Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

Nhóm 12MỤC LỤCA, ĐẶT VẤN ĐỀB, NỘI DUNGI, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma?II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành.III, Các kỹ thuật cụ thể1, Kỹ thuật tách tế bào trần2, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần3, Kỹ thuật dung hợp tế bào trầnIV, Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma1. Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn2. Một số ứng dụng khácV, Tồn tại của kỹ thuật protoplastVI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trầnC, KẾT LUẬN1A. ĐẶT VẤN ĐỀCùng với công nghệ gene, thì công nghệ nuôi cấy mô tế bào ngày càng pháttriển và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp. Công nghệ nuôicấy mô có vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng khôngbị nhiễm bệnh, tạo ra các nguồn nguyên liệu di truyền phong phú hay các sảnphẩm chuyển gen mang các đặc tính mong muốn, cho phép mở rộng nguồn gencủa các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính ditruyền ưu việt của cả bố và mẹ. Một trong những kỹ thuật để chứng minh đượcđiều đó là “kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần”Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộngrãi để tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng và chất lượng cao hơn, hoặclà có thêm khả năng kháng bệnh. Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiềulình vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chấtđến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinhvật. Sau đây chúng ta cùng tìm hiểu kỹ hơn về vấn đề này.

Tiểu luận: KỸ THUẬT NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Nhóm 12

MỤC LỤC

A, ĐẶT VẤN ĐỀ

B, NỘI DUNG

I, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma?

II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành III, Các kỹ thuật cụ thể

1, Kỹ thuật tách tế bào trần

2, Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần

3, Kỹ thuật dung hợp tế bào trần

IV, Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma

1 Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn

2 Một số ứng dụng khác

V, Tồn tại của kỹ thuật protoplast

VI, Quy trình cụ thể minh họa việc nuôi cấy và dung hợp tế bào trần

C, KẾT LUẬN

A ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với công nghệ gene, thì công nghệ nuôi cấy mô tế bào ngày càng phát triển và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp Công nghệ nuôi cấy mô có vai trò rất quan trọng trong việc tạo ra các giống cây trồng không

bị nhiễm bệnh, tạo ra các nguồn nguyên liệu di truyền phong phú hay các sản phẩm chuyển gen mang các đặc tính mong muốn, cho phép mở rộng nguồn gen của các loài thực vật, tạo ra các dòng tế bào sản xuất mới mang các đặc tính di truyền ưu việt của cả bố và mẹ Một trong những kỹ thuật để chứng minh được

điều đó là “kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần”

Kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần đã bắt đầu được ứng dụng rộng rãi để tạo ra các cây trồng mới hoặc có sản lượng và chất lượng cao hơn, hoặc

là có thêm khả năng kháng bệnh Tế bào trần được sử dụng rộng rãi trong nhiều lình vực thí nghiệm từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu các phần tử, các bào quan và vi sinh vật Sau đây chúng ta cùng tìm hiểu kỹ hơn về vấn đề này

B NỘI DUNG

I, Protoplast là gì? Thế nào là lai tế bào soma?

v protoplast

Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào, chỉ còn màng sinh chất bao bọc khối tế bào chất và nhân tế bào

Tế bào trần được tách ra từ các mô hoặc các cơ quan khác ở cây như lá, rễ, mô sẹo nuôi cấy in vitro

Tế bào trần có thể được tạo ra bằng nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào, tế

bào mô sẹo hoặc từ mô tươi nguyên trạng như lá qua tác động của các enzyme: Pectinase phân hủy pectin, celluloase phân hủy cellulose, hemicellulase phân hủy hemicellulose

Đặc điểm của tế bào trần là nếu để trên môi trường dinh dưỡng thì sau 5- 10 ngày sẽ tạo vách tế bào và phân chia

v Lai tế bào soma

Khi hai hay nhiều tế bào trần dung hợp với nhau sẽ tạo thành một tế bào, đó gọi là hiện tượng dung hợp tế bào trần

Nếu các tế bào trần có nguồn gốc từ các tế bào soma (tế bào sinh dưỡng) thuộc các giống, loài hoặc chi khác nhau dung hợp với nhau gọi là hiện tượng dung hợp tế bào soma hay lai soma

II, So sánh đặc điểm nuôi cấy tế bào trần với nuôi cấy tế bào vẫn còn thành

So với quy trình nuôi cấy mô tế bào bình thường thì nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu 1 số thay đổi, do bản chất của tế bào trần Các thay đổi thường

liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào

Nuôi cấy tế bào trần có nhiều ưu thế hơn so với nuôi cấy các tế bào vẫn còn thành tế bào:

Ø Ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy và tách tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên một đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bàon/1ml môi trường)

