Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG Mục tiêu học tập Trình bày sơ đồ máy HPLC vai trò phận Trình bày nguyên tắc hoạt động detector UV-VIS Phân biệt loại pha tĩnh silicagel thường dùng HPLC đặc tính chúng Phân biệt sắc kí lỏng phân bố pha thuận pha đảo Trình bày cách tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng 1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu cao: Bình đựng dm Cột sắc kí Hệ thống tiêm mẫu Bơm Thải 1.1.1 Hệ thống cấp pha động: Bình thuỷ tinh chứa hỗn hợp 2-3 dung môi Loại bỏ bọt khí: - Lọc qua màng lọc 0,45 µm Chạy siêu âm, sục khí trơ heli * Chương trình dung môi (Gradient): Thay đổi tỷ lệ thành phần MP nhờ trộn Hỗn hợp MP dung môi đựng bình khác Thay đổi tốc độ dòng pha động nhờ bơm 10 1.1.2 Hệ thống bơm: - Bơm cao áp phận để đẩy pha động từ bình chứa dung môi qua cột áp suất cao (250-500 at) - Có thể chịu áp suất cao không bị dung môi ăn mòn 14 1.1.3 Hệ tiêm mẫu: Dung dịch mẫu phân tích tiêm thẳng vào pha động xilanh qua van tiêm có vòng chứa mẫu Sample loop có dung tích khác nhau: 0,50 ÷ 20 µL 16 Nguyên lí hoạt động van tiêm mẫu Tiêm mẫu Lọ thải 17 18 Autosampler Auto sampler chứa nhiều mẫu tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí theo chương trinh chọn 19 B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Pha tĩnh-Pha đảo Pha tĩnh bình thường LC (Stationary Phases for Reversed-Phase LC) (Stationary Phases for Normal LC)  Gốc R C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) C18 (n-octyldecyl)  Pha động H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol)   Các cấu tử phân cực bị rửa nhanh nhất, tăng độ phân cực pha động làm tăng thời gian chạy mẫu Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…  Các cấu tử không phân cực bị rửa nhanh nhất, tăng độ phân cực pha động giảm thời gian chạy mẫu B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ảnh hưởng chất pha tĩnh đến chất lượng tách Pha đảo B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý HPLC B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu dung môi  Áp suất bơm: vài trăm atm (∼6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min-1 với E Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile Non-polar Solvents N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane Lựa chọn pha động pha tĩnh Chủ yếu dựa vào phân cực cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) cấu tử cần phân tích pha tĩnh tương đương pha động có độ phân cực sai biệt Khi độ phân cực cấu tử pha tĩnh giống nhau: thương tác mạnh cấu tử cần phân tích pha tĩnh ⇒ thời gian phân tích kéo dài B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Tính chất số loại dung môi sử dụng HPLC B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection Systems) Sử dụng valve cổng Nạp mẫu qua vòng lấy mẫu (sampling loops) ⇒ Sắc ký lỏng đại Có thể thay thể sampling loops từ µl đến 500 µl Sai số lượng mẫu nạp 1% B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Cột sắc ký HPLC  Click to edit Master text styles Second level Thông thường: L = 10 – 30 cm nối tiếp cột hoăc nhiều Third level ID = – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 10µm Fourth level Fifth level 40.000 – 60.000 đĩa/m cột  Cột tốc độ cao hiệu L = - cm nối tiếp cột hoăc nhiều ID = – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: µ m 100.000 đĩa/m cột Cột bảo vệ (Guard Column) Được lắp đặt trước cột phân tách để kéo dài tuổi thọ cột Thành phần = thành phần cột phân tách cỡ hạt lớn để giảm tổn thất áp suất B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ổn định nhiệt độ cột (Column Thermostats)  Phần lớn ứng dụng cua HPLC thực nhiệt độ phòng  Tuy chất lượng sắc ký đồ tốt trì nhiệt độ cột không thay đổi (sai số < 0,05°C)  Thiết bị HPLC đại trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ gần 150°C với sai số < 0,05°C  Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế xác nhiệt độ B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Đầu dò (Detector) dùng cho HPLC Không nhạy có khả phân tích đa dạng detector GC Thường gặp Detector UV-Vis LOC: Limit Of Detection Mass LOD = concentration (mol/L) x inj vol (L) x FW (g/mol) B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) UV-Vis and Fluorescence Detector Electrochemical Detector λ = 200-400nm λ sử dụng 254 nm Amperometric detection = fixed potential and measure the current response B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Refractive Index Detector B Sắc ký lỏng hiệu cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các phương pháp nâng cao độ phân giải HPLC  Tăng chiều dài cột (Increase column length)  Giảm đường kính cột (Decrease column diameter)  Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate)  Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng (Uniform stationary phase (packing))  Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size)  Lựa chọn pha tĩnh (Select proper stationary phase)  Lựa chon pha động tinh khiết (Select proper mobile phase)  Sử dụng áp suất ổn định (Use proper pressure)  Thành phần pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution) So sánh HPLC GC (Comparison of HPLC and GLC) Các đặc điểm chung:  Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi  Thể tich mẫu nhỏ  Có thể không phá hủy mẫu (nondestructive of sample)  Định lượng dễ dàng Ưu điểm HPLC  Áp dụng với mẫu không bay không bền nhiệt  Áp dụng cho ion vô Ưu điểm GC  Thiết bị đơn giản rẻ  Nhanh chóng  Dễ dàng kết nối với phổ khối ... Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao HPLC kỹ thuật tách chất phân tích khỏi chúng di chuyển theo pha động qua cột chứa hạt pha tĩnh Chất PT F1 Pha tĩnh F2 Pha động 49 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao B... Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu cao A A A B B B B B A B A B B B B B B A B B A B B B B B B B B B B A B B B A A B B B A A B B B A A B B A A B B A B A B B A A A A 51 1.2 Các kiểu sắc ký lỏng hiệu cao Hâp... kí lỏng phân bố pha thuận pha đảo Trình bày cách tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng 1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu cao: Bình đựng dm Cột sắc kí Hệ thống tiêm mẫu Bơm Thải 1.1.1 Hệ thống cấp pha động: Bình