Kỹ thuật nhân giống vô tính invitro

1.Thế nào là nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô? Nhân giống vô tính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới dựa theo sinh sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới từ tế bào, mô, cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.  Nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô là quá trình sản xuất một lượng lơn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận cơ quan của cây trồng như: chồi, mắt ngủ, vảy củ, thân lá… của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

Chủ đề: Kĩ thuật nhân giống vô tính invitro 1.Thế nhân giống vô tính trồng nuôi cấy mô? Nhân giống vô tính phương pháp nhân lên tạo thể dựa theo sinh sản vô tính, nghĩa phương pháp tạo nhân lên tạo thể từ tế bào, mô, quan thể bố mẹ Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù chung cho tất loại nguyên liệu nuôi cấy thực vật hoàn toàn vi sinh vật môi trường nhân tạo, điều kiện vô trùng  Nhân giống vô tính trồng nuôi cấy mô trình sản xuất lượng lơn hoàn chỉnh từ phận quan trồng như: chồi, mắt ngủ, vảy củ, thân lá… mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro 2.Ưu nhược điểm nhân giống invitro Page 2.1 Ưu điểm vi nhân giống - Đưa sản phẩm nhanh hơn: Từ ưu việt tạo quần thể có độ đồng cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù dị hợp mặt di truyền - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ vòng 1-2 năm tạo thành hàng triệu - Sản phẩm giống đồng nhất: Vi nhân giống công nghệ nhân dòng Nó tạo quần thể có độ cao dù xuất phát từ mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp - Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ tạo đơn vị diện tích lớn nhiều so với sản xuất đồng ruộng nhà kính theo phương pháp truyền thống - Nâng cao chất lượng giống: Nuôi cấy mô phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi giống nhiễm bệnh Cây giống bệnh tạo cấy mô thường tăng suất 15 - 30% so với giống gốc - Khả tiếp thị sản phẩm tốt nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác tạo từ hệ thống vi nhân giống in vitro (trong ống nghiệm) bầu đất Các giống bán dạng cây, củ bi thân củ - Lợi vận chuyển: Các kích thước nhỏ vận chuyển xa dễ dàng thuận lợi, đồng thời tạo điều kiện vô trùng xác nhận bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng qui định vệ sinh thực vật quốc tế - Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất tiến hành vào thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ Page 2.2 Hạn chế vi nhân giống : _ Đòi hỏi có đầu tư trang thiết bị , công nghệ, kĩ thuật chuyên môn _ Chi phí cao nên chưa phổ biến 3.ĐỐI TƯỢNG CỦA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO 1 Hiện kĩ thuật nhân giống vô tính invitro áp dụng để nhân nhanh nhiều loài thực vật phục vụ mục đích khách người nhân giống vô tính invitro mang lại hiệu kinh tế to lớn thực Trong sản xuất loại có nhu cầu thương mại lớn, giá trị kinh tế cao ứng dụng kĩ thuật nhân giống vô tính invitro để nhân nhanh giống tốt, bệnh đáp ứng nhu cầu giống Ví dụ: lương thực,thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cà chua, cà phê, mía) ăn (chuối, dứa, cam, dâu tây), lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai), giống hoa (đồng tiền, cúc, cẩm chướng, hoa ly….) 