có dung mơi (pha động) HPLC là: • Có khả hòa tan mẫu thử mà khơng tương tác mặt hóa học • Khơng gây hư hại hay lão hóa cột nhanh chóng • Phù hợp với detector sử dụng • Có độ nhớt thấp • Có tính hỗn hòa (miscibility) phù hợp • Có khả thu hồi mẫu dễ dàng (đối với HPLC điều chế) • Sẵn có thị trường độ tinh khiết đạt u cầu • An tồn, cháy nổ, độc Như đề cập, ngồi pha tĩnh, việc chọn lựa dung mơi thích hợp đóng vai trò quan trọng, độ mạnh độ chọn lọc dung môi định mức độ phân tách chất tan Việc tìm kiếm dung mơi thích hợp áp dụng hệ thống HPLC, nhiên, tốn kém, phức tạp tốn nhiều thời gian Một phương pháp gợi ý để thăm dò hệ dung mơi hiệu cho HPLC sắc ký lớp mỏng Trong nhiều trường hợp, sắc ký lớp mỏng cho thông tin ban đầu cần thiết loại cột dung môi sử dụng * Chương trình dung mơi Rửa giải isocratic (đẳng dòng) Thành phần pha động khơng thay đổi q trình sắc ký Phương pháp isocratic kỹ thuật đơn giản nên lựa chọn tiến hành phân tích Tuy nhiên, độ phân giải nhiều chất không đủ để phân tách chúng, thời gian rửa giải kéo dài Rửa giải gradient (tiệm tiến) Thành phần pha động thay đổi trình sắc ký theo chương trình dung mơi Rửa giải gradient thường tạo cách kết hợp áp lực dòng chảy từ hai bơm thay đổi tốc độ dòng riêng chúng điều khiển hệ thống liệu, trì tốc độ dòng tổng định Rửa giải gradient thành công ưu điểm isocratic xác định điều kiện sắc ký thiết bị thích hợp Ngồi ra, rửa giải gradient dùng cho định lượng sắc ký điều chế độ lặp lại Rửa giải đa dạng Là phương pháp rửa giải sử dụng pha động đa dạng nhiều kỹ thuật sắc ký, phương cách khác cột, gọi sắc ký theo phương pháp hỗn hợp Sắc ký loại trừ (SEC), sắc ký trao đổi ion (IEC) sắc ký lực (AC) phương pháp sử dụng 1.2.3 HỆ THỐNG BƠM CAO ÁP Vai trò bơm để đẩy pha động qua cột sắc ký với tốc độ dòng chảy cụ thể, thể ml phút (ml/phút) Lưu lượng bình thường HPLC 1-2 ml/phút Áp suất vào cột thường lớn áp suất thường 200 lần Áp suất khơng khí bình thường khoảng 105 Pa = bar = 15 psi Vì thế, áp suất vào cột lên đến 200 bar = 3000 psi Có hai loại bơm: • Bơm với áp suất khơng đổi (constant pressure pump) • Bơm với dòng chảy khơng đổi (constant flow pump) Nếu dùng bơm với áp suất khơng đổi, tốc độ dòng thay đổi thay đổi đề kháng dòng chảy, bơm với dòng chảy khơng đổi, thay đổi đề kháng dòng chảy bù trừ thay đổi áp suất Vì thế, khơng nên dùng bơm với áp suất khơng đổi cho HPLC Trong q trình thử nghiệm sắc ký, máy bơm cung cấp thành phần pha động định (isocratic) thay đổi (gradient) Hiện nay, có loại bơm tứ phân (quaternary pump) có chức lấy dung mơi từ kênh riêng, tiến hành rửa giải gradient, tiết kiệm dung môi Trên thị trường có nhiều loại bơm nhìn chung chúng phải đáp ứng yêu cầu sau đây: • Trơ mặt hóa học dung mơi sử dụng • Khơng tạo xung phải có phận đệm xung • Lưu lượng dòng từ - 10 ml/phút sắc ký phân tích, 200 ml/phút sắc ký điều chế • Có khả điều chỉnh lưu lượng dòng độ lặp lại tốc độ dòng ổn định giới hạn ± 0,5% Hình 2.3 Bơm tứ phân 1.2.4 BỘ PHẬN TIÊM MẪU Phương pháp sử dụng sử dụng van tiêm (valve-loop injector) có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước Ưu điểm • Đưa mẫu vào cột van bơm với thể tích định • Van bơm hoạt động áp suất cao • Vòng chứa mẫu (sample loop) tích định nên thể tích mẫu