Ø Tế bào trần có khả năng tái sinh rất mạnh,ví dụ tế bào mô thịt lá ở thuốc lá, cải dầu… Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể tạo ra các tế bào biến đổi gen Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh Điều này rất khó thực hiện ở các tế bào vẫn còn thàh

tế bào

Ø Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng biến nạp các gen thuận lợi vào tế bào thực vật mà trước kia thường bị vỏ tế bào ngăn cản

Ø Nuôi cấy tế bào trần cho phép khả năng dung hợp tế bào - gắn hai tế bào trần lại thành một tế bào với hai bộ thông tin di truyền của hai tế bào, tạo nên một thể lai vô tính mà không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh, trực tiếp và áp dụng kĩ thuật chuyển gen ( bơm ADN, hóa thấm, điện thấm…) giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạp cây lai hữu thụ Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp

Ø Tế bào lai thu đực từ dung hợp hai tế bào trần, được tái sinh và phát triển thành một cây lai Quá trình này được thực hiện trên tế bào nên được gọi là lai tế bào và thông qua tế bào soma nên còn gọi là lai soma hay lai vô tính tế

bào Từ phương pháp này để phát sinh ra phương pháp lai xa giữa các loài - điều không thể thực hiện được bằng phương pháp lai hữu tính thông thường

Tuy nhiên quá trình nuôi cấy protoplast còn tồn tại một số trở ngại, đó là:

Ø Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn thiện

Ø Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển chọn các sản phẩm phù hợp

III, Các kỹ thuật cụ thể

v Kỹ thuật tách tế bào trần.

v Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần (2 giai đoạn: tế bào trần tái sinh thành tế bào, hình thành phát sinh cơ quan).

v Kỹ thuật dung hợp tế bào trần.

1 Kỹ thuật tách tế bào trần: Có mức độ thành công phụ thuộc vào bản chất

nguyên liệu ban đầu Phương pháp tách ảnh hưởng lớn đến sức sống của tế bào trần và do đó liên quan đến quá trình nuôi cấy sau này

a- Nguyên tắc: Enzyme xenlulolaza, pectinaza và hemixenluloza để phân

giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần Sau khi thành tế bào được tách

ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào,gây vỡ tế bào chất, bằng việc bổ sung các chất tạo áp suất thẩm thấu như saccrose, manitol…Nồng độ chất tạo áp suất thẩm thấu

và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho thích hợp với từng đối tượng cây trồng

Enzyme Xenllulolaza Enzyme pectinaza

b- Các bước tiến hành:

i Chọn nguyên liệu: nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy tế bào trần phải thu từ

những cây có trạng thái sinh lý tốt

• Nếu nguyên liệu có nguồn gốc ex vitro thì phải từ những cây không

bị xử lý thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ Mô lá non thu được cần phải khử trùng

• In vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù Những lá được tạo ra trong

nuôi cấy in vitro là những vật liệu ban đầu lý tưởng cung cấp môt lượng lớn các tế bào trần khỏe mạnh

ii Xử lý gây co nguyên sinh chất: Trước khi thành tế bào bị loại bỏ, các tế

bào cần được ngâm trong dung dịch với mục đích gây co nguyên sinh chất

Các dung dịch thường được sử dụng như: manitol hoặc sorbitol 12 - 14% (W/ v), đường saccarozo 0.2 M, polyvinyl pyrrolydon 2%(W/v)

Không nên dùng các dung dịch có nồng độ quá thấp có thể dẫn đến những tế bào trân đa nhân do dung hợp tự phát của hai hay nhiều tế bào trần trong quá trình tách chiết

Việc xử dụng nguồn mẫu in vitro sẽ thuận lợi hơn khi các tế bào được nuôi trên môi trường tương tự như nuôi cấy tế bào trầntrước khi xử lý với enzyme, giúp đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu và môi trường các ion trong quá trình tách chiết

iii Các tế bào trần có thể được tách bằng phương pháp cơ học hoặc bằng

phương pháp enzyme

• Phương pháp cơ học, mẫu được cắt hoặc nghiền nhỏ và đưa vào dung dịch gây co nguyên sinh chất, làm cho phần co nguyên sinh chất nhỏ lại Sự

phản co nguyên sinh chất tiếp theo sẽ làm giãn nở và đẩy phần nguyên sinh chất ra khỏi tế bào qua những khe hở

Phương pháp cơ học nhìn chung khá phức tạp và số lượng các tế bào trần có thể tồn tại độc lập là rất ít

• Phương pháp dùng enzyme: được thực hiện từ đầu những năm

1960 Bằng xử lý enzyme có thể thu được một số lượng lớn các tế bào trần

Thường phải dùng cả ba loại enzyme: Xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza

Có hai phương pháp xử lý enzyme:

