Tách và định lượng đồng thời một số phẩm màu trong thực phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG NCS VŨ THỊ TRANG Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trung, NCS Vũ Thị Trang giao đề tài, dẫn tận tình tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình làm luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, PGS TS Lê Thị Hồng Hảo tạo điều kiện, giúp tơi hồn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn tới anh chi trongg̣ Khoa chất lượng phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm - Viêṇ Kiểm nghiêṃ an toàn vê g̣sinh thưcg̣ phẩm Quốc gia đa quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện cho hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đinh̀ , bạn bè bên cạnh chia sẻkhókhăn, đôngg̣ viên vàgiúp đỡtôi hocg̣ tâpg̣ sống Do thời gian thưcg̣ hiêṇ đềtài có hạn nên không tránh những thiếu s ót, mong nhâṇ đươcg̣ ýkiến đóng góp của thầy cô vàcác baṇ để luận văn hoàn thiện Hà Nội, Ngày 30 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hải Yến DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC Association Community CAC Codex Alime GMP Good Manuf HPLC HPTLC JECFA High high pe liquidchroma High perform chromatogra Joint FAO/W Food Additiv LC- Liquid chrom MS/MS spectrometry LOD Limit of dete LOQ Limit of qua MS Mass spectro NP-HPLC RP-HPLC Normal phas liquidchroma Revesed pha liquidchroma R(%) Recovery SPE Solid phase e SD Standard De S/N Signal to noi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo của Tartrazine 10 Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của Amaranth 10 Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo của Indigocarmin 11 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ponceau 4R 12 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo của Sunset Yellow 12 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo của Allura red 13 Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo của Fast green 14 Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Camoisine 15 Hình 1.9 Cơng thức cấu tạo của Erythrosine 15 Hình 1.10 Cơng thức cấu tạo của Brillant Blue 16 Hình 2.1 Quy trình phân tích số phẩm màu 27 Hình 3.1: Hình dạng phổ hấp thụ của phẩm màu sử dụng detector PDA 30 Hình 3.2 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột X-Brigde C18 31 Hình 3.3 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột IntertSustain C 18 .32 Hình 3.4 Sắc đồ chuẩn 10 phẩm màu phân tích cột Symmetry C18 33 Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – ACN 37 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.05 M – MeOH 39 Hình 3.7 Sắc ký đồ HPLC chế độ gradient thử nghiệm với hệ dung môi NaH2PO4 0.01 M – MeOH 41 Hình 3.8 Ảnh hưởng của dung mơi loại béo đến độ thu hồi của phẩm màu .44 Hình 3.9 Ảnh hưởng của dung mơi chiết mẫu đến độ thu hồi của phẩm màu 45 Hình 3.10 Ảnh hưởng của pH trình chiết mẫu 46 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ trình chiết mẫu 47 Hình 3.12 Quy trình chiết mẫu xác định số phẩm màu thực phẩm 48 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Phân nhóm, chức công nghệ qui định của chất phụ gia TP Bảng 1.2 Phân loại chất phụ gia theo khoảng số INS Bảng 1.3 Chỉ tiêu hàm lượng phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 18 Bảng 3.1 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.05 