Chương 2 sắc kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Silicagen có đặc tính đặc biệt : xốp, bề mặt gồ ghề, có những hạt mao quản nên diện tích bề mặt lớn -Trên bề mặt của Silicagen có các nhóm silanol có thể tham gia liên kết với chất phân

Chương 2: SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

2.1 Khái niệm

2.1.1 Lịch sử phát triển

• Ph ng pháp này ra i t n m 1967-1968 trên c s phát tri n và c i ti n t ph ng pháp ươ đờ ừ ă ơ ở ể ả ế ừ ươ

s c k c t c i n ắ ý ộ ổ đ ể

• Hi n nay ph ng pháp HPLC ngày càng phát tri n và hi n ệ ươ ể ệ đạ i hoá cao nh s phát tri n ờ ự ể

nhanh chóng c a ngành ch t o máy phân tích ủ ế ạ

• 2.1.2 Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký.

Chất Phân Tích

Pha Tĩnh (Silicagen)

Pha Động (Hexan,metanol, )

Fc

• 2.1.2 Các Lực Liên Kết Trong Hệ Sắc Ký.

• Châu cho up video Principles of Chromatography.mp4 rồi giải thích Đây là phần ví dụ

• 2.1.3 Các lực liên kết trong sắc ký

• Lực phân tử

• Lực van-de-van( lực phân tán)

• Lực tương tác đặc biệt

• 2.1.4 Qúa trính sắc ký và định nghĩa

• 2.1.4.1 Qúa trình sắc ký

Châu phần này châu cho mở video CHROMATOGRAPHY- Technique for separating mixtur … mp4 lên nha hảo up vào mà nó ko ok

• 2.1.4 Qúa trính sắc ký và định nghĩa

• 2.1.4.2 Định nghĩa

+ Nhồi bằng các hạt có kích thước < 10µm (pha tĩnh).

+ Dùng bơm cao áp có áp suất gần 300 atm với tốc độ dòng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ.

+ Hiệu suất tách không cao

+ Áp suất cao gần 300 atm + Chiều dài cột nhỏ (525cm ) + Kích thước hạt nhồi cột < 10

+ Hiệu suất tách cao

Sắc ký thường Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2.1.5 Phân Loại.

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).

• Sắc ký phân bố (partition chromatography).

+ SKPT (normal phase chromatography)

+ sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).

• Sắc ký ion (ion chromatography).

• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

2.2 Các kĩ thuật trong phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao:

- Sắc kí lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp ( kĩ thuật) như: sắc kí lỏng pha lien kết, sắc kí lỏng – rắn, sắc kí trao đổi ion, sắc kí cặp ion…

-Trong đó có 2 kĩ thuật chính, đó là:

+Sắc kí lỏng pha liên kết

+Sắc kí trao đổi ion

2.2.1 Sắc kí lỏng pha liên kết:

2.2.1.1 Pha tĩnh

- Pha tĩnh được gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất cơ- siloxan Silicagen có đặc tính đặc biệt : xốp, bề mặt gồ ghề, có những hạt mao quản nên diện tích bề mặt lớn

-Trên bề mặt của Silicagen có các nhóm silanol có thể tham gia liên kết với chất phân tích nên nó dung để tách sắc kí

- Khi silicagen gắn với nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl

và pha động là dung môi phân cực như H2O, methanol, acetonitril thì có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược)

- Đối với hỗn hợp phân tích thì pha động có thành phần là hỗn hợp các dung môi;

* Các điều kiện thỏa mãn của pha động:

Trơ với pha tĩnh;

Hòa tan được mẫu phân tích;

Bền trong thời gian chạy sắc kí;

Có độ tinh khiết cao;

Phù hợp với detector

2.2.1.3.Ứng dụng:

-Phân tích các mẫu trong nông nghiệp;-Các mẫu sản phẩm trong công nghiệp;-Các mẫu từ các bệnh viện;

-Mẫu phân tích trong dược phẩm

2.2.2 Sắc kí trao đổi ion

- Ionit được sử dụng là Ionit thiên nhiên ( có đặc điểm: dung lượng trao đổi thấp,

độ lặp lại kém) và ionit tổng hợp( có đặc điểm: dung lượng trao đổi cao, độ bền lí học và hóa học tốt, độ lặp lại của phép tách sắc kí tốt)