2 Nhân giống invitro chuối Đặc biệt loại khó nhân giống nhanh phương pháp thông thường mà lại có giá trị kinh tế lớn hoa lan kĩ thuật nhân giống vô tinh invitro Page lựa chọn tối ưu Ở Việt Nam giới số loại lan quý lan hồ điệp, lan hài đỏ (hồng hài), hài áp dụng thành công kĩ thuật để nhân giống cách nhanh chóng Phân viện sinh học Đà Lạt thành công việc nhân giống trồng lan hài đỏ phương pháp gây vết thương trong gieo hạt invitro nhằm kích thích hình thành chồi Lan hài đỏ - loài lan quý Việt Nam Các có kiểu gen quý hiếm, có ý nghĩa di truyền nhân nhanh trì nhân giống vô tính invitro để làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống Các loài thực vật quý hiếm, có nguy tuyệt chủng cao đối tượng cần áp dụng phương pháp nhân giống vô tính invitro để cải thiện số lượng cá thể, tránh nguy bị biến hoàn toàn Ví dụ sưa đỏ, gỗ nghiến Việt Nam 1 Page Cây sưa Công tác nghiên cứu trình sinh lý, sinh hóa hay di truyền thực vật hay vấn đề sinh học khác đòi hỏi số lượng lớn nhân giống vô tính invitro giúp giải hiệu vấn đề 11 Trong lĩnh vực y học dược liệu quý nhân sâm sản xuất nhanh nhờ thu sinh khối callus thể huyền phù Ví dụ sâm Ngọc Linh nhân vô tính trồng thành công Lâm Đồng 12 10 13 a b 14 15 a: Phôi vô tính sâm Ngọc Linh 16 b: Rễ sâm Ngọc Linh Nhiều nơi ứng dụng hệ thống bioreactor nhân giống thành công nhiều loại phôi vô tính thể chồi, cụm chồi củ nhỏ Ở Brasil bioriactor dung tích từ 2-4 lít Nồi vận hành theo nguyên tắc nồi lên men (có thể không dùng cánh khuấy mà dùng bọt khí để thực việc truyền khí truyền nhiệt) Mỗi mẻ thu 4-5 triệu phôi vô tính cà phê Củ siêu bi (microtuber) thị trường quốc tế công nhận dạng khoai tây giống kỷ 21 Củ khoai tây siêu bi có kích thước nhỏ hạt ngô, hoàn toàn bệnh virus công ty Page Microtuber Inc (Mỹ) sản xuất bioreactor đoạn thân khoai tây nhân giống cấy mô 17 18 Bioreactor 19 Ngoài kĩ thuật nhân giống vô tính invitro giúp tạo khối lượng lớn sinh khối tảo nhằm cung cấp sản phẩm cho người gia súc với phục vụ nghiên cứu khoa học tảo Vì tảo có khả sử dụng ánh sáng mặt trời để tổng hợp nên chất dinh dưỡng lượng sinh học cho trình sống Ngày có nhiều sản phẩm ứng dụng từ việc sản xuất sinh khối tảo thu Ví dụ thực phẩm (mỳ sợi vi tảo, bánh mỳ vi tảo, đồ uống vi tảo), dược phẩm tăng cường thể lực, giúp giảm cân, tránh tiểu đường, chống ung thư, bệnh dày, tim mạch hay mỹ phẩm (mặt nạ, kem dưỡng da) 20 21 Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo Page 4.Các bước nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ Trược tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phòng trừ sâu bệnh hiệu truớc lấy mẫu làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trưởng mẫu cấy in vitro Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại khác để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn mô, giai đoạn phát triển cây, quan trọng đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đỉnh chồi hoa cuối đoạn thân, mảnh Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước đưa vào nuôi cấy hoá chất khử trùng để loại bỏ vi sinh vật bám bề mặt mẫu cấy Chọn phương pháp khử trùng đưa lại tỷ lệ sống cao chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp đạt tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng chất: HgCl 0.1% xử lý 5-10 phút, NaOCl Ca(OCl)2 5-7% xử lý 15-20 phút, H2O2, dung dịch Br Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA ), Xytokinin (BA, Kin, 2P ), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích giai đoạn kích thích phát triển hình thái tăng