M – ACN 36 Bảng 3.2 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 36 Bảng 3.3 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.05 M – MeOH 38 Bảng 3.4 Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 38 Bảng 3.5 Các gradient thử nghiệm với pha động NaH2PO4 0.01 M – MeOH 40 Bảng 3.6: Thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ đối xứng pic (AS) của fast green, camoisine, erythrosine ứng với chế độ gradient 40 Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính đường chuẩn của tartrazine 49 Bảng 3.8 Khoảng tuyến tính đường chuẩn của amaranth 50 Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn của 10 phẩm màu 53 Bảng 3.10 Giới hạn phát giới hạn định lượng của chất phân tích 54 Bảng 3.11 Độ lặp lại của phẩm màu mẫu bánh 55 Bảng 3.12 Độ lặp lại của phẩm màu mẫu thạch 56 Bảng 3.13 Độ thu hồi của phương pháp với 10 phẩm màu mẫu bánh 58 Bảng 3.14 Độ thu hồi của phương pháp với 10 phẩm màu mẫu thạch 60 Bảng 3.15 Kết phân tích số mẫu bánh, kẹo, thạch 62 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phụ gia thực phẩm 1.1.1 Phụ gia thực phẩm ? 1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 1.1.3 Vai trò của loại phụ gia thực phẩm 1.1.4 Ảnh hưởng của phụ gia thực phẩm đến sức khỏe người .7 1.2 Giới thiệu phẩm màu thực phẩm 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại phẩm màu thực phẩm 1.2.3 Hiện trạng sử dụng phẩm màu thực phẩm 1.3 Tổng quan số phẩm màu thường sử dụng thực phẩm .9 1.3.2 Chỉ tiêu hàm lượng phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 17 1.4 Các phương pháp xác định phẩm màu 19 1.4.1 Phương pháp định tính xác định phẩm màu không phép sử dụng 19 1.4.2 Phương pháp xác định phẩm màu phép sử dụng thực phẩm 19 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Thiết bị 25 2.2.3 Dụng cụ 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tối ưu điều kiện xác định phẩm màu tổng hợp hệ thống HPLC 29 3.1.1 Lựa chọn detector 29 3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 30 3.1.3 Tối ưu thành phần pha động 34 3.1.4 Lựa chọn thể tích bơm mẫu 41 3.2 Tối ưu quy trình xử lý mẫu 43 3.2.1 Tối ưu dung môi loại chất béo 43 3.2.2 Tối ưu dung môi chiết mẫu 44 3.2.3 Tối ưu pH chiết mẫu 46 3.2.4 Tối ưu nhiệt độ chiết mẫu 46 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 49 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đường chuẩn 49 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 53 3.3.3 Độ lặp lại của phương pháp 54 3.3.4 Độ thu hồi của phương pháp 57 3.4 Kết phân tích mẫu thực 62 KẾT LUẬN 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm việc bảo đảm để thực phẩm không gây hại đến sức khỏe, tính mạng người [5] An toàn thực phẩm vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt, tiếp cận sử dụng với thực phẩm an toàn trở thành quyền người Hiện nay, với phát triển của khoa học công nghệ đưa vào khâu sản xuất giúp tăng suất trồng vật nuôi cải thiện đời sống người.Trước đây, trình sản xuất, chế biến thực phẩm người biết cho thêm số chất vào thực phẩm để bảo quản, nâng cao chất lượng làm tăng tính hấp dẫn của thực phẩm ướp muối, trộn thính, nhuộm màu thức ăn loại lá, củ, quả, hạt… chất thêm vào gọi phụ gia thực phẩm Phẩm màu thực phẩm số những nhóm phụ gia thực phẩm sử dụng phổ biến Chúng bổ sung vào thực phẩm với mục đích tạo cho