Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm và có vai trò quan trọng trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn. Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ. Vậy Tế bào trần là gì? Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần như thế nào?

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tiểu luận chủ đề :

KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thị Lý Anh

I, Khái niệm protoplast

II So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn

I KHÁI NIỆM PROTOPLAST, THẾ NÀO LÀ LAI TẾ BÀO SOMA?

Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào.

• Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau sẽ hợp thành một tế bào dung hợp tế bào trần.

• Nếu các tế bào trần có nguồn gốc từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc các

giống, loài, hoặc chi khác nhau dung hợp với nhau hiện tượng dung hợp tế bào soma (lai soma)

Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách:

từ dịch huyền phù tế bào

tế bào mô sẹo

từ mô tươi nguyên trạng như lá

Đặc điểm: Để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5- 10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia

Tại sao phải nuôi cấy tế bào trần

Sự tiếp cận đến MSC nghiên cứu và thao tác trên các thuộc tính của màng tế bào, điều mà không thể thực hiện được khi bị bao phủ bởi vách tế bào

 Do tính sẵn sàng có thể sử dụng tế bào trần cho các phương pháp phá vỡ tế bào

để nhanh chóng thâu nhận các bào quan và các đại phân tử mà không gặp phải sự biến dạng hư hỏng như các phương pháp ly trích thông thường

Do mỗi một tế bào cách ly với tế bào khác trong quần thể tế bào trần và là một hệ thống đơn bào nên có thể thao tác tương tự như quần thể vi sinh vật

Tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một đơn vị thể tích môi trường

có thể rất cao.

Tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một đơn vị thể tích môi trường

có thể rất cao.

Tế bào trần có khả năng tái sinh rất mạnh

Cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.

Cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản.

Cho phép khả năng dung hợp tế bào-gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào

Cho phép khả năng dung hợp tế bào-gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào

II SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VỚI NUÔI CẤY TẾ BÀO VẪN CÒN

THÀNH

Ưu thế

Tồn tại

Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện

Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp

1 Kỹ thuật tách tế bào trần

1. Enzyme xenlulolaza, pectinaza và hemixenluloza để phân giải thành TB và giải phóng các tế

bào trần

2. Sau khi thành TB được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất

thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào,gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất tạo áp suất thẩm thấu như saccrose, manitol

3. Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với

từng đối tượng cây trồng

i Chọn nguyên liệu ii Xử lý gây co nguyên

sinh chất iii Pp tách protoplast

iv Tách và làm sạch protoplast

b, Các bước tiến hành

i Chọn nguyên liệu

ii Xử lý gây co nguyên sinh chất

.Trước khi thành tế bào bị loại bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch gây co nguyên sinh chất

.Các dung dịch thường được sử dụng như: manitol hoặc sorbitol, đường saccarozo 0.2 M

Ex vitro: Từ mô lá non (cần phải khử trùng)

In vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù

iii, Phương pháp tách protoplast

Có 2 phương pháp phân lập protoplast

 phương pháp cơ học: dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng các dao sắc

nhọn và giải phóng các protoplast riêng rẽ Phương pháp này cho hiệu quả thấp

phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp

cơ học, phương pháp này cho phép tách được hàng gram protoplast

iv, Tách và làm sạch protoplast

• Bằng cách lọc và ly tâm

v, Xác định chất lượng của tế bào trần

Quan sát dưới kính hiển vi, các TB có dạng hình cầu thành tế bào đã bị loại bỏ

Để phát hiện thành tế bào cách tốt nhất là dùng calcofluor:

 Calcofluor bám vào các phân tử xenlulozo phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím

 Nếu các tế bào trần đã bị loại cellulose thì hiển vi trường có màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể

Xác định khả năng sống sót của tế bào trần: quan sát dưới kính hiển vi.

Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển đông tròn, trông như các hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống

Một phương pháp khác là kết hợp kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần

2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần

• Thường gồm 2 giai đoạn:

Nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành

TB và phân chia tạo cụm nhỏ TB

Nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành

TB và phân chia tạo cụm nhỏ TB

Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây

Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây

 Trong tối hay trong điều kiện sáng yếu, trong MT lỏng có lắc hay MT bán lỏng.

 Môi trường cần giàu dinh dưỡng và chất phù hợp.

 Nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng với QCK phù hợp, trên

Gđ 1

Gđ 2

3 Kỹ thuật dung hợp tế bào trần

Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài do tác động của nhân tố bên ngoài Sau đó là sự tái tổ chức các màng ban đầu thành một và bao lấy tế bào chất và

2 nhân cha mẹ.

Có 2 loại dung hợp:

Dung hợp đối xứng: dung hợp 2 tế bào trần cùng có nhân ở mức bội thể như nhau

Dung hợp không đối xứng: Tạo ra thể lai tế bào chất hay còn gọi là Cybrid Ở đây chủ yếu là trộn tế bào chất (DNA của ty thể và lạp thể) Một trong hai tế bào trần sẽ bị diệt nhân trước khi dung hợp Kết quả tạo ra các thể heteroplastid

Có 2 phương pháp dung hợp tế bào trần:

i, Dung hợp bằng hóa chất: NaCl, KCl, NaNO3, dextran sunfat, polyvinyl alcohol…

Xử lý với nồng độ Ca2+ cao và pH cao

 Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCl 2, 0,4M 9%(W/w) manitol, pH cao(8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt độ 370C trong 45 phút

 Bằng phương pháp này, Keller và Melchers(1973) đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá

 Xử lý với poliethylen glycol (PEG)

 Thường dùng dung dịch PEG 6000 có nồng độ 20 - 30% (W/v) để xử lý các tế bào trần trong 10 - 30 phút

 Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG có tác dụng làm tăng hiệu quả dung hợp của protoplast

Khi được ngâm vào dd PEG (20÷40% w/v) các protoplast kết dính lại với nhau

Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịchCa2+có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast sẽ dung hợp với nhau

PEG có hai tác dụng:

Cung cấp một cầu nối để Ca có thể liên kết

các bề mặt màng với nhau

Hoặc dẫn đến sự rối loạn tích điện bề mặt

màng trong suốt quá trình rửa giải

ii, dung hợp bằng xung điện

Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn phương pháp dung hợp bằng hóa chất

chuỗi giữa hai thanh điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng của hai

protoplast sát cạnh nhau khiến chúng hòa trộn vào nhau

 Khi đưa dd hỗn hợp tế bào trần vào một điện trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực.

bị vỡ, hai tế bào trần hòa nhập vào nhau- quá trình dung hợp xảy ra

IV Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma

Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn:

 Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, những

tế bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào đưa ra một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành TB

 Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế

bào Do đó, tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể, DNA, Plasmit vào tế bào

 Quần thể tế bào trần có thể xem như một hệ thống tế bào đơn Do vậy các thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột biến và tách dòng quần thể tế bào thực vật

Một số ứng dụng khác

• Sản xuất các dòng bố mẹ phục vụ sản xuất hạt lai

• Sản xuất các hợp chất thứ cấp qua nhân sinh khối tế bào trong môi trường

lỏng(nuôi lắc, nuôi trong bioreactor)

• Công nghệ nuôi cấy tế bào trần ứng dụng cho những cây có giá trị kinh tế cao, nhưng khó nhân giống bằng phương pháp thông thường

• Nhờ kỹ thuật dung hợp người ta có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau, thậm chí

cả các loài thuộc những chi khác nhau

 Phương pháp này có thể tạo ra những cơ thể có nguồn gen khác xa nhau mà lai hữu tính không thực hiện được

 Cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ

 Nhiều cây lai được tạo đã có được năng lực chống cỏ dại hoặc chống nấm bệnh

• Tạo điều kiện thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào: tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực vật…