nhanh số lượng chồi đơn vị mẫu cấy thời gian định thông qua đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định tạo phôi vô tính Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù chồi thành nhiều chồi Hệ số 22 Page nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ống nghiệm Vấn đề phải xác định môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu cao Chế độ nuôi cấy thường 25-270C 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 20004000 lux, ánh sáng tím thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss Jaffe, 1969) Tuy nhiên với đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis giai đoạn đầu cần che tối Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh có số lượng chồi lớn chưa hình thành hoàn chỉnh chưa có rễ Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi rễ thành hoàn chỉnh Một số loại phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với phôi vô tính cần cấy chúng môi trường chất điều tiết sinh trưởng môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp phôi phát triển thành hoàn chỉnh Bước 5: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm với tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu: - Cây ống nghiệm đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao 23 - Có giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước - Cần có thời gian huấn luyện (từ 1-2 tuần tuỳ loại cây) để thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh cách đặt bình điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi 24 Phương thức nhân giống in vitro: 5.1 Hoạt hóa chồi nách: Hoạt hóa chồi nách cách hủy đỉnh sinh trưởng Bản chất phương pháp dụng kỹ thuật hủy đỉnh sinh trưởng cưỡng bức, gây ức chế nội tại, kích thích chồi ngủ tiềm ẩn nách lá, đầu rễ, phân hóa thành chồi Page hoạt hóa chồi nách cách phá vỡ tượng ưu nuôi cấy đỉnh chồi đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương pháp hoạt hóa chồi nách diễn theo cách: Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hay chồi nách: xảy nuôi cấy hai mầm thuốc lá, khoai tây, hoa cúc Cách 2.Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh chồi nách: xảy nuôi cấy mầm mía, lúa, 5.2 Tạo chồi bất định: Chồi bất định chồi mọc rừ quan phận khác phôi Ví dụ: chồi hình thành từ mô sẹo Tạo chồi bất định ta thường sử dụng phận như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành…trong trình cần thực trình phản phân hóa trình phân hóa để tế bào hình thành trực tiếp gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo Tạo cụm chồi để tái sinh cách định hướng tế bào mô nuôi cấy thành cụm chồi Mẫu khử trùng tách bỏ chồi nách đỉnh sinh trưởng sau cấy vào bình tam giác có môi trường nuôi dưỡng phù hợp Môi trường thường sử dụng môi trường MS có bổ sung saccarose , arga, chất kích thích sinh trưởng Sau thời gian đỉnh dinh trưởng phát triển tạo nhiều cụm chồi với kích thước khác Nhân nhanh cụm chồi sau phát triển thành nhiều cụm chồi cụm chồi tách để nhân nhanh Các cụm chồi nhỏ 5-10 tách cấy môi trường MS có bổ sung sacharose 3%, arga 9g/lit, chất kích thích sinh trưởng BA 0,5mg/lit GA3 0,1 mg/lit độ PH=5,8 cấy bình tam giác Page Cụm chồi phát triển tốt sau tháng có 4-5 cụm chồi Các chồi cụm phát triển mạnh mẽ cho có màu xanh Khi cảm ứng rễ trụ phôi tùng hệ gene cảm ứng sớm auxin có gen lpea biểu từ 1-5 Sau xử lý naa 10 p lepa2 biểu nhanh chóng, biểu sau 1h xử lý sau 5h biểu sau 24h