III. Dung hợp tế bào trần và lai tế bào xoma
3.3.Lựa chọn sản phẩm dung hợp
3.3. Lựa chọn sản phẩm dung hợp
-Sau khi dung hợp, quần thể tế bào trần sẽ gồm có các tế -Sau khi dung hợp, quần thể tế bào trần sẽ gồm có các tế bào trần cha mẹ, thể đồng nhân, thể dị nhân và các sản phẩm bào trần cha mẹ, thể đồng nhân, thể dị nhân và các sản phẩm dung hợp đa nhân. Vì vậy phải lựa chọn sản phẩm dung hợp dung hợp đa nhân. Vì vậy phải lựa chọn sản phẩm dung hợp tế bào trần đã được lai 1 cách hoàn thiện cả về tế bào chất và tế bào trần đã được lai 1 cách hoàn thiện cả về tế bào chất và
nhân. nhân.
-Có thể nhận biết sản phẩm dung hợp dựa vào các đặc điểm -Có thể nhận biết sản phẩm dung hợp dựa vào các đặc điểm hình thái, gen đánh dấu, môi trường chọn lọc, dùng tế bào
hình thái, gen đánh dấu, môi trường chọn lọc, dùng tế bào trần từ các loại mô khác nhau hoặc dùng phương pháp
trần từ các loại mô khác nhau hoặc dùng phương pháp nhuộm bằng các chất phát huỳnh quang.
nhuộm bằng các chất phát huỳnh quang.
+Con lai xoma có thể được phân biệt nhờ những khác biệt +Con lai xoma có thể được phân biệt nhờ những khác biệt tự nhiên giữa các dạng cha mẹ.Thường thì sản phẩm dung tự nhiên giữa các dạng cha mẹ.Thường thì sản phẩm dung
VDVD: Khoai tây lai, cây khoai tây dại Solamum chacoense : Khoai tây lai, cây khoai tây dại Solamum chacoense có các tế bào chứa sắc tố anthocyanin màu tím đỏ nhưng có các tế bào chứa sắc tố anthocyanin màu tím đỏ nhưng sinh trưởng rất kém trong môi trường nuôi cấy và không sinh trưởng rất kém trong môi trường nuôi cấy và không
thể tái sinh thành được chồi. Khoai tây trồng Solamum thể tái sinh thành được chồi. Khoai tây trồng Solamum
tuberosum mang các đặc điểm trái ngược, có khả năng tạo tuberosum mang các đặc điểm trái ngược, có khả năng tạo chồi nhanh. Mô sẹo hình thành từ sản phẩm dung hợp sinh chồi nhanh. Mô sẹo hình thành từ sản phẩm dung hợp sinh trưởng mạnh hơn mô sẹo từ các dạng cha mẹ và tạo ra các trưởng mạnh hơn mô sẹo từ các dạng cha mẹ và tạo ra các
chồi màu tím đỏ. chồi màu tím đỏ.
+Các con lai cũng có thể được phát hiện qua môi trường +Các con lai cũng có thể được phát hiện qua môi trường sinh trưởng chọn lọc.
sinh trưởng chọn lọc.
VDVD: 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.langsdoffii đều : 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.langsdoffii đều không có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu
không có khả năng sinh trưởng trên môi trường thiếu
auxin. Nhưng sản phẩm dung hợp tế bào trần của 2 loài lại auxin. Nhưng sản phẩm dung hợp tế bào trần của 2 loài lại
có khả năng tự dưỡng về auxin và sinh trưởng được trên có khả năng tự dưỡng về auxin và sinh trưởng được trên
Sử dụng đột biến sinh hoá và lựa chọn thể lai xoma dựa trên Sử dụng đột biến sinh hoá và lựa chọn thể lai xoma dựa trên sự hình thành các đặc điểm bổ xung.
sự hình thành các đặc điểm bổ xung.