- Enzyme hỗn hợp dùng cả xellulolaza, hemixelluloza, pectinaza

- Enzyme kế tiếp mẫu lá thực vật được xử lý với pectinaza để làm nới lỏng thành tế bào, tiếp theo cắt bằng enzyme xellulolaza, hemixelluloza

Cả hai phương pháp đều có một số ưu điểm và nhược điểm nhưng phương pháp enzyme hỗn hợp được sử dụng nhiều hơn cả

iv Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm

v Xác định chất lượng của tế bào trần: khi quan sát dưới kính hiển vi, các

tế bào đều có dạng hình cầu, điều này cho thấy thành tế bào đã bị loại

bỏ bởi sự phân cắt của những enzyme Tuy nhiên vẫn còn những mảnh

thành tế bào còn sót lại làm ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu sau này.

Để phát hiện thành tế bào cách tốt nhất là dùng calcofluor Calcofluor sẽ bám vào các phần tử xellulozơ Cho 1 ml dung dịch calcofluor( dung dihj 1% pha trong nước cất) vào 20 ml môi trường chứa tế bào trần Calcoflour sẽ bám vào các phân tử xellulozơ và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang với màu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím Nếu các tế bào trần đã bị loại cellulose thì hiển vi trường có màu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể

Để xác định được khả năng sống sót của tế bào trần có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển đông tròn, trông như các hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống

Ngoài ra còn một số phương pháp khác để kiểm tra sức sống của tế bào dựa vào các đặc tính lý học và sinh lý học liên quan đến tế bào sống

Phần lớn những phương pháp này dựa trên hoạt tính enzyme hoặc tính thấm của màng sinh chất đối với các hóa chất chỉ thị như chất màu thuốc nhuộm Một trong những phương pháp này là sử dụng: fluorescein diacetat (FDA) để kiểm tra

tỷ lệ phần trăm tế bào trần còn sống sau khi tách chiết FDA được dùng ở thể tích 0.8 ml dung dịch( dung dịch 0.05%) với 20 ml môi trường chứa tế bào trần Khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, các tế bào trần còn sống sẽ phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh, những tế bào trần có màng sinh chất bị phá hủy sẽ có màu xẫm hoặc màu tối Quan sát ít nhất 50 tế bào trần và xác định tỷ lệ % các tế bào trần còn sống sau khi tách từ mẫu thực vật

Một phương pháp khác là kết hợp kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh Evan để xác định sức sống của tế bào trần Trộn 2ml dung dịch thuốc nhuộm 1% với 10ml môi trường tách tế bào trần Lấy 0.25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút sau đos quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang Những tế bào còn nguyên vẹn sẽ ngăn không cho thuốc nhuộm xâm nhập vào nguyên sinh chất, ngược lại những tế bào có màng sinh chất bị mất chức năng sẽ bắt màu xanh và chúng không thể sinh trưởng được

2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần: Thường chia làm hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: nuôi cấy để tế bào trần tái sinh thành tế bào và phân chia tạo cụm

nhỏ tế bào: nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện sáng yếu, trong môi trường lỏng

có lắc hay môi trường bán lỏng Môi trường cần giàu dinh dưỡng và chất phù hợp Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng

Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong

điều kiện chiếu sáng với quang chu kì phù hợp, trên môi trường đặc Cần chú ý hàm lượng và tỷ lệ auxin và xytokinin để tái sinh được cây từ callus

3 Kỹ thuật dung hợp tế bào trần

Sơ đồ nguyên tắc dung hợp tế bào trần

Có hai loại dung hợp:

• Dung hợp đối xứng (sysmetric): khi dung hợp 2 tế bào trần cùng có

nhân ở mức bội thể như nhau

Ví dụ: khoai tây (2X) + khoai tây (2X) khoai tây (4X)

• Dung hợp không đối xứng (asyametric): tạo ra thể lai tế bào chất hay

còn gọi là Cybrid Ở đây chủ yếu là trộn tế bào chất để chuyển nạp các vật chất di truyền tế bào chất( AND của ty thể và lạp thể) Một trong hai tế bào trần sẽ bị diệt nhân trước khi dung hợp Kết quả tạo ra các thể heteroplastid

a- Phương pháp dùng hóa chất: có nhiều hóa chất được sử dụng để kích

thích dung hợp tế bào trần thực vật bao gồm: NaCl, KCl, NaNO3, dextran sunfat, polyvinyl alcohol…

ü Xử lý với NaNO 3: đây là phương pháp ra đời sớm nhất và ngay từ năm

1970, hai tác giả Cummins và Cocking đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ đầu rễ của ngô và yến mạch