đạt đến đỉnh cao biểu ngày Nghiên cứu thể đột biến thuốc cho thấy gen hrgpnt3 biểu tính đặc thù thời kỳ cảm ứng rễ bất định Promoter hrgpt3 thể đột biến không bị hoạt hóa auxin nên nồng độ xử lý auxin không gây cảm ứng phát sinh rễ  Gen đặc hiệu phát sinh chồi bất định Phát sinh chồi bất định trước tiên cảm ứng mô sẹo hình thành mô phân sinh đỉnh chồi=> nguyên thủy chồi nách Sự hình thành mô phân sinh đỉnh chồi điều khiển gen định 5.3 Tạo phôi soma Trong trình nghiên cứu in vitro phôi hình thàh từ tế bào soma gọi phôi vô tính Các phôi vô tính phát sinh thành hoàn chỉnh sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Tương tự tạo chồi bất định để tạo phôi vô tính cần thực trình phản phân hóa trình phân hóa để tách tế bào soma hình thành phôi Bước 1: phân hóa tế bào có khả hình thành phôi Trong trình cần môi trường giàu auxin, auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo tế bào phôi, đồng thời kích thích trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào Các tế bào có khả phát sinh tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không bào, tế bào chất đạm đặc, giàu protein ARN thông tin Page 10 Bước 2: phát triển phôi hình thành môi trường ngiên cứu giai đoạn phải nghèo auxin, với nồng độ auxin cao kích thích tạo phôi ức chế trình phân hóa trình phát triển phôi Như với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý quan trọng để có phản hồi thích hợp Nếu nồng độ thấp gây sốc cho phản ứng, nồng độ cao gây ức chế gây độc Hình thức phát sinh trực tiếp: thể phôi phát triển từ mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù tế bào… nói chung phát sinh trực tiếp phôi soma tế bào mẫu nghiên cứu tồn tế bào tiền phôi nuôi cấy tế bào trực tiếp bước vào giai đoạn phát sinh phôi, hình thành thể soma Hình thức phát sinh gián tiếp: thể phôi phát triển từ mô sẹo huyền phù tế bào thông qua phản phân hóa đồng thời cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào định cảm ứng phát sinh phôi chúng phát triển thành phôi soma Sự phát sinh hình thái phôi vô tính Tất phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh chồi rễ hình thành hoàn chỉnh nuôi cấy in vitro Sự phát sinh hình thái phôi vô tính giống với phôi hữu tính, phôi phát triển bình thường trải qua giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình tim, hình ngư lôi hình mầm Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát cụ thể phát sinh phôi phát có pha 0,1,2 nhận thấy giai đoạn đầu trình phát sinh phôi hệ thống nuôi cấy Ở giai đoạn 0, tế bào đơn hình thành cụm tế bào có khả phát sinh phôi( giai đoạn 1) môi trường có auxin.trong suốt giai đoạn tế bào Page 11 hình thành từ tế bào đơn có khả tạo phôi môi trường nuôi cấy khong có auxin, để hình thành cụm tế bào giai đoạn Sau đó, pha xuất cấy chuyển cụm tế bào giai đoạn 1qua môi trường auxin Trong suốt pha cụm tế bào tăng sinh chậm dường không biệt hóa Sau pha phân bào xuất nhanh phần cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành phôi hình cầu Pha nyaf gọi pha Pha tiếp sau pha 3, in vitro phát triển từ phôi hình cầu qua phôi hình tim phôi hình thủy lôi + kiểu phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma bất định: phôi vô tnhs phát triển từ tế bào hay mô sẹo có liên quan mọt số loài thực vật nhiệt đới, phôi bất định tạo trực tiếp từ tế bào đơn bề mặt phôi non gián tiếp từ bề mặt phôi non này.phương pháp sử dụng chương trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn cứu phôi bị chết non lai tạo Sự phát sinh đa phôi vô tính: tượng xảy nuôi cấy noãn non thực vật hạt trần Các khối mô có khả tạo phôi cao cấy truyền sang môi trường phát triển tăng trưởng thành phôi Mô có khả phát triển thành phôi phân biệt với mô không phát triển thành phôi màu trắng phôi hóa đỏ nhuộm acetocarmine Sự phát sinh phôi soma cảm ứng: tượng sư nuôi cấy lỏng tế bào mô sẹo sau mô chịu xử lý đặc biệt đem lại khả cảm ứng tạo phôi Người ta thực nhiều nghiên cứu nhiều loại thực vật điều kiện nuôi cấy khác để qun sát khả tạo thành mô sẹo Page 12 6.Các tồn tại nhân giống trồng nuôi cấy mô + Hạn chế vi nhân giống + Hạn chế chủng loại sản phẩm : điều kiện tất trồng thương phẩm nhân giống nuôi cấy mô + nhiều trồng có giá trị kinh tế quý chưa thể nhân nhaanh phương pháp để đáp ứng nhu cầu thương mại hay bảo quản nguồn gen quý + Chi phí sản xuất cao: đòi hỏi lao động có trình độ định sử dụng thành thạo máy móc thao tác kĩ thuật đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng + giá thành sản phẩm cao so với phương pháp truyền thống nhân giống hạt + Hiện tượng biến dị soma làm thay đổi đặc tính tốt mẹ đời + tỉ lệ biến di thấp giai đoạn đầu sau có dấu hiệu tăng sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng làm cho không đồng mặt nguồn gen + xảy tượng nhiễm mẫu thao tác sai quy trình 7.Nhân giống vô tính hoa đồng tiền Đồng tiền loài hoa có màu sắc đẹp, tươi sáng, đa dạng chủng loại với đầy đủ loại màu từ đỏ, cam, vàng, trắng, phấn hồng, tím có giá trị kinh tế lớn Trên hoa có màu đơn nhiều màu xen kẽ Hoa lớn đai nên thích hợp để tạo thành bó tạo thành hoa lẵng cắm hoa nghệ thuật Ngoài ra, hoa đồng tiền thường trồng chậu để phòng làm việc phòng khách Một ưu điểm hoa đồng tiền lâu tàn, trồng chậu nở thời gian 20 ngày – 30 ngày Đồng tiền loại hoa có sản lượng giá trị cao, điều kiện thích hợp hoa quanh năm, tỷ lệ hoa cắt tỷ lệ hoa thương phẩm thu cao, hình dáng hoa cân đối, hài hòa, có giá trị thẩm mỹ, tươi lâu Đây 10 loại hoa ưa chuộng tiêu thụ nhiều giới Đồng tiền trồng nhiều nước giới Ở Trung Quốc, hoa đồng tiền có tên Phu lang thường dùng trang trí cho xe hoa phòng cưới Việt Nam nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho phát triển nhiều loại hoa, có hoa đồng tiền Kỹ thuật nhân, nuôi hoa đồng tiền thông thường cách tách chiết gieo hạt, nhiên phương pháp có hệ số nhân thấp, không đồng đều, hoa không đảm bảo chất lượng Hiện công nghệ nhân giống đại phương pháp in Page 13 vitro khắc phục nhược điểm đó, từ cá thể nhân nuôi thành vài ngàn đến vài triệu A Qui trình nhân giống hoa đồng tiền phương pháp invitro B Mô tả bước qui trình Tạo nguồn vật liệu khởi đầu Việc tạo nguồn vật liệu ban đầu tốt bước định tới thành công bước thực Vì vậy, để có nguồn mẫu cho trình nuôi cấy mô cần phải lựa chọn cá thể sinh trưởng phát triển tốt từ quần thể lựa chọn từ trước, trồng vào chậu với giá thể trấu hun để hạn chế tỷ lệ nhiễm bệnh đưa vào nuôi cấy Sau ổn định, phát triển bình thường (khoảng từ 2-3 tuần) tiến hành lấy mẫu để nuôi cấy Phần mẫu dùng để thực phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Thời gian lấy mẫu từ 9-10h ngày nắng ráo, độ ẩm không khí không cao thấp Khử trùng tạo mẫu Mẫu lấy cần bóc ngoài, lấy đỉnh sinh trưởng khỏe mạnh, rửa xà phòng vòi nước chảy, rửa lại nước cất đặt vào bình để khử trùng Dùng cồn 70% ngâm mẫu phút để khử trùng sơ bộ, rửa