đưa vào cột lúc định • Khơng tắt cột hay bị bẩn • Độ lặp lại cao • Có thể thiết kế việc bơm mẫu tự động (autosampler) Khuyết điểm • Lượng mẫu bơm vào loop thường nhiều thể tích loop, thường gấp - 10 lần Hình 2.4 Van tiêm mẫu (valve-loop injector) 1.2.5 CỘT SẮC KÝ Cột bảo vệ (guard column) Là cột có kích thước nhỏ đặt trước cột phân tích, có tác dụng giữ lại phần tử bẩn từ dung mơi mẫu phân tích Chất nhồi cột giống cột phân tích kích thước hạt lớn để giảm áp suất Ngoài ra, sắc ký lỏng-lỏng, cột bảo vệ có tác dụng bão hòa pha động với pha tĩnh làm tối thiểu hóa dung mơi Cột bảo vệ Cột phân tích Hình 2.5 Cột bảo vệ Cột sắc ký Thép không gỉ hay thủy tinh đặc biệt (khi áp suất 60 psi) chất dẻo Cột phân tích • Dài: 15 - 25 cm (thường dùng 25 cm) • Đường kính trong: - 10 mm (4,6 mm) • Cỡ hạt pha tĩnh: - 10 àm (5 àm) S a lý thuyết: 40.000 - 60.000 đĩa/m Cột điều chế • Dài: 25 - 100 cm • Đường kính trong: - 50 mm • Chất nhồi cột có kích thước lớn cột phân tích • Dùng dược liệu để sơ tách nhóm hợp chất 1.2.6 ĐẦU DỊ (DETETOR) Đầu dò sử dụng để phát diện hợp chất qua để cung cấp tín hiệu điện tử cho thiết bị thu thập liệu Có nhiều loại đầu dò khác sử dụng cho HPLC Các loại đầu dò sử dụng HPLC đầu dò số khúc xạ (RI), UV-Vis huỳnh quang, có đầu dò tán xạ ánh sang bay hơi, điện hóa Mỗi đầu dò có ưu, khuyết điểm loại mẫu phân tích thích hợp Gần đây, phát triển kỹ thuật làm tăng khả phân tách xác định hợp chất hỗn hợp Những kỹ thuật bao gồm sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng-khối phổ-khối phổ (LC-MS-MS), sắc ký lỏng ghép phổ hồng ngoại (LC-IR) sắc ký lỏng-cộng hưởng từ hạt nhân (LC-NMR) (Bảng 2.1) Nhìn chung, đầu dò sắc ký lỏng cần đáp ứng yêu cầu sau:  Đáp ứng nhanh lặp lại  Độ nhạy cao, phát chất cần phân tích khối lượng nồng độ thấp  Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng  Khoảng hoạt động tuyến tính rộng  Ít thay đổi theo nhiệt độ tốc độ dòng 1.2.7 BỘ PHẬN XỬ LÝ VÀ GHI TÍN HIỆU Vì tín hiệu phát tín hiệu điện, nên việc sử dụng kỹ thuật thu thập liệu đại hỗ trợ việc phân tích tín hiệu Hệ thống thu thập tín hiệu HPLC máy vi tính (computer) Máy tính ghi nhận, phân tích, truy xuất thành phổ đồ cách dễ dàng để đọc giải thích Các tính tiên tiến khác áp dụng hệ thống sắc ký Những tính bao gồm tiêm mẫu tự động kiểm sốt máy tính, điều khiển nhiều bơm dùng chương trình gradient thu thập phân đoạn Bảng 2.1 Tóm tắt đặc điểm loại detector thường dùng Loại detector Độ nhạy (mg/ml) Đặc điểm Rửa giải gradient Sử dụng phổ biến, chọn Hấp thụ UV-Vis - Bước sóng cố định 5.10-7 - Bước sóng thay đổi 5.10-7 - Dãy diod quang > 2.10-7 Huỳnh quang 10-9 Chỉ số khúc xạ 5.10-4 lọc với chất có cấu trúc nhóm chức chưa bão Dùng hòa Ít thay đổi với tốc độ dòng nhiệt độ Đặc biệt nhạy Dùng Vạn năng, độ nhạy vừa phải Thay đổi nhiều theo nhiệt độ (cần kiểm sốt đến Khơng thích hợp ± 0,001oC) Vạn năng, độ nhạy vừa Tán xạ ánh sang bay 2.10-4 phải, đáp ứng với khối Dùng lượng Điện hóa - Đo độ dẫn - Có thay đổi theo nhiệt độ 10-5 tốc độ dòng Chỉ thích hợp với chất tan ion - Đo cường độ dòng 10-9 Phổ khối Cực nhỏ Khơng thích hợp - Rất nhạy, chọn lọc, điện cực dễ bị nhiễm bẩn Vạn năng, nhạy, đắt tiền Dùng 1.3 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG TRONG