sản phẩm có màu sắc đẹp, tăng tính hấp dẫn người tiêu dùng, hồn tồn khơng có giá trị mặt dinh dưỡng [5] Những thức ăn có chứa phẩm màu danh mục phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm của Bộ Y tế, mức giới hạn dư lượng cho phép khơng gây ảnh hưởng độc hại cho sức khoẻ người tiêu dùng.Tuy nhiên, sử dụng phụ gia thực phẩm, chất hỗ trợ chế biến thực phẩm thời hạn sử dụng, danh mục phép sử dụng danh mục phép sử dụng vượt giới hạn cho phép, sử dụng hóa chất không rõ nguồn gốc, hóa chất bị cấm sử dụng hoạt động sản xuất, kinh doanh thực phẩm có hại đến sức khoẻ, có thể gây ngộ độc cấp tính, hậu sử dụng lâu dài tích luỹ cao có thể gây ung thư [5] Vì việc xác định hàm lượng loại phẩm màu thực phẩm có mặt loại thực phẩm vấn đề vô cùng cấp thiết Đây lí chúng tơi chọn đề tài: “Tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao( HPLC)” nhằm mục tiêu: Xây dựng phương pháp tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm Áp dụng phương pháp để tách định lượng số phẩm màu số mẫu thực phẩm CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phụ gia thực phẩm 1.1.1 Phụ gia thực phẩm ? [5] Phụ gia thực phẩm chất chủ định đưa vào thực phẩm trình sản xuất, có không có giá trị dinh dưỡng, nhằm giữ cải thiện đặc tính của thực phẩm 1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 1.1.2.1 Phân loại theo nhóm chức Các phụ gia thực phẩm có thể phân chia thành vài nhóm, mặc dù có số phần chồng lẫn giữa thể loại này.[11] Bảng 1.1: Phân nhóm, chức công nghệ qui định chất phụ gia TP TT Tên nhóm Chất điều vị Chất làm ẩm Chất tạo xốp Chất chống đông vón Chất giữ màu Chất chống oxy hoá Chất chống tạo bọt Chất tổng hợp Chất làm rắn Monolithic C18 Column by High Performance Liquid Chromatography”, Journal of Food and Drug Analysis, 16(5), pp 77-82 [26] Roger Wood, Lucy Foster, Andrew Damant and Pauline Key (2004), Analytical methods for food additives, Published by Woodhead Publishing Limited, Abington Hall, Abington Cambridge CB1 6AH, England [27] a b Simone Pereira Alves , Daniel Mares Brum , Édira Castello Branco de Andrade a, , , Annibal Duarte Pereira Nettob, c, (2008), “Determination of synthetic dyes in selected foodstuffs by high performance liquid chromatography with UV-DAD detection”, Food Chemistry, 107(1), pp 489–496 [28] Stefania Bonan, Giorgio Fedrizzi, Simonetta Menotta, Caprai Elisabetta(2013), “Simultaneous determination of synthetic dyes in foodstuffs and beverages by highperformance liquid chromatography coupled with diode-array detector”, Dyes and Pigments, 99(1), pp 36–40 , [29] N Yoshioka , K Ichihashi(2008), “Determination of 40 synthetic food colors in drinks and candies by high-performance liquid chromatography using a short column with photodiode array detection”, Talanta, 74(5), pp 1408–1413 67 PHỤ LỤC Phụ lục A: Quy định AOAC độ lặp lại độ thu hồi Phụ lục A1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác TT Hàm lƣợng % 10 Phụ lục A2 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC TT Hàm lƣợng (%) 10 Phụ lục B Sắc đồ lâpp̣ đƣờng chuẩn ởcác nồng đô p̣khác cuphẩmm̉a màu thực -100 0.0 mAU 1250 484nm,4nm (1.00) 1000 750 500 250 0.0 2.5 mAU 4000 640nm,4nm (1.00) 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -500 0.0 2.5 mAU 484nm,4nm (1.00) 300 250 200 150 100 50 -50 0.0 2.5 mAU 800 (1.00) 700 600 500 