VDVD: Kháng sinh actinomycin D được dùng để phát hiện : Kháng sinh actinomycin D được dùng để phát hiện sản phẩm dung hợp giữa 2 loài thuộc chi Petunia. Các tế bào sản phẩm dung hợp giữa 2 loài thuộc chi Petunia. Các tế bào
nuôi cấy của loài Petunia hybrida không thể sinh trưởng nuôi cấy của loài Petunia hybrida không thể sinh trưởng
được khi có actinomycin D. Ngược lại, những tế bào của loài được khi có actinomycin D. Ngược lại, những tế bào của loài
P.parodii sinh trưởng trên môi trường có actinomycin D P.parodii sinh trưởng trên môi trường có actinomycin D
nhưng không thể tái sinh được cây từ mô sẹo nuôi cấy. nhưng không thể tái sinh được cây từ mô sẹo nuôi cấy.
Những tế bào vừa có thể sinh trưởng khi có kháng sinh vừa Những tế bào vừa có thể sinh trưởng khi có kháng sinh vừa
có khả năng tái sinh thành công là sản phẩm dung hợp của 2 có khả năng tái sinh thành công là sản phẩm dung hợp của 2
dòng tế bào trần cha mẹ. dòng tế bào trần cha mẹ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi không có đặc điểm bổ sung hoặc đột biến rõ rệt, có thể Khi không có đặc điểm bổ sung hoặc đột biến rõ rệt, có thể dùng phương pháp nhuộm hoá chất và nhận biết qua phát
dùng phương pháp nhuộm hoá chất và nhận biết qua phát hiện huỳnh quang. Có 2 loại thuốc nhuộm được sử dụng là hiện huỳnh quang. Có 2 loại thuốc nhuộm được sử dụng là
fluorescein isothiocyanate (FITC) có màu xanh và rhodamine fluorescein isothiocyanate (FITC) có màu xanh và rhodamine isothiocyanate (RITC) có màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển isothiocyanate (RITC) có màu đỏ khi quan sát dưới kính hiển
huỳnh quang. Sản phẩm dung hợp của cả 2 sẽ có màu vàng huỳnh quang. Sản phẩm dung hợp của cả 2 sẽ có màu vàng và có thể tách ra để nuôi cấy trên môi trường thích hợp cho và có thể tách ra để nuôi cấy trên môi trường thích hợp cho
quá trình tạo mô sẹo và tái sinh. quá trình tạo mô sẹo và tái sinh.
3.4. Thí nghiệm dung hợp tế bào trần khoai tây 3.4. Thí nghiệm dung hợp tế bào trần khoai tây 3.4.1 Nguyên liệu và thiết bị
3.4.1 Nguyên liệu và thiết bị _nguyên liệu lá cây khoai tây _nguyên liệu lá cây khoai tây
_ Dầu khoáng thuốc nhuộm FITC và RITC (nồng độ _ Dầu khoáng thuốc nhuộm FITC và RITC (nồng độ
3,0mg/ml, pha trong ethanol). 3,0mg/ml, pha trong ethanol). _ Môi trường PEG.
_ Môi trường PEG.
_ Môi trường rửa có Ca _ Môi trường rửa có Ca2+2+..
_ Môi trường nuôi cấy tế bào trần và sản phẩm dung hợp của _ Môi trường nuôi cấy tế bào trần và sản phẩm dung hợp của
khoai tây. khoai tây.
3.4.2. Tiến hành 3.4.2. Tiến hành
_ Tiến hành tách tế bào trần từ 2 giống khoai tây khác nhau. _ Tiến hành tách tế bào trần từ 2 giống khoai tây khác nhau. Nhuộm quần thể tế bào trần thứ nhất bằng FITC, và quần Nhuộm quần thể tế bào trần thứ nhất bằng FITC, và quần
thể tế bào trần thứ 2 bằng RITC. thể tế bào trần thứ 2 bằng RITC.