HPLC 1.3.1 THỜI GIAN LƯU Thời gian lưu tR thời gian cần thiết để chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector cho pic sắc ký đồ Thơng số tR giúp cho việc định tính chất tan sắc ký đồ 1.3.2 HỆ SỐ DUNG LƯỢNG Hệ số dung lượng k’ tỷ số lượng chất tan pha tĩnh lượng chất tan pha động Hệ số dung lượng cho biết khả lưu giữ cột Trong tR: thời gian lưu t0: thời gian lưu lý tưởng, nghĩa chất tan không bị pha tĩnh giữ lại Giá trị k’ phụ thuộc vào chất pha, chất tan, nhiệt độ đặc điểm cột Trị số tối ưu: ≤ k’ ≤ 5, có tài liệu ghi < k’ < 10 (có thể chấp nhận < k’ < 20) 1.3.3 HỆ SỐ CHỌN LỌC Hệ số chọn lọc α biểu mức độ tách hai đỉnh Trị số yêu cầu: 1,05 < α < 2,00 1.3.4 HIỆU LỰC CỦA CỘT Hiệu lực cột biểu thị qua đại lượng sau: - Số đĩa lý thuyết N (theoretical plate) Trong đó, N: số đĩa lý thuyết biểu kiến tR: thời gian lưu W: chiều rộng pic đáy pic W1/2: chiều rộng pic đo chiều cao Hình 2.6 Mô tả cách xác định N Số đĩa lý thuyết lớn, hiệu lực cột cao Trị số tối ưu là: Trong đó, L: chiều dài cột (cm) dp: đường kính hạt pha tĩnh (µm) - Chiều cao đương lượng đĩa lý thuyết HETP Trong đó, L: chiều dài cột N: số đĩa lý thuyết HETP nhỏ, hiệu lực cột cao, thường 0,03 - mm 1.3.5 ĐỘ PHÂN GIẢI Trong tR1, tR2: thời gian lưu hai đỉnh Wb1, Wb2: chiều rộng đỉnh đỉnh Ta có: • Rs = 0,75: hai pic khơng tách tốt, xen phủ nhiều • Rs = 1,0: hai pic tách tốt, xen phủ 4% • Rs = 1,5: hai pic tách hoàn toàn (chỉ xen phủ 0,3%) Rs nên lớn 1,5 Ngoài ra, hệ số phân giải tính theo cơng thức sau Vì thế, đeể tăng Rs, dùng cách sau:  Tăng N: cách dùng cột dài pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ (khả thi hơn) Cũng giảm tốc độ pha động  Tăng kB’: cách thay đổi thành phần pha động k ’B tăng tăng thời gian phân tích Để dung hòa Rs thời gian rửa giải cần < k’B < 10  Tăng α: cách thay đổi loại pha tĩnh thành phần pha động, kể pH Việc tăng α có ảnh hưởng mạnh tới Rs 1.3.6 HỆ SỐ BẤT ĐỐI XỨNG Hệ số bất đối xứng As thường dùng để đánh giá cân đối đỉnh Trong đó, W1/20: độ rộng đỉnh 1/20 chiều cao f: khoảng cách từ đường cao đỉnh đến chân trước đỉnh 1/20 chiều cao Trị số chấp nhận: 0,8 < As < 1,5 1.4 ỨNG DỤNG 1.4.1 ĐỊNH TÍNH Phân tích định tính HPLC thực gồm cách, dựa vào đặc tính quan trọng thời gian lưu tR hợp chất 1.4.1.1 Dựa vào liệu lưu - So sánh trực tiếp thời gian lưu tR Sắc ký mẫu thử mẫu chuẩn điều kiện Sau đó, so sánh thời gian lưu mẫu thử mẫu chuẩn Phụ thuộc vào sẵn có tính xác chất chuẩn - So sánh thời gian lưu từ tài liệu tham khảo Dựa vào tài liệu, so sánh với thời gian lưu mẫu thử, trường hợp khó khăn chất chuẩn Tuy nhiên, cần thực điều kiện sắc ký giống mơ tả tài liệu Bên cạnh đó, cần dựa vào thông tin khác kèm theo phổ UV, IR… để kết luận xác 1.4.1.2 Phân tích định tính chất thu từ HPLC quy mơ phân tích Trong trường hợp định tính dựa vào thời gian lưu thực hay liệu thiếu chắn Thực nhiều cách: kiểm tra chéo phương pháp sắc ký, sử dụng nhiều detector khác nhau, hay kỹ thuật hỗ trợ khác phản ứng màu, phân tích nguyên tố, huỳnh quang… 1.4.1.3 Phân tích phổ nghiệm on-line đỉnh thu từ HPLC So sánh phổ tương ứng đỉnh HPLC cần xác định với phổ chất chuẩn 1.4.2 ĐỊNH LƯỢNG 11 Nguyên tắc chung: dựa so sánh chiều cao diện tích pic mẫu thử với hay nhiều chất chuẩn • Pic