400 300 200 100 640nm,4nm 2.5 Ama/6.354/1200927 Tartarine/5.218/908931 Tartarine/5.156/4496868 phẩm bƣớc sóng 484nm 640nm 5.0 5.0 Hình B2: Hỡn hơpp̣ 10 chất pha loãng 10 lần mAU 175 484n m,4nm (1.00) 150 Tartarine/5.261/453239 100 75 50 25 Ama/6.366/596948 125 5.0 -25 0.0 2.5 mAU 400,4nm (1.00) 640nm 350 300 250 200 150 5.0 Hình B3: Hỡn hơpp̣ 10 chất pha loang 20 lần 100 50 -50 mAU 484nm4nm (1.00) 125 100 75 5.0 50 25 0.0 2.5 mAU 640nm4nm (1.00) 300 250 200 5.0 150 Hình B4: Hỡn hơpp̣ 10 chất pha loãng 50 lần 100 50 0.0 2.5 Ama/6.400/475519 2.5 Tartarine/5.322/360976 0.0 mAU 484nm,4nm (1.00) 60 50 20 10 /7.145/29200 30 Ama/6.399/237940 Tartarine/5.335/176732 40 -10 0.0 2.5 150 5.0 mAU 640nm,4nm (1.00) 125 Indigo carnin/7.145/256426 100 75 50 25 5.0 Hình B5: Hỡn hơpp̣ 10 chất pha loãng 100 lần Phụ lục C Sắc đồ chuẩn phẩm màu thực phẩm bƣớc sóng 484nm 640nm mAU 1250 484nm,4nm (1.00) 1000 750 500 250 Ama/6.452/6005810 Tartarine/5.156/4496868 -25 0.0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -500 Phụ lục D Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn phẩm màu 1.13 0.57 ChiÒu cao 2.83 pic mAU.s 5.66 0.28 Nång ®é indigocarmin (ppm) Bảng D1: Khoảng tuyến tính đường chuẩn indigocarmin Nồng độ ban đầu (µg/mL) 4.68 2.34 1.17 0.47 0.23 Bảng D2: Khoảng tuyến tính đường chuẩn ponceau 4R Nồng độ ban đầu (µg/mL) 4.29 2.14 0.86 0.43 Nång ®é Suns 0.21 13582 Bảng D3: Khoảng tuyến tính đường chuẩn sunset yellow 200 pic mAU.s 150 ChiÒu cao 100 50 Nång ®é Allura red (ppm) Bảng D4: Khoảng tuyến tính đường chuẩn allurared 1.02 0.51 đầu 0.25 0.1 500 ChiÒu cao pic mAu.s 400 300 200 100 Nång ®é Fast green (ppm) Bảng D5: Khoảng tuyến tính đường chuẩn fast green Nồng độ ban u (àg/mL) 4.90 2.45 1.23 0.49 0.25 Nồng độ Camoisine (ppm) 0.12 Bảng D6: Khoảng tuyến Nồng độ ban u (àg/mL) 5.66 2.83 1.13 0.57 Nồng độ erythrosine (ppm) 0.28 Bảng D7: Khoảng tu Nồng độ ban đầu (µg/mL) 5.01 2.51 1.25 Nå 0.17 43 Bảng D8: Khoảng tuyến tính đường chuẩn Brillant blue Phụ lục E Sắc đồ khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mAU 0.0 484nm,4nm (1.00) 2.0 1.5 1.0 0.5 -0.5 0.0 mAU 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 0.0 mAU 484nm4nm (1.00) 3.0 2.5 2.0 1.5 -1 1.0 0.0 2.5 0.5 0.0 -0.5 0.0 mAU 640nm4nm (1.00) 2.5 Tartarine/4.788/4411 Hình E1 Nền mẫu bánh 5.0 5.0 Hình E2 Nền mẫu thạch Phụ lục F Sắc đồ khảo sát độ thu hồi phƣơng pháp mAU 484nm,4nm (1.00) 1 0.0 2.5 mAU 7.5 640nm,4nm (1.00) 5.0 2.5 0.0 0.0 2.5 mAU 484nm,4nm (1.00) 0.0 2.5 mAU 640nm,4nm (1.00) 5.0 2.5 0.0 0.0 2.5 Indigo carnin/6.493/13136 5.0 5.0 Hình F2 Nền mẫu thạch ponceau 4R/7.665/19526 /6.497/1523 Tartarine/5.058/8902Ama/5.750/11019 Indigo carnin/6.987/17559 5.0 5.0 /6.991/1763 Ama/6.231/18473 Tartarine/4.805/19595 ... ? ?Tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao( HPLC)” nhằm mục tiêu: Xây dựng phương pháp tách định lượng đồng thời số phẩm màu thực phẩm Áp dụng phương pháp. .. - NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TÁCH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ PHẨM MÀU TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC... phương pháp để tách định lượng số phẩm màu số mẫu thực phẩm CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan phụ gia thực phẩm 1.1.1 Phụ gia thực phẩm ? [5] Phụ gia thực phẩm chất chủ định đưa vào thực phẩm q trình