Để cảm ứng dung hợp, các tế bào trần được xử lý với hỗn hợp dung dịch có 5,5% NaNO3 và 10% saccarozơ, trong 30 phút,ở nhiệt độ 350C Tần số dung hợp theo phương pháp này rất thấp, đặc biệt là những tế bào trần đã bị không hóa mạnh

ü Xử lý với nồng độ Ca 2+ cao và pH cao: Hỗn hợp tế bào trần tách từ thịt

lá được ủ trong môi trường kiềm mạnh có 0,05M CaCl2, 0,4M 9%(W/w) manitol,

pH cao(8-10) và ly tâm nhẹ ở 50g trong 3 phút, tiếp theo đem ủ trong nước ở nhiệt

độ 370C trong 45 phút Bằng phương pháp này, Keller và Melchers(1973) đã dung hợp thành công tế bào trần tách từ mô dậu của 2 dòng thuốc lá Tuy nhiên giá trị

pH cao có thể gây độc cho tế bào trần của một số loài thực vật( Kao và Wetter, 1977)

ü Xử lý với poliethylen glycol (PEG): PEG là một polymer, do đó khối

lượng phân tử phụ thuộc vào các điều kiện phản ứng trùng hợp: PEG 1540 (MW

1300 -1600), PEG 4000 (MW 3000 - 5000), PEG 6000 (MW 6000 - 8000)

Thường dùng dung dịch PEG 6000 có nồng độ 20 - 30% (W/v) để xử lý các tế bào

trần trong 10 - 30 phút.

Theo Wallin và cộng sự (1974), PEG được ứng dụng rộng rãi trong dung hợp tế bào trần thực vật do có đôc tính thấp , đồng thời có tác dụng với hầu hết các kiểu tế bào

Kao và Michayuk (1974) là những tác giả đầu tiên dùng PEG để dung hợp

tế bào trần giữa đỗ tương và thuốc lá, đỗ tương và ngô, nhưng tần số dung hợp thấp Khi sử dụng PEG với nồng độ ion Ca2+ cao (0,05M CaCl2.2H2O) và giá trị

pH cao sẽ cho kết quả tốt hơn dùng PEG riêng rẽ, có thể đạt tới 10-15% Phương pháp này là sự kết hợp giữa phương pháp dùng PEG nguyên thủy của Kao và Michayluk (1974) với phương pháp sử dụng ion Ca2+ và pH cao của Keller và Melcher(1973)

Theo nhiêu tác giả, phương pháp kết hợp được cho là khá hiệu quả trong dung hợp tế bào trần thực vật (Melcher và cộng sự 1978, Hoffman: 1978, 1979)

b- Phương pháp xung điện:

Zimmerman (1982) là người đầu tiên đề xướng phương pháp dung hợp tế bào trần nhờ xung điện Trong phương pháp này sự dung hợp xảy ra khi các tế bào trần được đưa vào điện trường có điện thế cao (500 - 1000V/cm) trong một thời gian phát xung cực ngắn (5 - 6/1000giây)

Nguyên tắc: Các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trường và

tạo chuỗi giữa hai thanh điện cực, dùng xung điện để làm thủng màng của hai protoplast sát cạnh nhau khiến chúng hòa trộn vào nhau

Thiết bị: Máy tạo xung điện, kính hiển vi đảo pha, buồng dung hợp

Tạo điện trường: Đặt trong buồng dung hợp các điện cực platin có khoảng

cách 0,2-1mm và nối với nguồn điện có hiệu điện thế 200V/cm

Tạo xung: U 500 - 1000V/cm ,thời gian cực ngắn 1- 200 miligiây

Hiệu quả dung hợp cao tuy nhiên đầu tư thiết bị lớn

IV Triển vọng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần và lai tế bào soma

1 Triển vọng của phương pháp nuôi cấy và dung hợp tế bào trần là rất lớn.

ü Sau khi loại bỏ thành tế bào và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, những tế bào trần được tái tạo nhanh chóng thành tế bào mới và quá trình phát triển này đưa ra một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu sinh tổng hợp thành tế bào (Willison và Cocking, Grout 1973)

ü Các tế bào trần có khả năng tiếp nhận các vật liệu từ bên ngoài đưa vào trong tế bào Do đó, tế bào trần là đối tượng thích hợp cho các nghiên cứu đưa nhân lạp thể, ti thể, DNA, Plasmit vào tế bào (Dodds và Bengochea 1985)

ü Quần thể tế bào trần có thể xem như một hệ thống tế bào đơn Do vậy các thao tác tương tự như đối với các vi sinh vật qua đó có thể lựa chọn dòng đột biến và tách dòng quần thể tế bào thực vật (Evans và Cocking 1977)

Sự dung hợp tế bào trần nhờ xung điện cao áp