• Một ứng dụng đầy triển vọng khác của nuôi cấy tế bào trần là vi nhân giống thực vật

V, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

1. Quy trình nuôi cấy protolast từ lá cây của cây thuốc lá

.Nguyên liệu thực vật: lá cây thứ 3 từ trên xuống

Lá là nguồn nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kĩ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất

Phương pháp cơ bản để tách protoplast từ lá cây:

Các bước phân lập protoplast từ lá cây

a) Chuẩn bị môi trường

Dung dịch enzyme tách protoplast:

Tiến hành

Ngày thứ nhất:

Các mẫu lá được lọai bỏ hết gân lá và đặt trên đĩa petri thủy tinh vô trùng Dùng dao cấy băm nhỏ các mảnh lá

Các mảnh lá đã băm nhỏ vào cốc đong vô trùng loại 50 ml bổ sung 10 ml dung

dịch enzyme tách protopast Bọc cóc đong bằng giấy parafilm, ghi nhãn và đặt trong tối qua đêm trên máy lắc ở tốc độ thấp (khoảng 40 vòng/phút)

 Ngày thứ hai

Chuyển dịch protoplast lên lưới lọc vô trùng ( Ø = 65µm) đặt trong cốc loại 50ml

Bổ sung thêm 3ml dung dịch rửa vào cốc chứa các mảnh lá vụn, lắc mạnh, và lọc tiếp trên lưới lọc l Chuyển hỗn hợp protoplast - enzyme vào tube ly tâm loại 15ml và ly tâm 50g trong 10 phút

Loại bỏ phần dịch nổi phía trên, thêm 1ml dung dịch rửa lên trên bề mặt dung dịch tách và protoplast sao cho không làm hòa lẫn hai dung dịch, tốt nhất là tạo thành hai pha, ly tâm 50×g trong 10 phút Các protoplast sống sót sẽ nằm ở trên

bề mặt dung dịch

Hút lớp protoplast màu xanh lục nổi trên tube ly tâm và chuyển nó sang một tube

ly tâm sạch, thêm 10 ml dung dịch rửa và ly tâm lại Protoplast sẽ lắng xuống đáy tube và có dạng viên

 Rửa protoplast them một lần nữa trong 10 ml dung dịch rửa

 Đặt một giọt protoplast lên buồng đếm hồng cầu và ước lượng mật độ protoplast Nuôi cấy protoplast bằng cách pha loãng 50.000 tế bào/ml môi trường nuôi cấy protoplast và chuyển sang một đĩa petri vô trùng Bọc lại, ghi nhãn và nuôi cấy qua đêm trong tối ở 28˚C

 Ngày thứ ba:Chuyển sang nuôi cấy ở ánh sang yếu hoặc bọc một lớp vải thưa dưới đèn huỳnh quang ánh sang trắng, với chu kì chiếu sang 16 giờ, nuôi trong hai ngày.

Ngày thứ năm:Chuyển sang nuôi cấy ở cường độ ánh sang cao hơn trong 2 ngày bằng cách bỏ lớp vải thưa ra

 Ngày thứ bảy: Ta có được kết quả của việc nuôi cấy protoplast, số tế bào phân

chia từ tổng số tế bào ban đầu, trong một mẫu có 100-200 protoplast nuôi cấy Có dấu hiệu của sự nhiễm bản không

Kết luận

 Tóm lại kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có vai trò rất quan trọng và có

triển vọng rất lớn Đặc biệt kỹ thuật dung hợp có thể lai tạo giữa hai loài thực vật khác nhau, thậm chí cả những loài thuộc chi khác nhau, tạo ra sự phong phú về nguồn gen thực vật

Vì vậy, chúng ta cần phát huy những thế mạnh của kỹ thuật này trong ứng dụng chọn tạo giống cây trồng và nhiều các lĩnh vực khác

Cảm ơn cô giáo và các bạn đã chú ý lắng nghe