lại mẫu nước cất lần, sau dùng Canxihypocholorid 15% để khử trùng thời gian15 phút, tiếp tục rửa mẫu lần nước cất vô trùng Cuối mẫu đỉnh sinh trưởng hoa đồng tiền Tái sinh cụm chồi Mục đích giai đoạn tái sinh cách định hướng tế bào mô nuôi cấy thành cụm chồi Mẫu khử trùng đưa vào đĩa petri có giấy thấm vô trùng để thấm khô bề mặt mẫu Dùng dao để tách đỉnh sinh trưởng chồi nách có đường kính khoảng 5mm sau cấy vào bình tam giác có môi trường dinh dưỡng phù hợp Môi trường thường sử dụng môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar g/lít, chất kích thích sinh trưởng BA 0,7 mg/lít độ pH= 5,8 Sau tháng đỉnh sinh trưởng phát triển tạo nhiều cụm chồi với kích thước khác Nhân nhanh cụm chồi Sau phát triển thành nhiều cụm chồi chồi cần phải tách để nhân nhanh Các cụm chồi nhỏ có kích thước 5-10mm tách cấy lên môi Page 14 trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar g/lít, chất kích thích sinh trưởng BA 0,5 mg/lít GA3 0,1mg/lit độ pH= 5,8 đặt bình tam giác Cụm chồi phát triển tốt sau tháng đạt từ - chồi/cụm Các chồi, cụm chồi phát triển mạnh cho thấy có màu xanh non, thẳng dài, kích thước từ 30-40mm Duy trì Cây sau cấy lên môi trường nhân giống đạt kích thước 30-40mm cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar g/lít, chất kích thích sinh trưởng BA 0,1 mg/lít GA3 0,3 mg/lit độ pH= 5,8 để trì phát triển Sau tháng phát triển mạnh, có màu xanh non, thẳng có kích thước từ 40-60mm đạt yêu cầu Tạo hoàn chỉnh Cây đưa vườn ươm cần phải kích thước phù hợp, có đầy đủ rễ để phát triển bình thường Do đạt kích thước từ 40-60mm cấy chuyền tiếp sang môi trường trì phát triển tạo rễ MS có bổ sung saccharose 3%, agar g/lít, NAA 0,3 mg/lít, than hoạt tính 2g/lít độ pH= 5,8 Sau tháng môi trường hoa đồng tiền có kích thước 7-10cm, có đầy đủ rễ đảm bảo tiêu chuẩn để đưa vườn ương Đưa vườn ương Sau đạt chiều cao 7-10cm, có đầy đủ rễ để phát triển đất tiến hành tách khỏi bình tam giác, rửa môi trường bám rễ, để nước Dùng khay xốp 80 lỗ, xơ dừa sàng mịn, đổ đầy xơ dừa vào lỗ khay, sau tiến hành cấy vào lỗ khay Khi trồng vào khay ý không để cổ rễ non ngập sâu để tránh tượng thối cổ rễ Giữ ẩm thoáng khí chăm sóc Ẩm độ, nhiệt độ thời gian đầu đồng tiền trồng phải suy trì gần tương tự phòng nuôi cấy mô Trồng nhà kính có lưới che 30% ánh sáng đồng tiền không chịu cường độ ánh sáng trực xạ cao sương muối, mưa nhiều nên phải làm giàn che để hạn chế điều kiện bất lợi Chế độ tưới nước cho giai đoạn đầu ngày tưới lần, sáng tưới trước 9h, chiều tưới sau 4h Tưới bình phun sương, thời gian không nên tưới phân Sau ổn định bám rễ vào xơ dừa bón phân Bón phân NPK 0,5% ( 20-20-15), hai tuần phun lần, phun nên phun vào buổi sáng chiều mát Sau tháng đưa trồng vườn để kinh doanh Page 15 Page 16 ... vi nhân giống : _ Đòi hỏi có đầu tư trang thiết bị , công nghệ, kĩ thuật chuyên môn _ Chi phí cao nên chưa phổ biến 3.ĐỐI TƯỢNG CỦA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO 1 Hiện kĩ thuật nhân giống vô tính. .. truyền nhân nhanh trì nhân giống vô tính invitro để làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống Các loài thực vật quý hiếm, có nguy tuyệt chủng cao đối tượng cần áp dụng phương pháp nhân giống vô tính. .. lai), giống hoa (đồng tiền, cúc, cẩm chướng, hoa ly….) 2 Nhân giống invitro chuối Đặc biệt loại khó nhân giống nhanh phương pháp thông thường mà lại có giá trị kinh tế lớn hoa lan kĩ thuật nhân giống