Cationit axit yếu

Tùy vào bậc amin đưa vào phản ứng mà có anionit bazo mạnh – yếu khác nhau

Nhựa tạo phức

2.2.2.2 Phân loại ionit

Ionit loại 1: là ionit thể hiện tính chất như axit mạnh hoặc bazo mạnh

Đặc điểm:

 Có thể làm việc ở mọi giá trị pH

 Dung lượng hấp thu ít thay đổi theo pH

 Là ionit đơn chức ( -SO3H )

Ionit loại 2: : là ionit thể hiện tính chất như một axit yếu hoặc bazo yếu

Đặc điểm:

 Làm việc ở một giá trị pH xác định

 Dung lượng hấp thụ ít thay đổi theo pH

 Thường đơn chức

Ionit loại 3: là ionit thể hiện tính chất như axit mạnh và axit yếu hoặc bazo mạnh và

bazo yếu

Đặc điểm: Là ionit đa chức, có 2 giá trị hấp dung

 Với cacionit có cả -SO 3H, -COOH, -OH làm việc ở pH cao, khi pH thấp chỉ có -SO 3H làm việc

 Với anionit, ở pH cao amin bậc 4 -N+(R)3OH làm việc ở pH thấp, tất cả các amin bậc 1, 2, 3, 4 đều làm việc

Ionit loại 4: : là ionit thể hiện tính chất như một hỗn hợp nhiều axit yếu có Ka khác

nhau hoặc bazo yếu có Kb khác nhau, vì vậy hấp dung của ionit thay đổi lien tục

• 2.3 Sơ đồ thiết bị sắc kí lỏng hiệu nâng cao:

3 phần chính: Đầu vào – Tách – Phát hiện và xử lý số liệu

• 2.3.1 Pha động:

-Cột được làm bằng thủy tinh trung tính, có nắp đậy thích hợp để tránh bay hơi dung môi.

- Lọc loại hạt tạp chất: dung môi khi pha thường có lẫn tạp chất→ gây nghẽn cột→ loại bỏ bằng cách qua một màng mỏng thích hợp.

- Bộ phận khử khí dung môi: Đuổi khí hòa tan trong bình dung môi hoặc trên dòng chảy của pha động trước khi bơm

- Có thể dung kết hợp hỗn hợp dung môi để rửa giải (gradient).

2.3.2 Hệ thống bơm cao áp:

Dung để hút pha động từ bình chứa dung môi và đẩy chúng qua cột sắc ký.

-Yêu cầu:

+ Tạo áp suất cao: khoảng 250-500 at

+ Lưu lượng bơm khoảng 0.1-10 ml/phút

+ Bơm không bị ăn mòn bởi nhiều loại dung môi

Trong phân tích hay dùng bơm tốc độ hằng định

-Bơm cơ:

+ Kiểu syringe đẩy dung môi liên tục,

+ Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên

2.3.3 Hệ tiêm mẫu ( bơm mẫu):

- Đưa mẫu vào cột, không làm xáo trộn chất nhồi trong cột

- Có thể dùng syringe tiêm qua một tấm đệm đàn hồi

- Trong phương pháp tiêm dòng dừng, người ta dùng bơm và dùng syringe tiêm mẫu

- Phương pháp phổ biến là dùng một van tiêm có vòng chứa mẫu với dung tích xác định và chính xác

- Van tiêm có hai vị trí để nạp mẫu và bơm mẫu

(a)Tiêm mẫu vào vòng mẫu (b) pha động đẩy mẫu vào cột

2.3.4 Lọc tiền cột ( cột bảo vệ)

-Gắn đầu cột chính phân tích

-Được nhồi chất hấp phụ giống cột chính nhưng kích thước lớn hơn

⇒Hấp phụ, giữ lại tạp chất trong mẫu phân tích hoặc pha động

mm) Loại cột này có hiệu lực cao, số đĩa lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1 m cột

• - Chất nhồi thường là silicagen, có thể dùng nhôm ôxyt, polyme xốp, chất trao đổi ion

2.3.6 Detector

-Trong HPLC có hai loại detector:

+ Loại theo dõi tính chất của pha động : dựa vào tính hóa học hoặc vật lý của pha động có liên quan đến chất phân tích.

+ Loại theo dõi tính chất của chất phân tích : dựa vào phản ứng đặc trưng của chất phân tích.