hẹp đối xứng: đo chiều cao diện tích pic • Pic tù hay lệch phương: đo diện tích pic 1.4.2.1 Phương pháp qui 100% diện tích pic - Trường hợp khơng có chất chuẩn - Phương pháp yêu cầu cấu tử hỗn hợp phải rửa giải, phát tách hoàn toàn Sự đáp ứng đầu dò cấu tử Trong đó, % X: giá trị % cấu tử X hỗn hợp X, Y, Z AX, AY, AZ: diện tích pic cấu tử X, Y, Z - Áp dụng để xác độ tinh khiết hoạt chất định lượng gần hợp chất tự nhiên có độ tinh khiết cao 2.4.2.2 Phương pháp dùng chuẩn ngoại Chuẩn ngoại điểm Xác định chiều cao hay diện tích pic chất thử, tính nồng độ chất thử dựa vào nồng độ chiều cao hay diện tích biết chất chuẩn hay Trong hX, SX, CX: chiều cao, diện tích, nồng độ chất thử hO, SO, CO: chiều cao, diện tích, nồng độ chất chuẩn Chuẩn ngoại nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn) • Pha dung dịch có nồng độ khác • Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn • Thiết lập phương trình hồi qui vẽ đường biễu diễn phụ thuộc chiều cao hay diện tích pic theo nồng độ • Tiến hành sắc ký mẫu thử • Dựa vào phương trinh hồi qui suy nồng độ mẫu thử 12 1.4.2.3 Phương pháp chuẩn nội Nhằm giảm sai số đạt độ lặp lại cao phương pháp định lượng HPLC, chất chuẩn thứ hai, gọi nội chuẩn thêm vào chất chuẩn ngoại mẫu thử Yêu cầu chuẩn nội: • Có cấu trúc gần giống với chất cần định lượng • Pic chất chuẩn nội phải tách khỏi pic thành phần khác • Thời gian lưu chuẩn nội phải gần thời gian lưu chất phân tích • Nồng độ thêm vào cho chiều cao hay diện tích đỉnh tương tự với chất cần phân tích Do độ nhạy phát của chuẩn nội chất phân tích thường khác nhau, nên cần xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs chuẩn ngoại chuẩn nội dung dịch chuẩn tinh khiết Trong Si, Ci: diện tích đỉnh, nồng độ dung dịch chuẩn nội Ss, Cs: diện tích đỉnh, nồng độ dung dịch chuẩn ngoại Nồng độ mẫu thử tính theo cơng thức Sx, Cx: diện tích đỉnh, nồng độ dung dịch mẫu thử 1.4.2.4 Phương pháp thêm chuẩn Phương pháp thực cách thêm lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử, áp dụng có ảnh hưởng chất phụ Khi thêm ∆C mẫu chuẩn, làm tăng ∆S diện tích Do đó, nồng độ Cx mẫu thử có diện tích đỉnh Sx tính theo công thức sau 1.4.3 HPLC ĐIỀU CHẾ Một ứng dụng khác HPLC phân lập chất tinh khiết, gọi HPLC điều chế Về nguyên tắc, HPLC điều chế chia sẻ nguyên lý HPLC phân tích Điểm khác biệt hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều để phân tích nhiều mẫu chất tách khỏi cột thu lại để có chất tinh khiết 13 Cột dùng cho qui mô điều chế thường cột thép không gỉ chịu lực đến 300 bar, với đường kính - 200 cm chứa đến hàng trăm kg pha tĩnh So với sắc ký cột cổ điển, HPLC có chi phí cao nên thường sử dụng trường hợp không tách phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) Trình tự áp dụng việc thực HPLC điều chế: • Chọn hệ thống HPLC phù hợp: Sắc ký lớp mỏng thường bước khảo đầu quan trọng việc thăm dò điều kiện cho hệ thống sắc ký Nếu thu kết tốt, với Rf chất thường phải ≤ 0,3 áp dụng điều kiện sắc ký TLC thăm dò vận dụng vào HPLC • Áp dụng điều kiện TLC vào hệ thống HPLC phân tích thành cơng • Nếu kết HPLC thăm dò tốt, tối ưu hóa thơng số phân tích HPLC phân tích • Từ kết HPLC phân tích thu được, xác định điều kiện thông số áp dụng cho HPLC điều chế cách dùng chiến lược mở rộng cỡ mẫu (scale-up strategy) 1.