_ Lấy 1 giọt nhỏ dầu khoáng vô trùng cho vào giữu đĩa _ Lấy 1 giọt nhỏ dầu khoáng vô trùng cho vào giữu đĩa
petri, đặt 1lamen vô trùng lên trên gi
petri, đặt 1lamen vô trùng lên trên giọt dầu khoáng.ọt dầu khoáng. _
_ Nhỏ từng giọt môi trường PEG và xung quanh các tế bào Nhỏ từng giọt môi trường PEG và xung quanh các tế bào trần (5giọt) và thêm 1 giọt nữa vào giữa quần thể tế bào trần (5giọt) và thêm 1 giọt nữa vào giữa quần thể tế bào
trần. Giữ nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút. trần. Giữ nhiệt độ phòng trong vòng 20-25 phút. _ Thêm môi trường rửa chứa Ca
_ Thêm môi trường rửa chứa Ca2+2+ vào 1 phía của hỗn hợp tế vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần: cứ 3 phút lại thêm từ từ 3 giọt và lặp lại thao tác bào trần: cứ 3 phút lại thêm từ từ 3 giọt và lặp lại thao tác
này trong 20 phút. Trong khi ở phía đối diện dùng pipet này trong 20 phút. Trong khi ở phía đối diện dùng pipet
loại bỏ 3 giọt môi trường chứa PEG và sự kết dính tế bào loại bỏ 3 giọt môi trường chứa PEG và sự kết dính tế bào
_ Cho 3 giọt môi trường nuôi cấy vào 1 phía của hỗn hợp tế _ Cho 3 giọt môi trường nuôi cấy vào 1 phía của hỗn hợp tế bào trần và 1 phía đối diện loại bỏ 1 phần môi trường rửa, bào trần và 1 phía đối diện loại bỏ 1 phần môi trường rửa,
lặp lại thao tác thêm 2 lần nữa. Tiếp tục lấy 1 số giọt môi lặp lại thao tác thêm 2 lần nữa. Tiếp tục lấy 1 số giọt môi trường cho vào phần đĩa xung quanh lamen để duy trì độ trường cho vào phần đĩa xung quanh lamen để duy trì độ
ẩm, sau đó nuôi cấy trong ánh sáng yếu ở nhiệt độ 25 ẩm, sau đó nuôi cấy trong ánh sáng yếu ở nhiệt độ 2500C.C. _ Sau 2-7 ngày nuôi cấy, các tế bào trần cần được kiểm tra _ Sau 2-7 ngày nuôi cấy, các tế bào trần cần được kiểm tra
về sự tái tạo thành tế bào, sự phân bào và tần số dung hợp. về sự tái tạo thành tế bào, sự phân bào và tần số dung hợp.
Khi các tế bào phân chia và hình thành khối mô sẹo đang Khi các tế bào phân chia và hình thành khối mô sẹo đang tăng trưởng, quần thể tế bào nuôi cấy cần được làm loãng tăng trưởng, quần thể tế bào nuôi cấy cần được làm loãng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
bằng môi trường mới với hàm lượng khoáng cao hơn và bằng môi trường mới với hàm lượng khoáng cao hơn và
có 0,6%agar (sau khoảng 2 tuần nuôi cấy) có 0,6%agar (sau khoảng 2 tuần nuôi cấy)
_ Sau hơn 2 tuần nuôi cấy, có thể quan sát thấy cụm mô sẹo. _ Sau hơn 2 tuần nuôi cấy, có thể quan sát thấy cụm mô sẹo.
Chúng có thể khác nhau về hình thái, màu sắc và kích Chúng có thể khác nhau về hình thái, màu sắc và kích thước. Những khối mô sẹo sinh trưởng nhanh hoạc có thước. Những khối mô sẹo sinh trưởng nhanh hoạc có
khác biệt rõ rệt có thể là dấu hiệu của con lai xoma. khác biệt rõ rệt có thể là dấu hiệu của con lai xoma.