NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN, nuôi cấy mô, lai tế bào, công nghệ sinh học, công nghệ sinh học động vật

NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP NUÔI CẤY VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN TẾ BÀO TRẦN  Mở đầu Mở đầu  I. Nuôi cấy tế bào trần I. Nuôi cấy tế bào trần  1.1. Tách tế bào trần 1.1. Tách tế bào trần  1.2. Phương pháp tách 1.2. Phương pháp tách  II. Các yếu tổ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển II. Các yếu tổ ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển chủa tế bào trần. chủa tế bào trần.  2.1. Môi trường nuôi cấy. 2.1. Môi trường nuôi cấy.  2.2. Điều kiện nuôi cấy. 2.2. Điều kiện nuôi cấy.  2.3. Mật độ nuôi cấy. 2.3. Mật độ nuôi cấy.  2.4. Ứng dụng của tế bào trần. 2.4. Ứng dụng của tế bào trần.  III. Dung hợp tế bào trần. III. Dung hợp tế bào trần.  3.1. Các phương pháp dung hợp. 3.1. Các phương pháp dung hợp.  3.1.1. Dung hợp tự phát (spontaneuouso 3.1.1. Dung hợp tự phát (spontaneuouso fusion). fusion).  3.1.2 Dung hợp cảm ứng (inducd fusion) 3.1.2 Dung hợp cảm ứng (inducd fusion)  3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần. 3.2. Cơ sở tế bào học của dung hợp tế bào trần.  3.3 Lựa chọn sản phẩm dung hợp. 3.3 Lựa chọn sản phẩm dung hợp. Mở đầu Mở đầu Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 Tế bào trần là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lý enzyme. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định xử lý enzyme. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ hướng (vì không còn chịu sự tương quan trong hệ thống thực vật). thống thực vật). Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào Dung hợp tế bào trần là sự hợp nhất của các tế bào sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các sôma không có thành tế bào của các cá thể hoặc các loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào loài khác nhau và sau đó tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp. đã dung hợp. Vì sao lại chọn lai tế bào trần? Vì sao lại chọn lai tế bào trần? Lai hữu tính là phương pháp lai cỏ bản nhất để tạo ra Lai hữu tính là phương pháp lai cỏ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. -Tuy nhiên lai hữu tính chỉ thực hiện được giữa các -Tuy nhiên lai hữu tính chỉ thực hiện được giữa các cá thể trong 1 loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. cá thể trong 1 loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữu các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó Lai giữu các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguần biến dị di dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguần biến dị di truyền cần thiết cho việc cải thiện cây trồng. truyền cần thiết cho việc cải thiện cây trồng. - Nuôi cấy tế bào trần có ích lợi: - Nuôi cấy tế bào trần có ích lợi: + Giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu + Giúp loại trừ tính bất thụ hữu tính, tạo cây lai hữu thụ. thụ. +Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít +Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp, ít tốn kém, nhanh và đòi hỏi phương tiện phức tạp, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp. trực tiếp. + + Bằng thao tác di truyền ở tế bào trần có thể dễ dàng tạo ra các tế bào biến đổi gen. Tế bào với kiểu gen biến đổi sẽ được bảo tồn khi tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh. I. Nuôi cấy tế bào trần I. Nuôi cấy tế bào trần 1.1. Tách tế bào trần 1.1. Tách tế bào trần 1.1.1. Chọn nguyên liệu 1.1.1. Chọn nguyên liệu - Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có - Thường sử dụng mô thịt lá trưởng thành ở những cây có tính trạng sinh lý tốt. Vì lá cây là nguần nguyên liệu thông tính trạng sinh lý tốt. Vì lá cây là nguần nguyên liệu thông dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do dụng và truyền thống cho kỹ thuật protoplast thực vật, do nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương nó cho phép phân lập được một số lớn các tế bào tương đối đồng nhất. C đối đồng nhất. C ũng có thể tách ũng có thể tách tế bào trần t tế bào trần t ừ mô ừ mô sẹo, bao phấn. sẹo, bao phấn. - Lấy lá ở ngoài tự nhiên thì phải từ những cây không bị - Lấy lá ở ngoài tự nhiên thì phải từ những cây không bị xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. xử lý với thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ. - Những lá được tạo ra trong môi trường nuôi cấy invitro - Những lá được tạo ra trong môi trường nuôi cấy invitro là vật liệu lý tưởng cung cấp 1 lượng lớn tế bào khoẻ là vật liệu lý tưởng cung cấp 1 lượng lớn tế bào khoẻ mạnh. mạnh. 1.1.2 Phương pháp tách: 1.1.2 Phương pháp tách: Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần Trước khi thành tế bào bị phá bỏ, các tế bào cần được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm được ngâm trong dung dịch làm ổn định áp suất thẩm thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả thấu và được điều chỉnh cẩn thận liên quan đến khả năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc năng thẩm thấu tế bào. Thường sử dụng mannitol hoặc sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sorbitol 12-14% (W/v) để duy trì tính ổn định màng sinh chất. sinh chất. Có 3 phương pháp tách: Có 3 phương pháp tách: 1.1.2.1. Phương pháp tách bằng cơ học 1.1.2.1. Phương pháp tách bằng cơ học : : Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung Cắt nhỏ nhu mô thịt lá rồi nghiền nhỏ cho vào dung dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại dịch co nguyên sinh nên cả tế bào chất bị co nhỏ lại ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm ngay lập tức cho vào dung dịch phản nguyên sinh, làm giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua giãn nở 1 cách đột ngột đẩy phần nguyên sinh chất qua thành tế bào. Ta thu được tế bào trần. thành tế bào. Ta thu được tế bào trần. +Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản +Ưu điểm: Dụng cụ đơn giản +Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp. +Nhược điểm: Khá phức tạp, hiệu quả thấp. 1.1.2.2.Phương pháp tách bằng enzyme: 1.1.2.2.Phương pháp tách bằng enzyme: Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để Dùng enzym pectinase, hemicelolase, cellulase. Để phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoạc kết hợp phá vỡ thành tế bào có thể dùng riêng lẻ hoạc kết hợp tuỳ vào từng loại tế bào. tuỳ vào từng loại tế bào. - Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần - Ưu điểm: Thu được lượng lớn các tế bào trần -Các bước tiến hành như sau: -Các bước tiến hành như sau: +Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá. +Thu mẫu và vô trùng bề mặt lá. + Ngâm trong dung dịch thẩm thấu phù hợp. + Ngâm trong dung dịch thẩm thấu phù hợp. +Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các +Loại bỏ biểu bì mặt dưới hoặc cắt mẫu lá thành các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các lát mỏng, tạo thuận lợi cho sự xâm nhập của các enzym. enzym. + Xử lý hỗn hợp enzym. + Xử lý hỗn hợp enzym. +Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần. +Tinh sạch và thu nhận các tế bào trần. +Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy +Chuyển tế bào trần vào các môi trường nuôi cấy thích hợp. thích hợp. 1.1.2.3 1.1.2.3 . Phương pháp hỗn hợp: . Phương pháp hỗn hợp: - - Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn Sử dụng phương pháp cơ học để thu được 1 lượng lớn các tế bào tự do sau đó các tế bào tự do sau đó dùng dùng enzyme thường được sử dụng enzyme thường được sử dụng để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo để tách thu được tế bào trần. Thành tế bào cấu tạo gồm gồm cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là cellulose, hemicellulose, pectin và một lượng ít hơn là protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại protein và lipit. Vì vậy cần một lượng hỗn hợp cả 3 loại enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác enzym cellulaza, pectinaza hemicellulaza ở những tỷ lệ khác nhau. nhau. -Một số loại enzym thường dùng: -Một số loại enzym thường dùng: cellulose cellulose hemicellulose hemicellulose Pectinaza Pectinaza Onozuka Onozuka Rhozym HP-150 Rhozym HP-150 Maceraza Maceraza Cellulysin Cellulysin Hemicellulose Hemicellulose Macerozym R-10 Macerozym R-10 Meicelaza Meicelaza Pectolyaza Pectolyaza Driselaza Driselaza 1.1.3. 1.1.3. Xác định chất lượng của tế bào trần Xác định chất lượng của tế bào trần Các tế bào trần đều có dạng hình cầu khi quan sát dưới Các tế bào trần đều có dạng hình cầu khi quan sát dưới kính hiển vi. kính hiển vi. - - Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không? Bước 1: Xác định xem còn thành tế bào hay không? Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân Dùng calcofour để xác định .Calcofour bám vào các phân tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu tử cellulose và gây ra phát ánh sáng huỳnh quang mầu xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. xanh rực rỡ khi soi dưới tia cực tím. Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển Nếu các tế bào đã bị loại bỏ hoàn toàn thành tế bào, hiển vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn vi trường có mầu tối thẫm, các tế bào trần sẽ không nhìn thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ thấy được ngoại trừ sự tự phát ánh sáng huỳnh quang đỏ của các lạp thể. của các lạp thể. - - Bước 2: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần Bước 2: Xác định khả năng sống sót của tế bào trần Bởi vì quy trình tách Bởi vì quy trình tách tế bào trần thường làm tổn thương tế bào trần thường làm tổn thương hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước hoặc làm hỏng một tỷ lệ tế bào nên không thể thiếu bước này. này. Có thể Có thể quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới quan sát trực tiếp huyền phù tế bào trần dưới kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x. kính hiển vi ở vật kính 20x và 40x. Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng Tế bào chất của những tế bào xuất hiện ở dạng dòng chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt chảy hoặc chuyển động tròn, trông như những hạt nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống. nhỏ trong nguyên sinh chất là những tế bào sống. Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng Ngược lại là những tế bào gần như bị chết do màng nguyên sinh chất bị phá huỷ. nguyên sinh chất bị phá huỷ. - - Bước 3: Xác định sức sống của tế bào trần: Bước 3: Xác định sức sống của tế bào trần: +Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với +Dùng kính hiển vi huỳnh quang kết hợp với nhuộm xanh evan. nhuộm xanh evan. Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi Trộn 2 ml dung dịch thuốc nhuộm 1% + 10 ml môi trường tách tế bào trần. trường tách tế bào trần. Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml Lấy 0,25 ml huyền phù tế bào trần và đưa vào 1 ml hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút, hỗn hợp dịch nhuộm trên, để trong 15 phút,