- Hai detector thường dùng là

+ Detector quang phổ hấp thụ phân tử;

+ Detector đo độ dẫn

*Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký -Hệ số phân bố:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

CM : nồng độ cấu tử trong pha động

- Thời gian lưu:

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột.

tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột; đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết.

tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử

- Hệ số dung lượng k’:

-Hiệu năng

hay

Với : W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)

W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

- Độ phân giải:

2.5 ứng dụng

- Định tính ( dựa vào thời gian lưu)

+ Thời gian này được tính từ thời điểm mẫu được bơm đến thời điểm sắc ký đồ hiển thị độ cao, cao điểm tối đa cho hợp chất gọi là thời gian lưu,hay thời gian thực hiện cho một hợp chất đặc biệt đi qua các cột được phát hiện giữ của nó.

Các hợp chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau

• 2.5 Ứng Dụng

• Đối với một hợp chất đặc biệt, thời gian lưu giữ sẽ khác nhau tùy thuộc vào:

+Áp lực được sử dụng (bởi vì điều đó ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy của dung môi)

+Tính chất của pha tĩnh (không chỉ về vật chất nó được làm bằng, nhưng cũng có kích thước hạt) +Thành phần chính xác của dung môi

+Nhiệt độ của cột

 Điều đó có nghĩa các điều kiện phải được kiểm soát cẩn thận nếu sử dụng thời gian lưu giữ như

là một cách xác định các hợp chất.

+ Sắc kí lỏng dựa trên hiện tượng: dưới cùng một điều kiện, mỗi cấu tử trong một hỗn hợp tương tác với môi trường xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác.

Khi được sử dụng như một công cụ phân tích, LC có thể xác định các cấu tử trong một

hỗn hợp và lượng của chúng trong mẫu Khi kết hợp với những kỹ thuật phân tích khác

thì có thể nhận diện định tính các cấu tử trong mẫu.

SLIDE hao ko bjk để làm gì thấy dư đó

2.5 Ứng Dụng

Định lượng dựa vào chiều cao và diện tích pic ( phương pháp chuẩn nội, chuẩn ngoại)

 Phương pháp chuẩn nội

Tiêu chuẩn chọn chất chuẩn nội:

+ Tinh khiết.

+ Có cấu trúc hóa học tương tự với chất phân tích;

+ Không có mặt trong mẫu;

+ Thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích;

+ Có nồng độ tương tự.

a Chuẩn hóa đơn giản (bao gồm6 bước)

1 Chuẩn bị 2 mẫu chuẩn: DD1: chất nội chuẩn; DD2: chất phân tích;

2 Phân tích 2 mẫu chuẩn (chạy mẫu)

3 Tính toán hệ số đáp ứng (Response Factor)

SIS, CIS: Diện tích, nồng độ của chất nội chuẩn;

SXS , CxS: Diện tích, nồng độ chuẩn của chất phân tích.

4 Thêm chất chuẩn nội có nồng độ biết trước vào mẫu thật;

5 Phân tích mẫu thật và chất chuẩn nội (ở bước 4);

6 Tính toán nồng độ chất cần phân tích:

b Chuẩn hóa nhiều mức

1 Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn chứa nồng độ chất phân tích khác nhau (biết trước) và nồng độ chất chuẩn nội như nhau

2 Phân tích dãy mẫu chuẩn.

3 Thiết lập đường chuẩn.

4 Thêm một nồng độ tương tự chất chuẩn nội vào mẫu phân tích.

5 Phân tích mẫu thật.

6 Tính toán nồng độ của dung dịch phân tích bằng phương pháp nội suy.

 Phương pháp chuẩn ngoại

Điều kiện thực hiện:

- Điều kiện sắc ký không thay đổi;

- Thể tích mẫu không đổi

a Chuẩn hóa đơn giản

Đo mật độ quang của dung dịch phân tích Dx

Thêm 1 lượng chất chuẩn a vào dung dịch phân tích, đo mật độ quang Dx+a Từ các giá trị đo được ta xác định nồng độ của mẫu Cx

b Chuẩn hóa nhiều mức

Hoàn toàn tương tự như phương pháp đường chuẩn.

- Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tăng dần nhất định C1, C2, C3 Của chất chuẩn phân tích

- Đo mật độ quang D1, D2, D3 Của các dung dịch chuẩn tại bước sóng cực đại đã khảo sát

- Xây dựng đường chuẩn D = f(C)

- Chuẩn bị mẫu trong điều kiện tương tự, đo mật độ quang Dx

- Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ Cx