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Các đặc tính thực hành tiêu biểu phương pháp phân tích gồm • Độ (accuracy) • Độ xác (precision)  Độ lặp lại (repeatability)  Độ xác trung gian (intermediate precision)  Độ lại (reproducibility) hay độ ổn định (ruggedness) • Tính đặc hiệu (specificity) hay tính chọn lọc (selectivity) • Giới hạn phát (limit of detection, LOD) • Giới hạn định lượng (limit of quantitation, LOQ) • Tính tuyến tính (linearity) hay miền giá trị (range) • Độ bền (robustness) Tiến hành thẩm định quy trình phân tích chưa có Dược điển quy trình có Dược điển có thay đổi Bên cạnh đó, quy trình phân tích có Dược điển phương pháp phân tích tắc hiệp hội 14 hóa học giới (AOAC International) khơng cần thẩm định phải xác định tính tương thích hệ thống Các yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích trình bày theo bảng Theo USP 32 Quy trình phân tích / Yếu tố thẩm định Độ Độ xác Tính đặc hiệu Giới hạn phát Giới hạn định lượng Tính tuyến tính Miền giá trị Loại II Định lượng + + + + + + Loại I + + + + + Thử giới hạn + + + + Loại III Loại IV * + * * * * * + - +: tiêu thường thẩm định - : tiêu không cần thẩm định *: Yêu cầu tùy thử nghiệm Trong Loại I: Định lượng nguyên liệu hay thành phần thuốc Loại II: Xác định tạp chất nguyên liệu hay sản phẩm phân hủy thuốc Loại III: Định lượng hoạt chất phóng thích Loại IV: Định tính Theo ICH 2005 Quy trình phân tích / - Loại II Định lượng + Thử giới hạn - Độ lặp lại - + - + Độ xác trung gian - +3 - +3 + - + + -1 + + + + + - + + + + Yếu tố thẩm định Độ Độ xác Độ lại Tính đặc hiệu2 Giới hạn phát Giới hạn định lượng Tính tuyến tính Miền giá trị Loại I Loại III + 1: yếu tố cần thẩm định số trường hợp 2: trường hợp không thực phải thay quy trình phân tích hỗ trợ khác 3: trường hợp xác định độ lại khơng cần xác định độ xác trung gian 1.6 XÁC ĐỊNH TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG 15 Thử nghiệm dựa sở tất thiết bị, dụng cụ, vận hành hệ thống, mẫu phân tích…cấu thành nên hệ thống hồn chỉnh q trình phân tích, phải đánh giá tương thích trước tiến hành phân tích để đảm bảo tồn hệ thống có hiệu phù hợp Các phận cấu thành hệ thống sắc ký phải có khả đáp ứng độ xác tiến hành phép thử tính tương thích hệ thống Tiến hành:  Xác định giá trị độ lặp lại thông số sắc ký hệ thống tiến hành sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử với lần tiêm mẫu liên tiếp  Xử lý thống kê số liệu giá trị thu được: XTB, SD, RSD  Trừ có dẫn riêng chuyên luận Dược điển khác, RSD max cho lần tiêm lặp lại 2,0% Yêu cầu áp dụng cho phép thử định lượng 16 ... Sx tính theo cơng thức sau 1.4.3 HPLC ĐIỀU CHẾ Một ứng dụng khác HPLC phân lập chất tinh khiết, gọi HPLC điều chế Về nguyên tắc, HPLC điều chế chia sẻ nguyên lý HPLC phân tích Điểm khác biệt hệ... thăm dò vận dụng vào HPLC • Áp dụng điều kiện TLC vào hệ thống HPLC phân tích thành cơng • Nếu kết HPLC thăm dò tốt, tối ưu hóa thơng số phân tích HPLC phân tích • Từ kết HPLC phân tích thu được,... nước: màng lọc RC (regenerated cellulose), polyamid hay nylon • Dung mơi hữu cơ: màng lọc teflon Đối với HPLC pha thường, dung môi thường không phân cực, HPLC pha đảo, dung mơi thường hỗn hợp nước